CN118275596A - 一种包含三棱、莪术的中药复方的质量控制方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包含三棱、莪术的中药复方的检测方法，该检测方法包括如下步骤：取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息；其中该中药复方包括黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金，该对照品包括色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷。本发明对包含三棱、莪术的中药复方的化学成分进行了全面系统地解析，为质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种包含三棱、莪术的中药复方的质量控制方法及其应用。
背景技术
根据《中华人民共和国中医药法》，古代经典名方是指“至今仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色与优势的古代中医典籍所记载的方剂”。古代经典名方在我国有着历史悠久、丰富的人用历史并应用至今，是历代医家临床实践精华的总结，承载着数千年来中医药灿烂文明的深厚积淀，是中医药理论经过几千年的锤炼，是历代临床经验的总结，是中医药伟大宝库中最精华的部分。对中药经典名方进行深入的研究与开发，是挖掘传统中医药宝库的一把金钥匙。
中药经典名方汤剂作为传统的中医临床用药的最常用的剂型，具有组方合理、起效迅速、疗效显著、易于吸收等优点，深受广大患者的信赖。却因调配、携带、临时煎煮、久置容易发生霉败变质、汤液味苦和量大，以及标准难以统一，严重影响其临床疗效等缺点，不能适应现代人的生活要求。为了保持汤剂的优势，克服汤剂的种种不足，国家药品监督管理局药品审评中心于2021年08月31日发布的《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则(试行)》中明确指出按古代经典名方目录管理的中药复方制剂的质量应与经典名方基准样品的质量基本一致。基准样品代表了制剂的整体内在质量，除了成型工艺外，基准样品与制剂的其余质量控制指标均基本一致。因此基准样品是制剂内在质量的实物对照，是大生产工艺优化及其质量标准制定的参照物。基准样品是经典名方乃至所有中药研发的基准，是保证药物的安全性和有效性的对照物。经典名方复方制剂生产工艺路线制定、参数的优化和质量标准制定要以经典名方基准样品为参照。基准样品是沟通临床-企业-科研的纽带，是传承、应用和发扬传统中医药的基准。
指纹图谱是基于中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。中药指纹图谱能较全面地反映药材所含化学成分的相对关系，体现了中药成分的复杂性和相关性，与中医药的传统理论相适应，能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制，尤其适用于有效成分不完全明确或不需要完全明确的情况下，对中药材及中药产品进行质量控制。中药指纹图谱除能用于考察中药材产地、采收季节、采收部位、炮制加工、储存时间等因素，以提供依据鉴别生产前原料药材的真伪优劣，更可用于中药生产过程的质量控制：追踪制剂中某些化学成分的变化，监测原料药材与成品之间、成品的各批次间质量的一致性及稳定性。与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。
目前，尚未见文献报道对本发明所要求保护的包含三棱、莪术的中药复方的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究，现有技术中，仅对该中药复方中的单一成分进行质量分析，尚无较全面、系统的质量控制方法反映本发明的中药复方及成品中主要基准样品成分的质量状况，无法对其生产过程及产品质量有效控制，不能较好地保证其临床疗效，故需采用能全面控制本发明的中药复方整体质量的指纹图谱的质控方法控制其关键质量。
发明内容
基于此，本发明提供了一种包含三棱、莪术的中药复方的检测方法，该检测方法包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，
该检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～8min，10％A→20％A；8～18min，20％→26％A；18～30min，26％A；30～40min，26％→32％A；40～46min，32％→75％A；46～54min，75％A；54～55min，75％A→10％A；55～65min，10％A；流速为0.2～0.8mL/min，柱温为20～40℃，检测波长190～400nm，进样量为1～10μl；
根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息；
其中该中药复方包括黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金，该对照品包括色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷。
进一步地，该信息为根据所记录的该中药复方供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该中药复方中以下成分中一种或多种的含量：黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金。
进一步地，该中药复方供试品溶液的制备方法包括：称取适量的中药复方溶液，摇匀，过滤，取续滤液，得到该中药复方供试品溶液。
进一步地，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，添加甲醇溶液配制成各个对照品浓度分别为1～400μg/ml，例如1～100μg/ml，例如约50μg/ml的该对照品溶液。
进一步地，该流速为0.3～0.7ml/min，例如0.4～0.6ml/min。
进一步地，该柱温为25～35℃，例如27～33℃。
进一步地，该检测波长为200～280nm，例如260nm。
进一步地，该进样量为2～8μl，例如约5μl。
进一步地，该芒果苷对应的色谱峰的理论塔板数不低于3000。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5。
进一步地，该色谱柱为HALO AQ-C18色谱柱。
进一步地，该色谱柱的规格为：柱长150mm，内径4.6mm，粒径2.7μm。
进一步地，该流动相A为甲醇。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地，该酸水溶液为0.08％～0.12％的酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.08％～0.12％的磷酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.09％～0.11％的磷酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
进一步地，该中药复方溶液的制备方法包括：(a)称取适量的中药复方，置于适当体积的容器中，加水浸泡，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到药渣和第一煎煮液；(b)在该药渣中再次加入水，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到第二煎煮液；以及(c)将该第一煎煮液和该第二煎煮液合并，得到该中药复方溶液。
进一步地，该容器为煎药壶。
进一步地，该容器的体积为2L。
进一步地，在步骤(a)中，该中药复方与该水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.1865。
进一步地，在步骤(b)中，该中药复方与该水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.27975。
进一步地，该浸泡的时间为10～60min，例如约30min。
进一步地，该武火的电压为200～300V，例如约220V。
进一步地，该文火的电压为150～200V，例如约175V。
进一步地，该微沸煎煮的时间为10～60min，例如约30min或约25min。
进一步地，该溶剂为醋。
进一步地，该滤网为120目滤网。
进一步地，在该中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为(1～20):(1～20):(1～10):(10～30)：(10～30):(10～30):(1～20):(1～20):(1～20)。
进一步地，在该中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为约11.19:约11.19:约7.46:约18.65:约14.92:约14.92:约11.19:约11.19:约11.19。
进一步地，该黄芪为生黄芪。
进一步地，该山药为生山药。
进一步地，该鸡内金为生鸡内金。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含三棱、莪术的中药复方的指纹图谱构建方法，该构建方法包括如下步骤：
供试品溶液的制备：称取适量的中药复方溶液，摇匀，过滤，取续滤液，得到该中药复方供试品溶液；其中该中药复方包括黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金。
对照品溶液的制备：称取适量的色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，添加甲醇溶液配制成各个对照品浓度分别为1～400μg/ml的该对照品溶液。
根据高效液相检测该供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱。
高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～8min，10％A→20％A；8～18min，20％→26％A；18～30min，26％A；30～40min，26％→32％A；40～46min，32％→75％A；46～54min，75％A；54～55min，75％A→10％A；55～65min，10％A；流速为0.2～0.8mL/min，柱温为20～40℃，检测波长190～400nm，进样量为1～10μl。
进一步地，该流速为0.3～0.7ml/min，例如0.4～0.6ml/min。
进一步地，该柱温为25～35℃，例如27～33℃。
进一步地，该检测波长为200～280nm，例如260nm。
进一步地，该进样量为2～8μl，例如约5μl。
进一步地，该芒果苷对应的色谱峰的理论塔板数不低于3000。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5。
进一步地，该色谱柱为HALO AQ-C18色谱柱。
进一步地，该色谱柱的规格为：柱长150mm，内径4.6mm，粒径2.7μm。
进一步地，该流动相A为甲醇。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地，该酸水溶液为0.08％～0.12％的酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.08％～0.12％的磷酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.09％～0.11％的磷酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
进一步地，该中药复方溶液的制备方法包括：(a)称取适量的中药复方，置于适当体积的容器中，加水浸泡，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到药渣和第一煎煮液；(b)在该药渣中再次加入水，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到第二煎煮液；以及(c)将该第一煎煮液和该第二煎煮液合并，得到该中药复方溶液。
进一步地，该容器为煎药壶。
进一步地，该容器的体积为2L。
进一步地，在步骤(a)中，该中药复方与该水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.1865。
进一步地，在步骤(b)中，该中药复方与该水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.27975。
进一步地，该浸泡的时间为10～60min，例如约30min。
进一步地，该武火的电压为200～300V，例如约220V。
进一步地，该文火的电压为150～200V，例如约175V。
进一步地，该微沸煎煮的时间为10～60min，例如约30min或约25min。
进一步地，该溶剂为醋。
进一步地，该滤网为120目滤网。
进一步地，在该中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为(1～20):(1～20):(1～10):(10～30)：(10～30):(10～30):(1～20):(1～20):(1～20)。
进一步地，在该中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为约11.19:约11.19:约7.46:约18.65:约14.92:约14.92:约11.19:约11.19:约11.19。
进一步地，该黄芪为生黄芪。
进一步地，该山药为生山药。
进一步地，该鸡内金为生鸡内金。
进一步地，在该检测波长为260nm时，该指纹图谱包括1-16号峰，其中，峰1为山药、知母药味的共有峰，峰2为黄芪、党参、三棱、白术、天花粉药味的共有峰，峰3为知母、莪术、鸡内金、三棱药味的共有峰，峰4归属于党参药味，峰5为莪术、三棱药味的共有峰，峰6为党参、知母药味的共有峰，峰7、10、11、13归属于知母药味，峰8为莪术、三棱药味的共有峰，峰9、15、16归属于莪术药味，峰12归属于鸡内金药味，峰14归属于黄芪药味。
进一步地，在该检测波长为260nm时，1-16号峰的保留时间分别为10.335±10％、11.559±10％、15.667±10％、16.414±10％、19.071±10％、19.953±10％、20.733±10％、25.511±10％、27.028±10％、30.452±10％、31.400±10％、32.377±10％、38.120±10％、41.385±10％、50.559±10％、52.620±10％。
进一步地，在该检测波长为260nm时，该峰2为色氨酸的色谱峰，该峰7为新芒果苷的色谱峰，该峰10为芒果苷的色谱峰，该峰14为毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱峰。
进一步地，该指纹图谱在检测波长260nm下，包括16个特征峰，以10号峰芒果苷的色谱峰为参比峰，其他15个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.34±10％、2号色谱峰0.38±10％、3号色谱峰0.51±10％、4号色谱峰0.54±10％、5号色谱峰0.63±10％、6号色谱峰0.66±10％、7号色谱峰0.68±10％、8号色谱峰0.84±10％、9号色谱峰0.89±10％、11号色谱峰1.03±10％、12号色谱峰1.06±10％、13号色谱峰1.25±10％、14号色谱峰1.36±10％、15号色谱峰1.66±10％、16号峰1.73±10％。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含三棱、莪术的中药复方的质量控制方法，该质量控制方法包括如下步骤：
(1)根据上述指纹图谱构建方法建立中药复方基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药复方供试品溶液，根据上述指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药复方待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的该中药复方待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的该中药复方基准样品标准指纹图谱进行对比，符合要求的则为合格产品，不符合要求的则为不合格产品。
进一步地，该符合要求包括以下的一种或多种：
(1)在该检测波长为260nm时，该中药复方待测样品指纹图谱中呈现出16个特征色谱峰，各特征色谱峰的保留时间在该中药复方基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10％之内；
(2)在该检测波长为260nm时，以芒果苷的色谱峰为S峰，中药复方待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在该中药复方基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；以及
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，该中药复方待测样品指纹图谱与该中药复方基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述检测方法或上述构建方法或上述质量控制方法在包含三棱、莪术的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
本发明的有益效果：
简而言之，本发明提供了一种包含三棱、莪术的中药复方基准样品的指纹图谱测定和质量控制方法，该方法确认了16个共有特征峰，条件简单，分析时间短，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续制剂的质量控制提供了重要的参考依据，确保产品的质量稳定，保障中药复方的疗效，让该中药复方更好地为人类生命健康服务。
具体而言，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱，克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷，可以从整体上、宏观上控制本发明中药复方基准样品的内在质量，保证了药物的疗效，利用现代药物研究的主要手段，实现精品传承经典，使经典名方得到了更为正规的质量控制。
(2)本发明中药复方基准样品中化学成分复杂，要实现其特征峰的分离难度大，本发明在建立起指纹图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。
(3)本发明在建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱过程中，确认了16个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积和相似度进行了研究，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续复方制剂的质量控制提供重要的参考依据和质量参照。
(4)以本发明中药复方基准样品中各有效成分指纹图谱作为一个整体看待，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定本发明中药复方基准样品整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，为完整、准确评价本发明中药复方基准样品的质量提供了新的方法和手段。
(5)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为在梯度1下的供试品色谱图。
图2为在梯度2下的供试品色谱图。
图3为在梯度3下的供试品色谱图。
图4为在梯度4下的供试品色谱图。
图5为在梯度5下的供试品色谱图。
图6为在梯度6下的供试品色谱图。
图7为15批包含三棱、莪术的中药复方基准样品相似度匹配图。其中，R为对照指纹图谱；S1-S15为15批包含三棱、莪术的中药复方基准样品。
图8为15批包含三棱、莪术的中药复方基准样品生成的对照特征图谱。其中，峰2为色氨酸的色谱峰，峰7为新芒果苷的色谱峰，峰10为芒果苷的色谱峰，峰14为毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱峰。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
正如背景技术部分所描述的，尚未见文献报道对本发明所要求保护的包含三棱、莪术的中药组合物的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究。为了解决上述问题，本发明提供了一种包含三棱、莪术的中药复方的检测方法，该检测方法包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，
该检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～8min，10％A→20％A；8～18min，20％→26％A；18～30min，26％A；30～40min，26％→32％A；40～46min，32％→75％A；46～54min，75％A；54～55min，75％A→10％A；55～65min，10％A；流速为0.2～0.8mL/min，柱温为20～40℃，检测波长190～400nm，进样量为1～10μl；
根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息；
其中该中药复方包括黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金，该对照品包括色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷。
在本发明中，时间、流速、柱温、波长、进样量、浓度、比值、电压、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“20～40”时，所描述的范围应被解释为包括范围“20～40”、“20～35”、“20～30”、“20～25”、“25～40”、“25～35”、“25～30”、“30～40”、“30～35”、“35～40”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在一种优选的实施方式中，该信息为根据所记录的该中药复方供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该中药复方中以下成分中一种或多种的含量：黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金。
在一种优选的实施方式中，该中药复方供试品溶液的制备方法包括：称取适量的中药复方溶液，摇匀，过滤，取续滤液，得到该中药复方供试品溶液。
在一种优选的实施方式中，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，添加甲醇溶液配制成各个对照品浓度分别为5～400μg/ml，例如30～100μg/ml，例如约50μg/ml的该对照品溶液。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约50”包括50的±5％，或从47.5到52.5。
在一种优选的实施方式中，该流速为0.3～0.7ml/min，例如0.4～0.6ml/min。
在一种优选的实施方式中，该柱温为25～35℃，例如27～33℃。
在一种优选的实施方式中，该检测波长为200～280nm，例如260nm。
在一种优选的实施方式中，该进样量为2～8μl，例如约5μl。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约5”包括5的±5％，或从4.75到5.25。
在一种优选的实施方式中，该芒果苷对应的色谱峰的理论塔板数不低于3000。
在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5。
在一种优选的实施方式中，该色谱柱为HALO AQ-C18色谱柱。
在一种优选的实施方式中，该色谱柱的规格为：柱长150mm，内径4.6mm，粒径2.7μm。
在一种优选的实施方式中，该流动相A为甲醇。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.08％～0.12％的酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.08％～0.12％的磷酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.09％～0.11％的磷酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1％”包括0.1％的±5％，或0.095％到0.105％。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
在一种优选的实施方式中，该中药复方溶液的制备方法包括：(a)称取适量的中药复方，置于适当体积的容器中，加水浸泡，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到药渣和第一煎煮液；(b)在该药渣中再次加入水，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到第二煎煮液；以及(c)将该第一煎煮液和该第二煎煮液合并，得到该中药复方溶液。
在一种优选的实施方式中，该容器为煎药壶。
在一种优选的实施方式中，该容器的体积为2L。
在一种优选的实施方式中，在步骤(a)中，该中药复方与该水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.1865。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1865”包括0.1865的±5％，或从0.177175到0.195825。
在一种优选的实施方式中，在步骤(b)中，该中药复方与该水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.27975。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.27975”包括0.27975的±5％，或从0.2657625到0.2937375。
在一种优选的实施方式中，该浸泡的时间为10～60min，例如约30min。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5。
在一种优选的实施方式中，该武火的电压为200～300V，例如约220V。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约220”包括220的±5％，或从209到231。
在一种优选的实施方式中，该文火的电压为150～200V，例如约175V。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约175”包括175的±5％，或从166.25到183.75。
在一种优选的实施方式中，该微沸煎煮的时间为10～60min，例如约30min或约25min。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5；“约25”包括25的±5％，或从23.75到26.25。
在一种优选的实施方式中，该溶剂为醋。
在一种优选的实施方式中，该滤网为120目滤网。
在一种优选的实施方式中，在该中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为(1～20):(1～20):(1～10):(10～30)：(10～30):(10～30):(1～20):(1～20):(1～20)。
在一种优选的实施方式中，在该中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为约11.19:约11.19:约7.46:约18.65:约14.92:约14.92:约11.19:约11.19:约11.19。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约11.19”包括11.19的±5％，或从10.6305到11.7495；“约7.46”包括7.46的±5％，或从7.087到7.833；“约18.65”包括18.65的±5％，或从17.7175到19.5825；“约14.92”包括14.92的±5％，或从14.174到15.666。
在一种优选的实施方式中，该黄芪为生黄芪。
在一种优选的实施方式中，该山药为生山药。
在一种优选的实施方式中，该鸡内金为生鸡内金。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含三棱、莪术的中药复方的指纹图谱构建方法，该构建方法包括如下步骤：
供试品溶液的制备：称取适量的中药复方溶液，摇匀，过滤，取续滤液，得到该中药复方供试品溶液；其中该中药复方包括黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金。
对照品溶液的制备：称取适量的色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，添加甲醇溶液配制成各个对照品浓度分别为1～400μg/ml的该对照品溶液。
根据高效液相检测该供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱。
高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～8min，10％A→20％A；8～18min，20％→26％A；18～30min，26％A；30～40min，26％→32％A；40～46min，32％→75％A；46～54min，75％A；54～55min，75％A→10％A；55～65min，10％A；流速为0.2～0.8mL/min，柱温为20～40℃，检测波长190～400nm，进样量为1～10μl。
在一种优选的实施方式中，该流速为0.3～0.7ml/min，例如0.4～0.6ml/min。
在一种优选的实施方式中，该柱温为25～35℃，例如27～33℃。
在一种优选的实施方式中，该检测波长为200～280nm，例如260nm。
在一种优选的实施方式中，该进样量为2～8μl，例如约5μl。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1865”包括0.1865的±5％，或从0.177175到0.195825。
在一种优选的实施方式中，该芒果苷对应的色谱峰的理论塔板数不低于3000。
在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5。
在一种优选的实施方式中，该色谱柱为HALO AQ-C18色谱柱。
在一种优选的实施方式中，该色谱柱的规格为：柱长150mm，内径4.6mm，粒径2.7μm。
在一种优选的实施方式中，该流动相A为甲醇。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.08％～0.12％的酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.08％～0.12％的磷酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.09％～0.11％的磷酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1％”包括0.1％的±5％，或从0.095％到0.105％。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
在一种优选的实施方式中，该中药复方溶液的制备方法包括：(a)称取适量的中药复方，置于适当体积的容器中，加水浸泡，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到药渣和第一煎煮液；(b)在该药渣中再次加入水，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到第二煎煮液；以及(c)将该第一煎煮液和该第二煎煮液合并，得到该中药复方溶液。
在一种优选的实施方式中，该容器为煎药壶。
在一种优选的实施方式中，该容器的体积为2L。
在一种优选的实施方式中，在步骤(a)中，该中药复方与该水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.1865。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1865”包括0.1865的±5％，或从0.177175到0.195825。
在一种优选的实施方式中，在步骤(b)中，该中药复方与该水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.27975。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.27975”包括0.27975的±5％，或从0.2657625到0.2937375。
在一种优选的实施方式中，该浸泡的时间为10～60min，例如约30min。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5。
在一种优选的实施方式中，该武火的电压为200～300V，例如约220V。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约220”包括220的±5％，或从209到231。
在一种优选的实施方式中，该文火的电压为150～200V，例如约175V。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约175”包括175的±5％，或从166.25到183.75。
在一种优选的实施方式中，该微沸煎煮的时间为10～60min，例如约30min或约25min。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5；“约25”包括25的±5％，或从23.75到26.25。
在一种优选的实施方式中，该溶剂为醋。
在一种优选的实施方式中，该滤网为120目滤网。
在一种优选的实施方式中，在该中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为(1～20):(1～20):(1～10):(10～30)：(10～30):(10～30):(1～20):(1～20):(1～20)。
在一种优选的实施方式中，在该中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为约11.19:约11.19:约7.46:约18.65:约14.92:约14.92:约11.19:约11.19:约11.19。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约11.19”包括11.19的±5％，或从10.6305到11.7495；“约7.46”包括7.46的±5％，或从7.087到7.833；“约18.65”包括18.65的±5％，或从17.7175到19.5825；“约14.92”包括14.92的±5％，或从14.174到15.666。
在一种优选的实施方式中，该黄芪为生黄芪。
在一种优选的实施方式中，该山药为生山药。
在一种优选的实施方式中，该鸡内金为生鸡内金。
在一种优选的实施方式中，在该检测波长为260nm时，该指纹图谱包括1-16号峰，其中，峰1为山药、知母药味的共有峰，峰2为黄芪、党参、三棱、白术、天花粉药味的共有峰，峰3为知母、莪术、鸡内金、三棱药味的共有峰，峰4归属于党参药味，峰5为莪术、三棱药味的共有峰，峰6为党参、知母药味的共有峰，峰7、10、11、13归属于知母药味，峰8为莪术、三棱药味的共有峰，峰9、15、16归属于莪术药味，峰12归属于鸡内金药味，峰14归属于黄芪药味。
在一种优选的实施方式中，在该检测波长为260nm时，1-16号峰的保留时间分别为10.335±10％、11.559±10％、15.667±10％、16.414±10％、19.071±10％、19.953±10％、20.733±10％、25.511±10％、27.028±10％、30.452±10％、31.400±10％、32.377±10％、38.120±10％、41.385±10％、50.559±10％、52.620±10％。
在一种优选的实施方式中，在该检测波长为260nm时，该峰2为色氨酸的色谱峰，该峰7为新芒果苷的色谱峰，该峰10为芒果苷的色谱峰，该峰14为毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱峰。
在一种优选的实施方式中，该指纹图谱在检测波长260nm下，包括16个特征峰，以10号峰芒果苷的色谱峰为参比峰，其他15个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.34±10％、2号色谱峰0.38±10％、3号色谱峰0.51±10％、4号色谱峰0.54±10％、5号色谱峰0.63±10％、6号色谱峰0.66±10％、7号色谱峰0.68±10％、8号色谱峰0.84±10％、9号色谱峰0.89±10％、11号色谱峰1.03±10％、12号色谱峰1.06±10％、13号色谱峰1.25±10％、14号色谱峰1.36±10％、15号色谱峰1.66±10％、16号峰1.73±10％。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含三棱、莪术的中药复方的质量控制方法，该质量控制方法包括如下步骤：
(1)根据上述指纹图谱构建方法建立中药复方基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药复方供试品溶液，根据上述指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药复方待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的该中药复方待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的该中药复方基准样品标准指纹图谱进行对比，符合要求的则为合格产品，不符合要求的则为不合格产品。
在一种优选的实施方式中，该符合要求包括以下的一种或多种：
(1)在该检测波长为260nm时，该中药复方待测样品指纹图谱中呈现出16个特征色谱峰，各特征色谱峰的保留时间在该中药复方基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10％之内；
(2)在该检测波长为260nm时，以芒果苷的色谱峰为S峰，中药复方待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在该中药复方基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；以及
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，该中药复方待测样品指纹图谱与该中药复方基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述检测方法或上述构建方法或上述质量控制方法在包含三棱、莪术的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例
1、仪器与试药
仪器：高效液相色谱仪安捷伦1290色谱系统，包括G1322A型脱气机、G1311A型四元泵、G1313A型自动进样器、G1315B型DAD二极管阵列检测器、G1316A型柱温箱、ChemStation色谱工作站；高效液相色谱仪Waters 2695色谱系统，包括四元梯度输液泵(Alliance 2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters 2996型DAD二极管阵列检测器、Empower 3色谱管理系统；色谱柱1：HALO AQ-C182.7μm 4.6x150mm SerialNo.USAQT001502；色谱柱2：HALO AQ-C182.7μm 4.6x150mm Serial No.USAQT001515；色谱柱3：HALO AQ-C182.7μm 4.6x150mm Serial No.USAQT001526；甲醇、磷酸为色谱纯，水为纯化水。
对照品信息：黄芪皂苷Ⅰ(批号：AFBJ2501，含量：98.84％，成都埃法生物科技有限公司)；黄芪皂苷Ⅱ(批号：AFBL2353，含量：99.94％，成都埃法生物科技有限公司)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：AF21041804，含量：99.98％，中国食品药品检定院)；毛蕊异黄酮(批号：111920-201907，含量：96.8％，中国食品药品检定院)；新芒果苷(批号：AF21022204，含量：98.59％，成都埃法生物科技有限公司)；芒果苷(批号：111607-201704，含量：98.3％，中国食品药品检定院)；异芒果苷(批号：AF22051603，含量：99.27％，成都埃法生物科技有限公司)；色氨酸(批号：140086-202205，含量：100.0％，中国食品药品检定院)。
2、溶液的制备
2.1、对照品溶液的配制
分别精密称取黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、色氨酸对照品适量，分别加甲醇配置成黄芪皂苷Ⅰ50μg/ml、黄芪皂苷Ⅱ32.10μg/ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷69.78μg/ml、毛蕊异黄酮15.2μg/ml、新芒果苷2.307μg/ml、芒果苷52.10μg/ml、异芒果苷12.10μg/ml、色氨酸浓度10.40μg/ml的溶液；制成参照物溶液。
2.2、供试品溶液的制备
取包含三棱、莪术的中药复方样品(煎液)适量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3、阴性溶液的制备
①缺黄芪的阴性样品溶液的制备：按处方称取除黄芪外的其他药味，按“2.2、供试品溶液的制备”制备缺黄芪的阴性样品溶液。
②缺党参的阴性样品溶液的制备：按处方称取除党参外的其他药味，按“2.2、供试品溶液的制备”制备缺党参的阴性样品溶液。
③缺白术的阴性样品溶液的制备：按处方称取除白术外的其他药味，按“2.2、供试品溶液的制备”制备缺白术的阴性样品溶液。
④缺山药的阴性样品溶液的制备：按处方称取除山药外的其他药味，按“2.2、供试品溶液的制备”制备缺山药的阴性样品溶液。
⑤缺天花粉的阴性样品溶液的制备：按处方称取除天花粉外的其他药味，按“2.2、供试品溶液的制备”制备缺天花粉的阴性样品溶液。
⑥缺知母的阴性样品溶液的制备：按处方称取除知母外的其他药味，按“2.2、供试品溶液的制备”制备缺知母的阴性样品溶液。
⑦缺三棱的阴性样品溶液的制备：按处方称取除三棱外的其他药味，按“2.2、供试品溶液的制备”制备缺三棱的阴性样品溶液。
⑧缺莪术的阴性样品溶液的制备：按处方称取除莪术外的其他药味，按“2.2、供试品溶液的制备”制备缺莪术的阴性样品溶液。
⑨缺鸡内金的阴性样品溶液的制备：按处方称取除鸡内金外的其他药味，按“2.2、供试品溶液的制备”制备缺鸡内金的阴性样品溶液。
2.4、单味药味溶液制备
分别取九味单味饮片适量，至具塞锥形瓶中，加50ml水，浸泡30min，加热回流55分钟，放冷，过滤，得滤液，即得。
3、色谱条件
照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基键合硅胶为填充剂(HALO AQ-C18 2.7μm4.6x150mm)；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸为流动相B；按表1中的流动相梯度进行梯度洗脱；检测波长为190-400nm。理论板数按按芒果苷峰计算应不低于3000。
表1初设流动相梯度
3.1、流动相梯度选择
为使色谱图谱中各主要色谱峰均有较好的分离参数，呈现较优的色谱行为，取“根据3D色谱图确定检测波长为260nm”项中的供试品溶液，对洗脱梯度进行优化，优化的梯度程序如下所示。
表2流动相梯度1
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～2 | 5→8 | 95→92 |
| 2～10 | 8→14 | 92→86 |
| 10～15 | 14→30 | 86→70 |
| 15～40 | 30→55 | 70→45 |
| 40～50 | 55→90 | 45→10 |
| 50～55 | 90 | 10 |
| 55～56 | 90→5 | 10→95 |
| 56～65 | 5 | 95 |
表3流动相梯度2
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～2 | 5→8 | 95→92 |
| 2～14 | 8→28 | 92→72 |
| 14～34 | 28→40 | 72→60 |
| 34～40 | 40 | 60 |
| 40～45 | 40→50 | 60→50 |
| 45～47 | 50→90 | 50→15 |
| 47～55 | 90 | 10 |
| 55～56 | 90→5 | 10→95 |
| 56～65 | 5 | 95 |
表4流动相梯度3
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～8 | 10→19 | 90→81 |
| 8～15 | 19→28 | 81→72 |
| 15～35 | 28→34 | 72→66 |
| 35～45 | 34→43 | 66→57 |
| 45～46 | 43→72 | 57→28 |
| 46～54 | 72 | 28 |
| 54～55 | 72→10 | 28→90 |
| 55～65 | 10 | 90 |
表5流动相梯度4
表6流动相梯度5
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～8 | 10→19 | 90→81 |
| 8～18 | 19→26 | 81→74 |
| 18～28 | 26 | 74 |
| 28～40 | 26→32 | 74→68 |
| 40～46 | 32→75 | 68→25 |
| 46～54 | 75 | 25 |
| 54～55 | 75→10 | 25→90 |
| 55～65 | 10 | 90 |
表7流动相梯度6
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～8 | 10→20 | 90→80 |
| 8～18 | 20→26 | 80→74 |
| 18～30 | 26 | 74 |
| 30～40 | 26→32 | 74→68 |
| 40～46 | 32→75 | 68→25 |
| 46～54 | 75 | 25 |
| 54～55 | 75→10 | 25→90 |
| 55～65 | 10 | 90 |
如图1～图6所示，在梯度1至梯度3条件下在14～30分钟内各色谱峰堆积；在梯度4条件下在16分钟左右和27分钟左右色谱峰的分离效果不佳；在梯度5条件下在16分钟左右色谱峰的分离效果未达到要求；结果表明，在梯度6的洗脱程序下，基线平稳，各主要色谱峰分离较好，分析时间在65分钟内，故确定选择梯度6色谱条件用于指纹图谱测定。
3.2、确定的方法
色谱条件及系统适用性试验以甲醇为流动相A，0.1％磷酸为流动相B；按表7中的流动相梯度6进行梯度洗脱；检测波长为260nm。理论板数按芒果苷峰计算应不低于3000。
3.3、分析方法验证
对上述所建立的指纹图谱，参照《中国药典》2020年版四部9101分析方法验证指导原则及《国家药品标准工作手册》(第四版)等进行系统的方法学验证。
3.3.1、专属性
按照“2.3、阴性溶液的制备”依法制备阴性样品溶液，按照“3.2、确定的方法”的方法试验，记录色谱图。
如表8所示，结果表明，包含三棱、莪术的中药复方基准样品色谱图中主要呈现16个峰，峰14归属于黄芪药味，为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰4归属于党参药味，峰7、10、11、13归属于知母药味，其中峰10为芒果苷，峰9、15、16归属于莪术药味，峰12归属于鸡内金药味，且阴性无干扰，方法专属性好。
表8专属性考察结果
3.3.2、精密度
3.3.2.1、仪器精密度试验
取同一供试品溶液连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相似度。结果表明，该方法仪器精密度的相似度均大于0.90，表明该方法仪器精密度良好。
3.3.2.2、中间精密度
两位人员，按以上确定条件制备6份供试品溶液，分别在Agilent高效液相色谱仪和Waters高效液相色谱仪，进样检测，记录色谱图，计算各特征峰的相似度。结果表明，各特征峰中间精密度的相似度结果均大于0.90，符合规定。
3.3.2.3、重复性试验
取同一批样品6份，每份约1g，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，记录色谱图，计算各特征峰的相似度。结果表明，各特征峰重复性的相似度结果均大于0.90，符合规定。
3.3.3、耐用性
3.3.3.1、稳定性考察
取同一供试品溶液，在第0、2h、4h、6h、8h、12h、18h、25h、37h和46h进样。记录色谱图，计算各特征峰的相似度，考察供试品溶液的稳定性。结果表明，其稳定性46h内，各特征峰相似度结果大于0.90，符合规定，表明在46h内稳定。
3.3.3.2、不同流速的考察
取同一供试品溶液，分别在不同流速0.4ml/min、0.5ml/min和0.6ml/min下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相似度。结果表明，不同流速的相似度结果均大于0.90，流速耐用性良好，符合规定。
3.3.3.3、不同柱温的考察
取同一供试品溶液，分别在27℃、30℃和33℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相似度，并与标准对照谱进行相似度匹配计算，结果如下。结果表明，各特征峰的相似度结果均大于0.90，柱温耐用性良好，符合规定。
3.3.3.4、不同浓度流动相的考察
取同一供试品溶液，分别在流动相中磷酸溶液浓度为0.09％、0.10％和0.11％下进行试验，记录色谱图，与包含三棱、莪术的中药复方标准对照谱进行相似度匹配计算。结果表明，不同酸浓度条件下，各共有峰的相似度结果大于0.90，符合规定。
3.3.3.5、不同色谱柱
取同一供试品溶液，分别在不同色谱柱(色谱柱1：HALO AQ-C182.7μm 4.6x150mmSerial No.USAQT001515)、(色谱柱2：HALO AQ-C182.7μm 4.6x150mm SerialNo.USAQT001526)、(色谱柱3：HALO AQ-C182.7μm 4.6x150mm Serial No.USAQT001502)下进行试验，记录色谱图，与包含三棱、莪术的中药复方标准对照谱进行相似度匹配计算。结果表明，不同色谱柱的相似度结果均大于0.90，符合规定。
4、15批基准样品试验
如图7、图8所示，确定供试品色谱中呈现16个特征峰，其中芒果苷参照物峰相对应的峰为S峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度不得低于0.90。
5、指纹图谱方法确认
由上述方法学考察结果，建立的指纹图谱的16个共有峰中，各色谱峰受不同品牌高效液相色谱仪、不同色谱柱、不同柱温与流速等因素影响较小，且其余色谱条件影响变化不大，说明该方法耐用性较好，方法稳定可靠，可用于指纹图谱测定。
综合以上的结果，确定指纹图谱方法如下：
色谱条件及系统适用性：以十八烷基键合硅胶为填充剂(HALO AQ-C18 2.7μm4.6x150mm)；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸为流动相B；按表7中的流动相梯度6进行梯度洗脱；检测波长为260nm。理论板数按芒果苷峰计算应不低于3000。
参照物溶液的制备：精密称取色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成色氨酸10.40μg/ml、新芒果苷2.307μg/ml、芒果苷52.10μg/ml和毛蕊异黄酮葡萄糖苷69.78μg/ml的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
确定供试品色谱中呈现16个特征峰；其中峰2为色氨酸色谱峰；峰7为新芒果苷色谱峰；峰10为芒果苷色谱峰，定为S峰；峰14为毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度不得低于0.90。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种包含三棱、莪术的中药复方的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，
所述检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～8min，10％A→20％A；8～18min，20％→26％A；18～30min，26％A；30～40min，26％→32％A；40～46min，32％→75％A；46～54min，75％A；54～55min，75％A→10％A；55～65min，10％A；流速为0.2～0.8mL/min，柱温为20～40℃，检测波长190～400nm，进样量为1～10μl；
根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息；
其中所述中药复方包括黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金，所述对照品包括色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述信息为根据所记录的所述中药复方供试品溶液的色谱图和所述对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算所述中药复方中以下成分中一种或多种的含量：黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金；
优选地，所述中药复方供试品溶液的制备方法包括：称取适量的中药复方溶液，摇匀，过滤，取续滤液，得到所述中药复方供试品溶液；
更优选地，所述对照品溶液的制备方法包括：称取适量的色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，添加甲醇溶液配制成各个对照品浓度分别为1～400μg/ml，例如1～100μg/ml，例如约50μg/ml的所述对照品溶液；
又优选地，所述流速为0.3～0.7ml/min，例如0.4～0.6ml/min；
又优选地，所述柱温为25～35℃，例如27～33℃；
又优选地，所述检测波长为200～280nm，例如260nm；
又优选地，所述进样量为2～8μl，例如约5μl；
尤其优选地，所述芒果苷对应的色谱峰的理论塔板数不低于3000；
尤其优选地，所述对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5；
尤其优选地，所述色谱柱为HALO AQ-C18色谱柱；
尤其优选地，所述色谱柱的规格为：柱长150mm，内径4.6mm，粒径2.7μm。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A为甲醇；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；
更优选地，所述酸水溶液为0.08％～0.12％的酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.08％～0.12％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.09％～0.11％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0；
又优选地，所述中药复方溶液的制备方法包括：(a)称取适量的中药复方，置于适当体积的容器中，加水浸泡，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到药渣和第一煎煮液；(b)在所述药渣中再次加入水，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到第二煎煮液；以及(c)将所述第一煎煮液和所述第二煎煮液合并，得到所述中药复方溶液；
尤其优选地，所述容器为煎药壶；
尤其优选地，所述容器的体积为2L；
尤其优选地，在步骤(a)中，所述中药复方与所述水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.1865；
尤其优选地，在步骤(b)中，所述中药复方与所述水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.27975；
尤其优选地，所述浸泡的时间为10～60min，例如约30min；
尤其优选地，所述武火的电压为200～300V，例如约220V；
尤其优选地，所述文火的电压为150～200V，例如约175V；
尤其优选地，所述微沸煎煮的时间为10～60min，例如约30min或约25min；
尤其优选地，所述溶剂为醋；
尤其优选地，所述滤网为120目滤网；
特别优选地，在所述中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为(1～20):(1～20):(1～10):(10～30)：(10～30):(10～30):(1～20):(1～20):(1～20)；
特别优选地，在所述中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为约11.19:约11.19:约7.46:约18.65:约14.92:约14.92:约11.19:约11.19:约11.19；
又特别优选地，所述黄芪为生黄芪；
又特别优选地，所述山药为生山药；
又特别优选地，所述鸡内金为生鸡内金。
4.一种包含三棱、莪术的中药复方的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
供试品溶液的制备：称取适量的中药复方溶液，摇匀，过滤，取续滤液，得到所述中药复方供试品溶液；其中所述中药复方包括黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金；
对照品溶液的制备：称取适量的色氨酸、新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，添加甲醇溶液配制成各个对照品浓度分别为1～400μg/ml的所述对照品溶液；
根据高效液相检测所述供试品溶液和所述对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～8min，10％A→20％A；8～18min，20％→26％A；18～30min，26％A；30～40min，26％→32％A；40～46min，32％→75％A；46～54min，75％A；54～55min，75％A→10％A；55～65min，10％A；流速为0.2～0.8mL/min，柱温为20～40℃，检测波长190～400nm，进样量为1～10μl。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述流速为0.3～0.7ml/min，例如0.4～0.6ml/min；
优选地，所述柱温为25～35℃，例如27～33℃；
优选地，所述检测波长为200～280nm，例如260nm；
优选地，所述进样量为2～8μl，例如约5μl；
更优选地，所述芒果苷对应的色谱峰的理论塔板数不低于3000；
更优选地，所述对照品对应的色谱峰的分离度大于1.5；
更优选地，所述色谱柱为HALO AQ-C18色谱柱；
更优选地，所述色谱柱的规格为：柱长150mm，内径4.6mm，粒径2.7μm。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述流动相A为甲醇；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；
更优选地，所述酸水溶液为0.08％～0.12％的酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.08％～0.12％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.09％～0.11％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0；
又优选地，所述中药复方溶液的制备方法包括：(a)称取适量的中药复方，置于适当体积的容器中，加水浸泡，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到药渣和第一煎煮液；(b)在所述药渣中再次加入水，武火加热至沸后，转文火保持微沸煎煮一段时间，滴加溶剂，滤网过滤，得到第二煎煮液；以及(c)将所述第一煎煮液和所述第二煎煮液合并，得到所述中药复方溶液；
尤其优选地，所述容器为煎药壶；
尤其优选地，所述容器的体积为2L；
尤其优选地，在步骤(a)中，所述中药复方与所述水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.1865；
尤其优选地，在步骤(b)中，所述中药复方与所述水之间的质量/体积(g/ml)之比值为0.05～0.5，例如约0.27975；
尤其优选地，所述浸泡的时间为10～60min，例如约30min；
尤其优选地，所述武火的电压为200～300V，例如约220V；
尤其优选地，所述文火的电压为150～200V，例如约175V；
尤其优选地，所述微沸煎煮的时间为10～60min，例如约30min或约25min；
尤其优选地，所述溶剂为醋；
尤其优选地，所述滤网为120目滤网；
特别优选地，在所述中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为(1～20):(1～20):(1～10):(10～30)：(10～30):(10～30):(1～20):(1～20):(1～20)；
特别优选地，在所述中药复方中，黄芪、党参、白术、山药、天花粉、知母、三棱、莪术和鸡内金之间的质量之比为约11.19:约11.19:约7.46:约18.65:约14.92:约14.92:约11.19:约11.19:约11.19；
又特别优选地，所述黄芪为生黄芪；
又特别优选地，所述山药为生山药；
又特别优选地，所述鸡内金为生鸡内金。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，在所述检测波长为260nm时，所述指纹图谱包括1-16号峰，其中，峰1为山药、知母药味的共有峰，峰2为黄芪、党参、三棱、白术、天花粉药味的共有峰，峰3为知母、莪术、鸡内金、三棱药味的共有峰，峰4归属于党参药味，峰5为莪术、三棱药味的共有峰，峰6为党参、知母药味的共有峰，峰7、10、11、13归属于知母药味，峰8为莪术、三棱药味的共有峰，峰9、15、16归属于莪术药味，峰12归属于鸡内金药味，峰14归属于黄芪药味；
优选地，在所述检测波长为260nm时，1-16号峰的保留时间分别为10.335±10％、11.559±10％、15.667±10％、16.414±10％、19.071±10％、19.953±10％、20.733±10％、25.511±10％、27.028±10％、30.452±10％、31.400±10％、32.377±10％、38.120±10％、41.385±10％、50.559±10％、52.620±10％；
更优选地，在所述检测波长为260nm时，所述峰2为色氨酸的色谱峰，所述峰7为新芒果苷的色谱峰，所述峰10为芒果苷的色谱峰，所述峰14为毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱峰；
又优选地，所述指纹图谱在检测波长260nm下，包括16个特征峰，以10号峰芒果苷的色谱峰为参比峰，其他15个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.34±10％、2号色谱峰0.38±10％、3号色谱峰0.51±10％、4号色谱峰0.54±10％、5号色谱峰0.63±10％、6号色谱峰0.66±10％、7号色谱峰0.68±10％、8号色谱峰0.84±10％、9号色谱峰0.89±10％、11号色谱峰1.03±10％、12号色谱峰1.06±10％、13号色谱峰1.25±10％、14号色谱峰1.36±10％、15号色谱峰1.66±10％、16号峰1.73±10％。
8.一种包含三棱、莪术的中药复方的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法包括如下步骤：
(1)根据权利要求4至7中任一项所述的指纹图谱构建方法建立中药复方基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药复方供试品溶液，根据权利要求4至7中任一项所述的指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药复方待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的所述中药复方待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的所述中药复方基准样品标准指纹图谱进行对比，符合要求的则为合格产品，不符合要求的则为不合格产品。
9.根据权利要求8所述的质量控制方法，其特征在于，所述符合要求包括以下的一种或多种：
(1)在所述检测波长为260nm时，所述中药复方待测样品指纹图谱中呈现出16个特征色谱峰，各特征色谱峰的保留时间在所述中药复方基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10％之内；
(2)在所述检测波长为260nm时，以芒果苷的色谱峰为S峰，中药复方待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在所述中药复方基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；以及
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，所述中药复方待测样品指纹图谱与所述中药复方基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法或根据权利要求4至7中任一项所述的构建方法或根据权利要求8或9所述的质量控制方法在包含三棱、莪术的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
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| Publication Number | Publication Date |
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| CN118275596A true CN118275596A (zh) | 2024-07-02 |
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