CN113624873B - 紫苏叶指纹图谱、标准指纹图谱的构建方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种构建紫苏叶指纹图谱的方法，采用超高效液相色谱法，通过合理选择色谱条件，实现紫苏叶指纹图谱的构建，且所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，从而可用于紫苏叶药材的质量控制。本申请进一步提供了一种构建紫苏叶标准指纹图谱的方法，及其在质量控制中的用途。本申请提供的紫苏叶指纹图谱、标准指纹图谱的构建方法，可用于紫苏叶药材的质量控制，能够全面、准确、可靠地对紫苏叶的质量进行评价。

Description

紫苏叶指纹图谱、标准指纹图谱的构建方法及其用途
技术领域
本申请涉及中药分析技术领域，特别是涉及紫苏叶指纹图谱、标准指纹图谱的构建方法及其用途。
背景技术
紫苏叶为唇形科植物紫苏Perilla frutescens(L.)Britt.的干燥叶(或带嫩枝)，别名为苏叶、赤苏叶、青苏叶、香苏叶。夏季枝叶茂盛时采收，除去杂质、晒干。紫苏叶味辛、温，归肺、脾经；具有发表散寒的作用，用于外感风寒、发热恶寒、头痛鼻塞，兼见咳嗽或胸闷不舒者；具有行气宽中的作用，用于脾胃气滞、胸闷呕吐以及妊娠呕吐、胸腹满闷等；具有解鱼蟹毒的作用，用于进食鱼蟹而引起的腹痛、呕、泻。
指纹图谱技术是一种综合的、可量化的质量评价方法，该技术已被广泛应用于中药材的质量评价，获得了可靠的评价结果。目前，关于紫苏叶的指纹图谱研究较少，现有技术分析紫苏叶常采用高效液相色谱测定其个别有效成分，不能全面、客观、准确地评价紫苏叶的质量，且分析时间长。因此建立一种紫苏叶指纹图谱的构建方法对紫苏叶的质量控制具有重要意义。
发明内容
本申请的目的在于提供紫苏叶指纹图谱、紫苏叶标准指纹图谱的构建方法，可用于紫苏叶药材的质量控制。具体技术方案如下：
本申请的第一方面提供一种构建紫苏叶指纹图谱的方法，包括：
(1)取紫苏叶，以体积分数为50-70％的甲醇为溶剂，进行超声提取，得到紫苏叶的供试品溶液；
(2)采用超高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到紫苏叶的色谱图，即为紫苏叶的指纹图谱；其中，色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的磷酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数0-98％A相，2-100％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/min；柱温：24-28℃；进样体积：3-8μL；检测波长：205-220nm。
本申请的第二方面提供一种构建紫苏叶标准指纹图谱的方法，其中，所述方法包括：
取R份紫苏叶，分别根据本申请第一方面的方法，得到R份紫苏叶的指纹图谱；将所述R份紫苏叶的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，得到所述紫苏叶的标准指纹图谱；其中，R≥10。
本申请的第三方面提供根据本申请第二方面的方法得到的紫苏叶的标准指纹图谱。
本申请的第四方面提供根据本申请第一方面的方法和/或根据本申请第三方面的紫苏叶的标准指纹图谱，在紫苏叶的质量控制中的用途。
本申请的第五方面提供一种紫苏叶的质量控制方法，其中，所述方法包括：
a.取待测紫苏叶，根据本申请第一方面的方法得到待测紫苏叶的指纹图谱；
b.将步骤a得到的待测紫苏叶的指纹图谱和根据本申请第三方面的紫苏叶的标准指纹图谱进行相似度评价，若相似度≥0.90，判定待测紫苏叶的质量合格。
本申请提供的一种构建紫苏叶指纹图谱的方法，采用超高效液相色谱法，通过合理选择色谱条件，实现紫苏叶指纹图谱的构建，且所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，从而可用于紫苏叶药材的质量控制，也为进一步研究紫苏叶的化学成分和质量标准提供了依据。本申请进一步提供一种构建紫苏叶标准指纹图谱的方法，及其在质量控制中的用途。本申请提供的紫苏叶指纹图谱、标准指纹图谱的构建方法，可用于紫苏叶药材的质量控制，能够全面、准确、可靠地对紫苏叶的质量进行评价。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1为批次S1-S10的紫苏叶的指纹图谱和紫苏叶的标准指纹图谱；其中，编号1-11为紫苏叶的11个特征色谱峰，1号峰为丹参素，2号峰为绿原酸，7号峰为芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，8号峰为迷迭香酸。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请的第一方面提供一种构建紫苏叶指纹图谱的方法，包括：
(1)取紫苏叶，以体积分数为50-70％的甲醇为溶剂，进行超声提取，得到紫苏叶的供试品溶液；
(2)采用超高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到紫苏叶的色谱图，即为紫苏叶的指纹图谱；其中，色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的磷酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数0-98％A相，2-100％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/min；柱温：24-28℃；进样体积：3-8μL；检测波长：205-220nm。
本申请中，所述体积分数为50-70％的甲醇是指体积分数为50-70％的甲醇水溶液。
当采用本申请的供试品溶液的制备方法，结合本申请的超高效液相色谱法的色谱条件，有利于在较短的分析时间内获得较多的特征色谱峰，能够全面地从化学成分的角度建立紫苏叶的指纹图谱，从而能够快速、准确、全面、可信地构建紫苏叶的指纹图谱，可用于紫苏叶的质量控制。
在本申请第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，紫苏叶的质量M1与溶剂的体积V1的比值为1g:(90-110)mL。
在本申请第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，超声提取的时间为25-35min，提取功率为200-400W，提取频率30-50kHz。
发明人在研究中发现，采用本申请的梯度洗脱，能够使紫苏叶中各化学成分获得更好的分离效果，优选地，在本申请第一方面的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0-5min，2-7％B；5-7min，7-21％B；7-15min，21-25％B；15-16min，25-32％B；16-20min，32-37％B；20-33min，37-75％B；33-40min，75-100％B。
本申请的第二方面提供一种构建紫苏叶标准指纹图谱的方法，其中，所述方法包括：
取R份紫苏叶，分别根据本申请第一方面的方法，得到R份紫苏叶的指纹图谱；将所述R份紫苏叶的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，得到所述紫苏叶的标准指纹图谱；其中，R≥10。
本申请对所述中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析时的参数设置不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，对于参数中的时间窗宽度，本领域通常默认为0.1。
本申请第二方面提供的构建紫苏叶标准指纹图谱的方法，通过对得到的多份紫苏叶的指纹图谱进行分析，能够更准确地构建紫苏叶的标准指纹图谱，从而能够更准确、可信地对紫苏叶的质量进行评价。
本申请中，所述取R份紫苏叶，可以是取R批次不同产地的紫苏叶，每批次取1份；也可以是取多批次的不同产地的紫苏叶，每批次取多份，总数为R份。优选地，在本申请的一些实施方式中，所述取R份紫苏叶，是取R批次不同产地的紫苏叶，以体积分数为50-70％的甲醇为溶剂，分别进行超声提取，得到R份紫苏叶的供试品溶液。
本申请的第三方面提供根据本申请第二方面的方法得到的紫苏叶的标准指纹图谱。
在本申请第三方面的一些实施方式中，所述紫苏叶的标准指纹图谱包括11个特征色谱峰，保留时间依次为：5.95±0.05min、9.39±0.05min、10.24±0.05min、11.10±0.05min、11.66±0.05min、13.34±0.05min、13.72±0.05min、14.28±0.05min、25.85±0.05min、31.79±0.05min、37.02±0.05min。
本申请中，所述“特征色谱峰”，是指不同批次不同产地的紫苏叶的色谱图中均存在的保留时间相同的色谱峰，即各紫苏叶的色谱图中所具有的共有峰。其中，所述保留时间相同的色谱峰，是指保留时间的偏差≤0.05min的色谱峰。
本申请的第四方面提供根据本申请第一方面的构建紫苏叶指纹图谱的方法和/或根据本申请第三方面的紫苏叶的标准指纹图谱，在紫苏叶的质量控制中的用途。
本申请的第五方面提供一种紫苏叶的质量控制方法，其中，所述方法包括：
a.取待测紫苏叶，根据本申请第一方面的方法得到待测紫苏叶的指纹图谱；
b.将步骤a得到的待测紫苏叶的指纹图谱和根据本申请第三方面的紫苏叶的标准指纹图谱进行相似度评价，若相似度≥0.90，判定待测紫苏叶的质量合格。
具体的，本申请可以通过以下方法进行质量控制，采用本申请的方法获得紫苏叶的指纹图谱或标准指纹图谱，对未知质量的紫苏叶，按本申请的方法制备其供试品溶液，并按本申请的色谱条件检测供试品溶液，得到未知质量的紫苏叶的色谱图，根据如表1所示的11个特征色谱峰的保留时间，确定紫苏叶的11个特征色谱峰并获得其峰面积，将未知质量紫苏叶的色谱图，与紫苏叶的指纹图谱或紫苏叶的标准指纹图谱进行相似度评价，得到相似度≥0.90，从而判定紫苏叶的质量合格。
表1特征色谱峰的保留时间
Figure BDA0003197543710000051
本申请所述“相似度”，是指特征色谱峰的峰面积的相似度，即特征色谱峰的峰面积的一致程度，以特征色谱峰的峰面积比值表示。所述“相似度评价”，是指以峰面积为指标，指标的相似度≥0.90，即特征色谱峰的峰面积比值≥0.90，从而判定药材的质量合格。本申请对相似度评价的方法不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价。
下面对本申请所用的仪器、试剂和材料进行说明。
仪器：Agilent 1290CDS超高效液相色谱仪：美国Agilent公司；AS 60/220.R2型十万分之一天平：苏州培科实验室仪器科技有限公司；Milli-Q超纯水制备仪：美国Millipore公司；KQ-300B超声波清洗槽：昆山市超声仪器有限公司；5424R型高速控温离心机：Eppendorf公司；中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012，130723版)：国家药典委员会。
试剂：甲醇(分析纯)：天津市康科德科技有限公司；磷酸(色谱纯)、乙腈(色谱纯)：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；超纯水：由Milli-Q超纯水仪制备。
材料：对照品丹参素(批号：DST191201-015)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批号：DST171215-090)：成都德思特生物科技有限公司；绿原酸(批号：MUST-18030620)、迷迭香酸(批号：MUST-16040512)：成都曼斯特生物科技有限公司。十个批次紫苏叶的产地信息如表2所示。
表2十个批次紫苏叶的产地信息
Figure BDA0003197543710000052
实施例1构建紫苏叶的指纹图谱
取表2中批次S1的紫苏叶粉末，精密称取0.1g，置10mL容量瓶中，加入10mL 50％甲醇，称重后进行超声，超声提取30min，提取功率为300W，提取频率40kHz，超声后冷却至室温，称重，以50％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。
分别取表2中批次S2-S10的紫苏叶粉末，同法制得批次S2-S10的紫苏叶的供试品溶液。
色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相：A相为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，B相为乙腈；梯度洗脱：0-5min，2-7％B；5-7min，7-21％B；7-15min，21-25％B；15-16min，25-32％B；16-20min，32-37％B；20-33min，37-75％B；33-40min，75-100％B；流速：0.3mL/min；柱温：26℃；进样体积：5μL；检测波长：210nm。
采用上述色谱条件检测各供试品溶液，分别得到批次S1-S10的紫苏叶的指纹图谱，如图1中指纹图谱S1-S10所示。
实施例2构建紫苏叶的标准指纹图谱
取实施例1得到的批次S1-S10的紫苏叶的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行分析，以批次S1的指纹图谱为参照图谱，采用平均数法，时间窗宽度为0.1，经过多点校正后，进行色谱峰的匹配，得到紫苏叶的标准指纹图谱，如图1中标准指纹图谱R所示。经分析，批次S1-S10的紫苏叶的指纹图谱有11个共有峰，即紫苏叶包括11个特征色谱峰，依次编号，在得到的紫苏叶的标准指纹图谱中11个特征色谱峰的保留时间如表3所示。批次S1-S10的紫苏叶的指纹图谱，相对于标准指纹图谱的相似度均在0.927以上，相似度结果如表4所示，结果表明各产地的紫苏叶的指纹图谱具有较高的一致性。
表3标准指纹图谱中特征色谱峰的保留时间
Figure BDA0003197543710000061
表4相似度结果
Figure BDA0003197543710000062
Figure BDA0003197543710000071
本实施例对部分特征色谱峰的化学成分进行了鉴定：精密称定对照品丹参素、绿原酸、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸各5.00mg，分别加入5mL甲醇进行溶解，得到浓度为1mg/mL的各对照品储备液，并置于4℃冷藏备用。分别取各对照品储备液1mL，至10mL容量瓶中，稀释得到浓度均为0.1mg/mL的混合对照品溶液。取混合对照品溶液，按实施例1的色谱条件检测，得到混合对照品溶液的色谱图。对批次S1-S10的紫苏叶的指纹图谱、标准指纹图谱和混合对照品溶液的色谱图进行分析，根据混合对照品溶液中各对照品的保留时间，确定紫苏叶的11个特征色谱峰中，1号峰为丹参素，2号峰为绿原酸，7号峰为芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，8号峰为迷迭香酸。
实施例3精密度试验
取表2中批次S1的紫苏叶粉末，按实施例1的方法制备供试品溶液，并按实施例1的色谱条件检测供试品溶液，连续进样6次，分别得到包括11个共有峰的紫苏叶的色谱图。其中11个共有峰依次编号，得到11个共有峰的峰面积和保留时间，并计算相对标准偏差(RSD)，结果如表5所示，结果表明该方法的精密度良好。
表5精密度结果
Figure BDA0003197543710000072
实施例4重复性试验
取表2中批次S1的紫苏叶粉末，按实施例1的方法制备供试品溶液，平行制备6份，并按实施例1的色谱条件检测供试品溶液，分别得到包括11个共有峰的紫苏叶的色谱图。其中11个共有峰依次编号，得到11个共有峰的峰面积和保留时间，并计算RSD，结果如表6所示，结果表明该方法的重复性良好。
表6重复性结果
Figure BDA0003197543710000081
实施例5稳定性试验
取实施例1中批次S1的供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24h按实施例1的色谱条件进样检测，分别得到包括11个共有峰的紫苏叶的色谱图。其中11个共有峰依次编号，得到11个共有峰的峰面积和保留时间，并计算RSD，结果如表7所示，结果表明供试品溶液室温放置24h稳定。
表7稳定性结果
Figure BDA0003197543710000082
Figure BDA0003197543710000091
实施例6待测紫苏叶质量判定
取待测紫苏叶，按实施例1的方法获得待测紫苏叶的色谱图，根据实施例2表3的保留时间，确定待测紫苏叶的11个特征色谱峰并获得其峰面积，将待测紫苏叶的色谱图，与实施例2获得的紫苏叶的标准指纹图谱采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价，得到相似度≥0.90，即判定紫苏叶的质量合格。
本申请提供的一种构建紫苏叶指纹图谱的方法，采用超高效液相色谱法，通过合理选择色谱条件，实现紫苏叶指纹图谱的构建，且所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，从而可用于紫苏叶药材的质量控制。本申请进一步提供一种构建紫苏叶标准指纹图谱的方法，及其在质量控制中的用途。本申请提供的紫苏叶指纹图谱、标准指纹图谱的构建方法，可用于紫苏叶药材的质量控制，能够全面、准确、可靠地对紫苏叶的质量进行评价。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。

Claims (4)

1.一种构建紫苏叶指纹图谱的方法，包括：
(1)取紫苏叶，以体积分数为50-70％的甲醇为溶剂，进行超声提取，得到紫苏叶的供试品溶液；紫苏叶的质量M1与溶剂的体积V1的比值为1g:(90-110)mL；超声提取的时间为25-35min，提取功率为200-400W，提取频率30-50kHz；
(2)采用超高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到紫苏叶的色谱图，即为紫苏叶的指纹图谱；其中，色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的磷酸水溶液，B相为乙腈；采用梯度洗脱，所述梯度洗脱具体为：0-5min，2-7％B；5-7min，7-21％B；7-15min，21-25％B；15-16min，25-32％B；16-20min，32-37％B；20-33min，37-75％B；33-40min，75-100％B；流速：0.2-0.4mL/min；柱温：24-28℃；进样体积：3-8μL；检测波长：205-220nm。
2.一种构建紫苏叶标准指纹图谱的方法，其中，所述方法包括：
取R份紫苏叶，分别根据权利要求1所述的方法，得到R份紫苏叶的指纹图谱；将所述R份紫苏叶的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，得到所述紫苏叶的标准指纹图谱；其中，R≥10。
3.根据权利要求1所述的构建紫苏叶指纹图谱的方法和/或根据权利要求2所述的构建紫苏叶标准指纹图谱的方法，在紫苏叶的质量控制中的用途；其中，所述紫苏叶的标准指纹图谱包括11个特征色谱峰，保留时间依次为：5.95±0.05min、9.39±0.05min、10.24±0.05min、11.10±0.05min、11.66±0.05min、13.34±0.05min、13.72±0.05min、14.28±0.05min、25.85±0.05min、31.79±0.05min、37.02±0.05min。
4.一种紫苏叶的质量控制方法，其中，所述方法包括：
a.取待测紫苏叶，根据权利要求1所述的方法得到待测紫苏叶的指纹图谱；
b.将步骤a得到的待测紫苏叶的指纹图谱和根据权利要求2所述的构建紫苏叶标准指纹图谱的方法所构建的紫苏叶的标准指纹图谱进行相似度评价，若相似度≥0.90，判定待测紫苏叶的质量合格。
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