CN111487350B - 丹参-三七药对的质量检测方法 - Google Patents

丹参-三七药对的质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丹参‑三七药对的质量检测方法，本发明根据丹参‑三七药对中酚酸类、人参皂苷和三七皂苷类等共23种成分的结构及其性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，洗脱程序、流速，色谱柱、质谱条件等分析条件。经多次实验验证表明，本发明采用UPLC‑TQ‑MS/MS方法能够同时共23种不同结构和类型的化合物，该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确的评价丹参‑三七药对药材及其提取物与制剂的质量，对控制质量和保证临床疗效具有重要意义。

Description

丹参-三七药对的质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药材的质量控制方法，具体涉及丹参-三七药对的质量检测方法。
背景技术
药对是中医临床遣药组方上常用的相对固定的两种药的配伍组合，是连接单味中药与若干方剂之间的桥梁，是方剂配伍的精华与核心所在，是历代医药学家长期医疗实践的经验总结。丹参、三七药效相近，常配伍使用，是经典的活血化瘀药对之一。现代研究表明，丹参中主要含有丹参素、迷迭香酸、咖啡酸和丹酚酸B等酚酸类化合物以及丹参酮IIA等脂溶性化合物，三七的活性成分主要为三七皂苷类和人参皂苷类化合物。丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1等是含有丹参-三七制剂常用的质量控制指标。
药对化学成分的研究对于揭示方剂配伍规律及其临床应用的合理性提供了科学依据。药对的定量分析是中药药效物质基础和作用机制的重要前提，现有技术中对丹参-三七药对的检测大多仅是少数有效成分的测定。本发明在现有技术的基础之上，通过大量实验筛选，采用UHPLC-TQ-MS/MS分析方法，同时测定丹参-三七药对中23个化学成分的含量，为丹参-三七药对的药效物质基础研究奠定基础，也为药材质量及后续研究结果提供数据参考。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，经过大量实验筛选，采用UHPLC-TQ-MS/MS检测丹参-三七药对供试品中丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C，紫草酸，咖啡酸，丹参素，迷迭香酸，原儿茶酸，原儿茶醛，人参皂苷和三七皂苷等23种成分。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确地评价丹参-三七药对供试品药材及其提取物与制剂的质量，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种丹参-三七药对的质量检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C，紫草酸，咖啡酸，丹参素，迷迭香酸，原儿茶酸，原儿茶醛，人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rf，F1，F2，Rh1，三七皂苷R1，R2，Fe，加甲醇制成混合标准储备溶液，4℃保存；
步骤(2)供试品溶液的制备
取丹参加乙醇加热回流提取，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；再取丹参药渣加乙醇水溶液加热回流提取，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣再加水煎煮2小时，煎液滤过，滤液浓缩至适量；合并三次提取的浓缩物；
取三七粉碎成细粉，将三七粉末与上述丹参浓缩物混合均匀，得到丹参-三七提取物；
精密称取丹参-三七提取物冻干粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇水溶液，密塞，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用甲醇水溶液补足失去的重量，摇匀，滤过，取续滤液，进样之前过微孔滤膜；
步骤(3)线性回归方程的建立
取步骤(1)的混合标准储备溶液，依次稀释5倍，通过0.22μm纤维素膜过滤，得到系列浓度的混合对照品溶液，依次注入UPLC-TQ-MS/MS，以系列对照品浓度作为横坐标X，对应的峰面积为纵坐标Y，对各化学成分进行线性回归分析并计算线性回归方程；
步骤(4)含量测定
取步骤(2)的丹参-三七药对供试品溶液，注入UPLC-TQ-MS/MS进行分析，将峰面积代入步骤(3)的线性回归方程，计算供试品溶液中丹酚酸类和皂苷类成分的含量。
作为优选方案，以上所述的丹参-三七药对的质量检测方法，步骤(1)对照品溶液的制备方法为：
精密称取干燥至恒重的丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C，紫草酸，咖啡酸，丹参素，迷迭香酸，原儿茶酸，原儿茶醛，人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rf，F1，F2，Rh1，三七皂苷R1，三七皂苷R2，三七皂苷Fe，加甲醇制成浓度分别为1.5，5，0.08，0.4，0.08，5，1，0.08，0.4，16，0.3，0.08，0.0625，3，20，5，0.3，0.5，0.3，0.8，7，1，0.3μg/mL的混合标准储备溶液，4℃保存，进样前，过0.22μm微孔滤膜。
作为优选方案，以上所述的丹参-三七药对的质量检测方法，步骤(2)供试品溶液的制备方法为：
取丹参加乙醇加热回流提取1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；再取丹参药渣加50％乙醇加热回流提取1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣再加水煎煮2小时，煎液滤过，滤液浓缩至适量；合并三次提取的浓缩物；
取三七粉碎成细粉，过80目筛；然后将三七粉末与上述丹参浓缩物混合均匀，得到丹参-三七提取物；
精密称取丹参-三七提取物粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，称定重量，功率160W，频率40kHz超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足失去的重量，摇匀，滤过，取续滤液，进样之前过0.22μm微孔滤膜。
作为优选方案，以上所述的丹参-三七药对的质量检测方法，步骤(3)和步骤(4)中的UPLC-TQ-MS/MS的色谱条件为：
色谱柱：UPLC BEH C18柱，规格100×2.1mm，1.7μm，美国Waters公司；柱温：35℃，样品温度：4℃；流速：0.40mL/min；进样：1μL；流动相A为0.1％甲酸水，B为乙腈；梯度洗脱：0～1min 8％B，1～6min 8-38％B，6～7.5min 38-85％B，7.5～8min 85-90％B，8～8.5min90％B，8.5～9min 90-8％B，9～10min 8％B；
质谱条件
在负离子模式下，采用ESI操作，质谱参数设置如下：毛细管电压2.5kV，去溶剂化温度450℃，离子源温度150℃，锥孔气体流量150L/h，去溶剂化气体流量1000L/h，雾化7.0Bar。
作为优选方案，以上所述的丹参-三七药对的质量检测方法，其特征在于，23种对照品质谱条件如下表：
Figure BDA0002495783640000031
以上所述的丹参-三七药对的质量检测方法，步骤(3)中23种对照品的线性回归方程如下表：
No 化合物 回归方程 R<sup>2</sup> 线性范围(ng/mL)
1 原儿茶酸 y＝0.0054x+0.0009 0.9970 0.4-80
2 原儿茶醛 y＝0.0006x+0.0001 0.9967 2.0-400
3 咖啡酸 y＝0.0053x+0.0033 0.9978 0.4-80
4 丹参素 y＝0.0011x+0.0089 0.9970 25-5000
5 迷迭香酸 y＝0.0048x-0.0070 0.9985 5.0-1000
6 丹酚酸A y＝0.0042x-0.0244 0.9981 15-1500
7 丹酚酸B y＝0.0018x-0.0075 0.9969 25-5000
8 丹酚酸C y＝0.0092x+0.000004 0.9981 0.4-80
9 紫草酸 y＝0.0019x-0.0007 0.9983 2.0-400
10 人参皂苷Rb1 y＝0.0002x+0.0086 0.9936 80-16000
11 人参皂苷Rb2 y＝0.0039x-0.0003 0.9988 1.5-300
12 人参皂苷Rc y＝0.0015x-0.0002 0.9958 0.4-80
13 人参皂苷Rd y＝0.0298x+0.0387 0.9975 1.0-62.50
14 人参皂苷Re y＝0.0002x+0.0004 0.9934 15-3000
15 人参皂苷Rg1 y＝0.0004x+0.0188 0.9923 100-20000
16 人参皂苷Rf y＝0.0049x+0.0011 0.9990 1.5-300
17 人参皂苷F2 y＝0.0013x-0.0002 0.9930 1.5-300
18 人参皂苷Rg2 y＝0.0006x+0.0028 0.9993 25-5000
19 人参皂苷F1 y＝0.0023x+0.0017 0.9924 2.5-500
20 人参皂苷Rh1 y＝0.0004x+0.0004 0.9966 4.0-800
21 三七皂苷R1 y＝0.0019x+0.0090 0.9936 35-7000
22 三七皂苷Fe y＝0.0024x+0.0004 0.9987 1.5-300
23 三七皂苷R2 y＝0.0052x+0.0016 0.9991 5.0-1000
方法学考察
1、线性，检测限(LOD)和定量限(LOQ)
通过使用加权(1/x2)最小二乘线性回归绘制化合物与内标的峰面积比与化合物的标准浓度的关系来构建校准曲线。LOD定义为化合物的信噪比(S/N)大于3时化合物的最低浓度，LOQ定义为当化合物的信噪比至少为10并且具有可接受的精密度和准确度时的最低定量浓度。
2、精密度和加样回收率
通过分别在一天和连续三天中分析包含23种中等浓度标准化合物的混合标准溶液的六份重复样品，来评估日内和日间精密度。通过分析加标样品确定回收率。将一定数量的样品(0.1g)以低，中，高水平掺入23种已知数量的标准样品，添加量为一定数量样品的80％，100％，120％。加标样品在每个浓度下均一式三份制备，并通过计算每种分析物的萃取回收率来评估其回收率，以评估方法的准确性。
3、重复性和稳定性
通过使用分析方法测定从同一批次制备的六个独立样品溶液来评估可重复性，并通过计算RSD值表示变化。通过分析分别在室温下0、4、8、12、24和48h放置的一式三份样品溶液来确定稳定性。将计算每种化合物的峰面积的RSD值。
4、方法学验证
该方法在选定的23种分析物浓度范围内表现出极好的线性，并且所有校准曲线的相关系数均大于0.99。23种化合物的LODs和LOQs范围在0.20-5.00ng/mL范围内和0.4-100ng/mL。所有分析物的日内和日间精密度(RSD)分别小于5.84％和6.66％。23种化合物的回收率在95.60％至104.21％之间，RSD小于2.4％。此外，下表总结了该方法中分析物的重复性和稳定性数据，其RSD分别小于2.99％和5.91％。这些结果表明，所开发的方法足够准确，可靠地用于丹参-三七药对中多组分的定量分析。
Figure BDA0002495783640000051
Figure BDA0002495783640000061
有益效果：本发明提供的丹参-三七药对的质量检测方法和现有技术相比具有以下优点：
本发明根据丹参-三七药对中酚酸类、人参皂苷和三七皂苷等共23种成分的结构及其性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，洗脱程序、流速，色谱柱、质谱条件等分析条件。经多次实验验证表明，本发明能够同时共23种不同结构和类型的化合物，该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确的评价丹参-三七药对药材及其提取物与制剂的质量，对控制质量和保证临床疗效具有重要意义。
附图说明
23种对照品的MRM色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
本实施例所用仪器与材料
热回流提取浓缩罐(温州市远中机械有限公司)；BUCHI旋转蒸发仪(瑞士步琪有限公司)；SHB-95A型循环水式多用真空泵(河南巩义市英峪仪器厂)；ACQUITY UPLC系统，TQ质谱仪(美国Waters公司)。Mill-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。
丹参(山东临沂，批号180312)，三七(云南文山，批号184030)药材购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，并经南京中医药大学严辉老师鉴定分别为唇形科植物丹参SalviamiltrorrhizaBge.的干燥根和根茎，五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的根，均符合《中华人民共和国药典》(2015年版)项下标准。丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C，紫草酸，咖啡酸，丹参素，迷迭香酸，原儿茶酸，原儿茶醛，人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rf，F1，F2，Rh1，三七皂苷R1，R2，Fe(纯度≥98％)购自上海源叶生物科技有限公司(中国，上海)。甲醇、甲酸和乙腈(色谱纯，德国默克公司)。
一种丹参-三七药对的质量检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C，紫草酸，咖啡酸，丹参素，迷迭香酸，原儿茶酸，原儿茶醛，人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rf，F1，F2，Rh1，三七皂苷R1，R2，Fe，加甲醇制成浓度分别为1.5，5，0.08，0.4，0.08，5，1，0.08，0.4，16，0.3，0.08，0.0625，3，20，5，0.3，0.5，0.3，0.8，7，1，0.3μg/mL的混合标准储备溶液，4℃保存，进样前，过0.22μm微孔滤膜。
步骤(2)供试品溶液的制备
取丹参加乙醇加热回流提取1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；再取丹参药渣加50％乙醇加热回流提取1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣再加水煎煮2小时，煎液滤过，滤液浓缩至适量；合并三次提取的浓缩物；
取三七粉碎成细粉，过80目筛；然后将三七粉末与上述丹参浓缩物混合均匀，得到丹参-三七提取物；
精密称取丹参-三七提取物0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，称定重量，功率160W，频率40kHz超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足失去的重量，摇匀，滤过，取续滤液，进样之前过0.22μm微孔滤膜。
步骤(3)线性回归方程的建立
取步骤(1)的混合标准储备溶液，依次稀释5倍，通过0.22μm纤维素膜过滤，得到系列浓度的混合对照品溶液，依次注入UPLC-TQ-MS/MS，如图1，以系列对照品浓度作为横坐标X，对应的峰面积为纵坐标Y，对各化学成分进行线性回归分析并计算线性回归方程；
表1 23种成分的回归方程
Figure BDA0002495783640000071
Figure BDA0002495783640000081
步骤(4)含量测定
取步骤(2)的丹参-三七药对供试品溶液，注入UPLC-TQ-MS/MS进行分析，将峰面积代入步骤(3)的线性回归方程，计算供试品溶液中丹酚酸类和皂苷类成分的含量如下表2。
表2丹参-三七提取物中23个成分的含量分析
Figure BDA0002495783640000082
以上所述的丹参-三七药对的质量检测方法，步骤(3)和步骤(4)中的UPLC-TQ-MS/MS的色谱条件为：
色谱柱：UPLC BEH C18柱，规格100×2.1mm，1.7μm，美国Waters公司；柱温：35℃，样品温度：4℃；流速：0.40mL/min；进样：1μL；流动相A为0.1％甲酸水，B为乙腈；梯度洗脱：0～1min 8％B，1～6min 8-38％B，6～7.5min 38-85％B，7.5～8min 85-90％B，8～8.5min90％B，8.5～9min 90-8％B，9～10min 8％B；
质谱条件
在负离子模式下，采用ESI操作，质谱参数设置如下：毛细管电压2.5kV，去溶剂化温度450℃，离子源温度150℃，锥孔气体流量150L/h，去溶剂化气体流量1000L/h，雾化7.0Bar。
23种对照品质谱条件如下表3：
表3 23种对照品质谱条件
Figure BDA0002495783640000091
本发明提供的UPLC-TQ-MS/MS检测方法能同时准确检测丹参-三七药对供试品中23个丹酚酸类和皂苷类成分，并且本发明提供的丹参-三七药对供试品及其提取物的质量控制方法，精密度高，灵敏度高，稳定性和准确度高，可以客观、全面、准确地评价丹参-三七药对供试品药材及其提取物与制剂的质量，对准确控制丹参-三七药对供试品药材及其制剂的质量具有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种丹参-三七药对的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C，紫草酸，咖啡酸，丹参素，迷迭香酸，原儿茶酸，原儿茶醛，人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rf，F1，F2，Rh1，三七皂苷R1，R2，Fe，加甲醇制成混合标准储备溶液，4°C保存；
步骤（2）供试品溶液的制备
取丹参加乙醇加热回流提取，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；再取丹参药渣加乙醇水溶液加热回流提取，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣再加水煎煮2小时，煎液滤过，滤液浓缩至适量；合并三次提取的浓缩物；
取三七粉碎成细粉，将三七粉末与上述丹参浓缩物混合均匀，得到丹参-三七提取物；
精密称取丹参-三七提取物冻干粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇水溶液，密塞，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用甲醇水溶液补足失去的重量，摇匀，滤过，取续滤液，进样之前过微孔滤膜；
步骤（3）线性回归方程的建立
取步骤（1）的混合标准储备溶液，依次稀释5倍，通过0.22μm纤维素膜过滤，得到系列浓度的混合对照品溶液，依次注入UPLC-TQ-MS/MS，以系列对照品浓度作为横坐标X，对应的峰面积为纵坐标Y，对各化学成分进行线性回归分析并计算线性回归方程；
步骤（4）含量测定
取步骤（2）的丹参-三七药对供试品溶液，注入UPLC-TQ-MS/MS进行分析，将峰面积代入步骤（3）的线性回归方程，计算供试品溶液中酚酸类和皂苷类成分的含量;
所述的步骤（3）和步骤（4）中的UPLC-TQ-MS/MS的色谱条件为：
色谱柱：UPLC BEH C18柱，规格100 ×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司；柱温：35℃，样品温度：4℃；流速：0.40 mL/min；进样：1μL；流动相A为0.1%甲酸水，B为乙腈；梯度洗脱：0~1min 8%B，1~6 min 8→38%B，6~7.5 min 38→85%B，7.5~8 min 85→90%B，8~8.5 min 90%B，8.5~9 min 90→8%B，9~10 min 8%B；
质谱条件：在负离子模式下，采用ESI操作，质谱参数设置如下：毛细管电压2.5 kV，去溶剂化温度450°C，离子源温度150°C，锥孔气体流量150 L/h，去溶剂化气体流量1000 L/h，雾化7.0 Bar；
23种对照品质谱条件如下表：
化合物 保留时间/min 前体离子/m/z 产物离子/m/z 锥孔电压/V 碰撞能量/eV 原儿茶酸 1.48 152.6 108.9 6 13 原儿茶醛 2.24 136.6 108.1 34 18 咖啡酸 2.74 178.7 135.0 16 15 丹参素 1.23 196.8 178.8 20 10 迷迭香酸 4.61 359.1 161.0 34 16 丹酚酸A 5.24 493.3 295.1 24 16 丹酚酸B 4.89 717.3 519.2 22 18 丹酚酸C 5.97 491.2 293.1 34 20 紫草酸 4.66 537.3 493.2 12 10 人参皂苷Rb1 6.50 1153.7 1107.8 24 36 人参皂苷Rb2 6.61 1123.7 1077.7 46 26 人参皂苷Rc 6.44 1123.7 1077.7 46 26 人参皂苷Rd 7.01 991.7 945.7 50 32 人参皂苷Re 5.01 991.7 945.7 50 32 人参皂苷Rg1 5.02 845.6 799.6 52 26 人参皂苷Rf 6.39 845.6 799.6 6 22 人参皂苷F2 7.46 829.6 783.6 40 20 人参皂苷Rg2 6.77 829.6 783.6 24 20 人参皂苷F1 7.06 683.6 637.6 38 18 人参皂苷Rh1 6.84 683.6 637.5 26 22 三七皂苷R1 4.80 977.7 931.7 42 22 三七皂苷Fe 7.20 961.7 915.7 18 22 三七皂苷R2 6.58 815.6 769.6 38 22
。
2.根据权利要求1所述的丹参-三七药对的质量检测方法，其特征在于，
步骤(1)对照品溶液的制备方法为：
精密称取干燥至恒重的丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C，紫草酸，咖啡酸，丹参素，迷迭香酸，原儿茶酸，原儿茶醛，人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rf，F1，F2，Rh1，三七皂苷R1，三七皂苷R2，三七皂苷Fe，加甲醇制成浓度分别为1.5，5，0.08，0.4，0.08，5，1，0.08，0.4，16，0.3，0.08，0.0625，3，20，5，0.3，0.5，0.3，0.8，7，1，0.3 μg/mL的混合标准储备溶液，4°C保存，进样前，过0.22 μm微孔滤膜。
3.根据权利要求1所述的丹参-三七药对的质量检测方法，其特征在于，
步骤（2）供试品溶液的制备方法为：
取丹参加乙醇加热回流提取1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；再取丹参药渣加50％乙醇加热回流提取1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣再加水煎煮2小时，煎液滤过，滤液浓缩至适量；合并三次提取的浓缩物；
取三七粉碎成细粉，过80目筛；然后将三七粉末与上述丹参浓缩物混合均匀，得到丹参-三七提取物；
精密称取丹参-三七提取物粉末0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定重量，功率160 W，频率40 kHz超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足失去的重量，摇匀，滤过，取续滤液，进样之前过0.22 μm微孔滤膜。
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