CN110568111B - 一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药配方颗粒质量控制技术领域，提供一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法，用于解决传统方式检测效率低、成本高的问题。本发明提供的一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法，包括：S11.取巴戟天配方颗粒0.1~0.5g，经过处理后，得到供试品溶液；S12.取耐斯糖标准品，加入溶剂制成100μg/ml的对照品溶液；S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量。同时测定4种寡聚糖成分含量，可以更为合理、快速的进行质量评价。
Description
技术领域
本发明涉及中药配方颗粒质量控制技术领域，具体涉及一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法。
背景技术
巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根；性味甘、辛、微温，归肾、肝经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，临床用于治疗阳痿遗精、宫冷不孕、月经不调、少腹冷痛、风湿痹痛、筋骨痿软等症状。
巴戟天配方颗粒是采用现代先进生产技术、仿照中药传统汤剂，将巴戟天饮片经过水提取、浓缩、干燥、制粒而成，供临床配伍使用，其药效物质基础与巴戟天饮片基本一致。主要有3类有效成分，分别为寡聚糖类、环烯醚萜类、以及茜草素型蒽醌类。其中耐斯糖、蔗糖、蔗果三糖、巴戟天寡糖5聚糖为寡聚糖类代表性成分，含量较高，并且具有抗抑郁、促进免疫的药理作用，是巴戟天补肾阳作用的重要物质基础。
目前巴戟天配方颗粒质量标准收载于《天津市配方颗粒质量标准》中，该标准中巴戟天配方颗粒与中国药典2015年巴戟天饮片的含量测定指标一致，均为耐斯糖，并且色谱条件与系统适用性、测定方法一致。耐斯糖无生色基团，无UV吸收，因此各法定标准中和文献报道中均采用高效液相（HPLC）-蒸发光散射检测器（ELSD），以外标对数两点法定量计算，而采用超高效液相（UPLC）-电喷雾化学检测器（CAD）的测定方法较少报道，该检测器在中国药典中也无相关收载，是近几年推出的一款新型的通用型检测器。
发明内容
本发明解决的技术问题为解决传统方式检测效率低、成本高的问题，提供一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.1~0.5g，经过处理后，得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入溶剂制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量。
将一测多评法应用到巴戟天配方颗粒的寡聚糖的检测中，提高了检测效率，同时，避免了传统手段中配方颗粒中的辅料对检测结果的影响。
同时测定4种寡聚糖成分含量，可以更为合理、快速的进行质量评价。
优选地，所述巴戟天配方颗粒的处理方法为：取巴戟天配方颗粒0.1~0.5g，研磨后加入溶剂，称重后，超声或加热回流提取10~45min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液。巴戟天配方颗粒的处理方式是影响检测效果的重要因素，采用一定的溶剂进行处理，可以更加高效稳定的提取配方颗粒中的寡聚糖。
优选地，所述称重后，超声提取10~30min，超声的功率为250W，频率45kHz。超声提取效率高，操作简便。
优选地，所述液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm，填充剂为酰胺基键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱；流速为0.38~0.42mL/min；柱温为32~38℃；检测器为电喷雾化学检测器；理论塔板数按耐斯糖峰计算应不低于25000。通过对色谱条件进行优化，可以获取精度更高的色谱结果。
优选地，所述流速为0.4mL/min。
优选地，所述梯度洗脱的流程为：0~1min，流动相A由90%降至81%，流动相B由10%提升至19%；1~7min，流动相A由81%降至76%，流动相B由19%提升至24%；7~13min，流动相A由76%降至67%，流动相B由24%提升至33%；13~30min，流动相A由67%降至49%，流动相B由33%提升至51%。通过本申请的梯度洗脱方式可以有效的提高检测效率和精度。
优选地，所述溶剂的用量为15~50mL，所述溶剂为3~40%的甲醇、40~70%的乙醇，10~40%的乙腈、水的其中一种。采用不同溶剂均可以高效的提取寡聚糖。
优选地，所述溶剂为3~10%的甲醇，所述溶剂的用量为15~50mL。甲醇可更进一步提高提取效果。
优选地，所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子为0.896~1.053，相对保留时间为0.508~0.523；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.137~1.283，相对保留时间为0.781~0.792；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.095~1.232，相对保留时间为1.162~1.174。
优选地，所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子为0.95，相对保留时间为0.51；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.20，相对保留时间为0.79；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.13，相对保留时间为1.16。优化校正因子和相对保留时间，可以提高检测结果的精度。
优选地，所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为3.11~5.86%，相对保留时间的偏差为0.18~1.5%；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为2.85~3.73%，相对保留时间的偏差为0.06~0.75%；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为0.91~5.13%，相对保留时间的偏差为0.05~0.57%。
优选地，所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子为3.80%，相对保留时间的偏差为0.18%；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为3.73%，相对保留时间的偏差为0.06%；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为2.72%，相对保留时间的偏差为0.05%。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：同时测定4种寡聚糖成分含量，可以更为合理、快速的进行质量评价；
巴戟天配方颗粒多糖含量测定多采用紫外分光光度法或采用高效液相色谱法-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）测定耐斯糖含量。巴戟天配方颗粒中由于辅料的添加，采用紫外分光光度法进行质量分析时，辅料会干扰检测结果；采用HPLC-ELSD进行质量分析时，待测成分耐斯糖的色谱峰分离效果较差。而本方法对耐斯糖色谱峰的分离效果明显优于现有技术。
本发明采用一测多评方法，同时测定巴戟天配方颗粒中4种寡聚糖类成分含量。巴戟天中含有较多的寡聚糖类化合物，也是巴戟天主要的水溶性成分，与其药理活性密切相关，单一含量测定指标不能全面反映其质量，而以耐斯糖为内参物建立的一测多评方法同时测定4种寡聚类成分含量可以更为合理、快速的进行质量评价。
CAD的响应不依赖于化合物的化学结构，而与分析物颗粒的质量有关，具有较为一致的响应值，在低浓度或较窄浓度范围内，校正曲线接近线性，因此该检测器非常适合应用于一测多评。
附图说明
图1 现有技术（HPLC-ELSD）巴戟天配方颗粒单一指标耐斯糖含量测定液相色谱图。
图2 本发明（UPLC-CAD）巴戟天配方颗粒寡聚糖含量测定液相色谱图。
图3 本发明10批巴戟天配方颗粒含量测定液相色谱图。
图4本发明方法专属性色谱图。
具体实施方式
以下实施列是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.13g，研磨后加入3%甲醇50mL，称重后，超声或加热回流提取10~45min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入3%甲醇制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1或3μL，供试品溶液1μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量；所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子为0.95，相对保留时间为0.51；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.20，相对保留时间为0.79；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.13，相对保留时间为1.16。所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子相对偏差为3.80%，相对保留时间的偏差为0.18%；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为3.73%，相对保留时间的偏差为0.06%；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为2.72%，相对保留时间的偏差为0.05%。所述称重后，超声提取30min，超声的功率为250W，频率45kHz。所述液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm，填充剂为酰胺基键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱；流速为0.4mL/min；柱温为35℃；检测器为电喷雾化学检测器；理论塔板数按耐斯糖峰计算应不低于25000。所述梯度洗脱的流程为：0~1min，流动相A由90%降至81%，流动相B由10%提升至19%；1~7min，流动相A由81%降至76%，流动相B由19%提升至24%；7~13min，流动相A由76%降至67%，流动相B由24%提升至33%；13~30min，流动相A由67%降至49%，流动相B由33%提升至51%。
将一测多评法应用到巴戟天配方颗粒的寡聚糖的检测中，提高了检测效率，同时，避免了传统手段中配方颗粒中的辅料对检测结果的影响。同时测定4种寡聚糖成分含量，可以更为合理、快速的进行质量评价。巴戟天配方颗粒的处理方式是影响检测效果的重要因素，采用一定的溶剂进行处理，可以更加高效稳定的提取配方颗粒中的寡聚糖。超声提取效率高，操作简便。通过对色谱条件进行优化，可以获取精度更高的色谱结果。通过本申请的梯度洗脱方式可以有效的提高检测效率和精度。采用不同溶剂均可以高效的提取寡聚糖。甲醇可更进一步提高提取效果。优化校正因子和相对保留时间，可以提高检测结果的精度。
实施例2
一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.13g，研磨后加入10%甲醇50mL，称重后，加热回流提取30min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入10%甲醇制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1或3μL，供试品溶液1μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量；所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子为0.941，相对保留时间为0.519；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.139，相对保留时间为0.789；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.15，相对保留时间为1.167。所述液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm，填充剂为酰胺基键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱；流速为0.4mL/min；柱温为32℃；检测器为电喷雾化学检测器；理论塔板数按耐斯糖峰计算应不低于25000。所述梯度洗脱的流程为：0~1min，流动相A由90%降至81%，流动相B由10%提升至19%；1~7min，流动相A由81%降至76%，流动相B由19%提升至24%；7~13min，流动相A由76%降至67%，流动相B由24%提升至33%；13~30min，流动相A由67%降至49%，流动相B由33%提升至51%。所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为3.11%，相对保留时间的偏差为0.8%；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为2.85%，相对保留时间的偏差为0.51%；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为0.91%，相对保留时间的偏差为0.45%。
实施例3
一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.13g，研磨后加入5%甲醇50mL，称重后，超声提取30min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入5%甲醇制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1或3μL，供试品溶液1μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量；所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子为0.996，相对保留时间为0.511；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.197，相对保留时间为0.783；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.139，相对保留时间为1.173。所述液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm，填充剂为酰胺基键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱；流速为0.4mL/min；柱温为38℃；检测器为电喷雾化学检测器；理论塔板数按耐斯糖峰计算应不低于25000。所述梯度洗脱的流程为：0~1min，流动相A由90%降至81%，流动相B由10%提升至19%；1~7min，流动相A由81%降至76%，流动相B由19%提升至24%；7~13min，流动相A由76%降至67%，流动相B由24%提升至33%；13~30min，流动相A由67%降至49%，流动相B由33%提升至51%。所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为3.11%，相对保留时间的偏差为0.8%；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为2.85%，相对保留时间的偏差为0.51%；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子的偏差为0.91%，相对保留时间的偏差为0.45%。
实施例4
实施例4同实施例1不同之处在于，液相色谱的色谱条件中流速为0.38mL/min。所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.053，相对保留时间为0.523；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.245，相对保留时间为0.792；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.232，相对保留时间为1.162。
实施例5
实施例5同实施例1不同之处在于，液相色谱的色谱条件中流速为0.42mL/min。所述蔗糖相对于耐斯糖的相对校正因子为0.958，相对保留时间为0.508；所述蔗果三糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.283，相对保留时间为0.781；所述巴戟天寡糖5聚糖相对于耐斯糖的相对校正因子为1.128，相对保留时间为1.174。
实施例6
实施例6同实施例1不同之处在于，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.13g，研磨后加入40%甲醇50mL，称重后，超声提取30min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入40%甲醇制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量。
实施例7
实施例7同实施例1不同之处在于，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.13g，研磨后加入70%乙醇50mL，称重后，超声提取30min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入70%乙醇制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量。
实施例8
实施例8同实施例1不同之处在于，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.13g，研磨后加入10%乙腈50mL，称重后，超声提取30min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入10%乙腈制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量。
实施例9
实施例9同实施例1不同之处在于，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.13g，研磨后加入40%乙腈50mL，称重后，超声提取30min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入40%乙腈制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量。
实施例10
实施例10同实施例1不同之处在于，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.13g，研磨后加入水50mL，称重后，超声提取30min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入水制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量。
实施例11
实施例11同实施例1不同之处在于，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.1g，研磨后加入3%甲醇50mL，称重后，超声提取30min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入3%甲醇制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量。
实施例12
实施例12同实施例1不同之处在于，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.5g，研磨后加入3%甲醇50mL，称重后，超声提取30min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入3%甲醇制成100μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量。
实施例13
实施例13同实施例1不同之处在于，制备供试品溶液时，超声提取15min。
实施例14
实施例14同实施例1不同之处在于，制备供试品溶液时，超声提取45min。
对比例
采用外标法检测0.13g中巴戟天配方颗粒中寡聚糖的含量。
实验例1
1.1仪器、试剂与试药
1.1.1仪器
Thermo Vanquish UPLC，Thermo UHPLC电喷雾化学检测器；Waters ACQUITY UPLCBEH Amide色谱柱（2.1×100mm，1.7μm），万分之一天平（梅特勒-托利多公司，ME204E），百万分之一天平（梅特勒-托利多公司，XP26），电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司，HWS-28），超声清洗仪（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）。
1.1.2试剂
乙醇（西陇科学股份有限公司）、甲醇（天西陇科学股份有限公司）分析纯；液相用乙腈（默克股份有限公司）、甲醇（默克股份有限公司）为HPLC色谱级，水为超纯水（实验室自制）。
1.1.3试药
耐斯糖（中国食品药品检定研究院，含量：92.2%，批号：111891-201704）；巴戟天配方颗粒（批号BJT-01~BTJ-10，来源于广东一方制药有限公司）。蔗果三糖（上海诗丹德标准技术服务有限公司，含量：98%，批号：470-69-9）；蔗糖（中国食品药品检定研究院，含量：100%，批号：111507-201704）；巴戟天寡糖5聚糖（中国食品药品检定研究院，含量：94.2%，批号：111965-201501）；
1.1.4混合对照品溶液的制备
精密称取蔗糖对照品4.635mg、蔗果三糖对照品2.265mg、耐斯糖对照品2.133mg、巴戟天寡糖5聚糖对照品2.135mg，置25ml容量瓶中，加3%甲醇制成每1ml含蔗糖185.400μg，蔗果三糖88.788μg，耐斯糖78.665μg，巴戟天-寡糖5聚糖80.447μg的混合溶液，即得。
1.1.5巴戟天配方颗粒含量测定供试品溶液的制备
根据实施例1~12中的方式配制供试品溶液。
1.1.6色谱条件与系统适应性试验：
根据实施例1~12中的记载调整色谱条件。
1.1.7测定方法
分别精密吸取对照品溶液1μl~3μl，供试品溶液1μl~3μl，注入液相色谱仪，测定，采用外标两点法计算，即得。
1.2不同提取方式的提取效果
1.2.1提取溶剂筛选
采用常规方法检测实施例1、6~10中的供试品溶液中的提取出的寡聚糖的含量。实验结果见表1。
表1巴戟天配方颗粒含量测定提取溶剂考察结果
实验结果表明：通过对比7种提取溶剂样品中4种寡聚糖含量，这7种溶剂的提取效率较为接近，最终可以优选与中国药典2015年巴戟天饮片耐斯糖含量测定中提取溶剂一致的3%甲醇作为提取溶剂。
1.2.2提取方式考察
根据实施例1和2中记载的提取方式，对比不同提取方式对提取效果的影响，实验结果见表2。
表2巴戟天配方颗粒耐斯糖含量测定提取方式考察结果
实验结果表明：通过对比超声与回流两种提取方式的耐斯糖含量，两种方式均可以有效的提取巴戟天中的寡聚糖，可优选超声作为提取方式，提取方式操作简便。
1.2.3提取时间考察
根据实施例1、13、14中记载的提取时间，采用常规方法检测供试品溶液中的寡聚糖的含量。实验结果见表3。
表3巴戟天配方颗粒耐斯糖含量测定提取时间考察结果
实验结果表明：通过对比不同超声时间的耐斯糖含量，可发现本申请所记载的超声时间内均可以有效提取，优选超声时间为30分钟。
1.3巴戟天中寡聚糖含量的检测方法学验证
1.3.1专属性考察
精密吸取巴戟天配方颗粒实施例1中的供试品溶液、对照品溶液与空白溶剂各1μl，注入液相色谱仪，测定。结果见图4。
实验结果表明空白溶剂色谱中在与待测成分相应的保留时间没有色谱峰，表明提取溶剂对4种寡聚糖含量测定无干扰，以本法测定巴戟天配方颗粒中4种寡聚糖含量具有专属性。
1.3.2精密度考察
精密吸取耐斯糖对照品溶液1μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、巴戟天寡糖5聚糖色谱峰峰面积，并计算RSD值。
表4精密度考察结果（n=6）
实验结果表明仪器精密度良好。
1.3.3线性考察
建立4种寡聚糖的标准曲线如表5所示。
表5耐斯糖线性考察结果
由于线性浓度范围较大，因此采用抛物线方程进行线性回归，结果表明：在进样质量在0.042523μg~0.425226μg范围内耐斯糖的进样质量与峰面积线性关系良好；在进样质量在0.04454μg~0.44538μg范围内巴戟天寡糖5聚糖的进样质量与峰面积线性关系良好；在进样质量在0.044660μg~0.446600μg范围内蔗糖的进样质量与峰面积线性关系良好；在进样质量在0.04302μg~0.43022μg范围内蔗果三糖的进样质量与峰面积线性关系良好。
1.3.4稳定性考察
取实施例1中的巴戟天配方颗粒供试品溶液，于室温下放置，分别在0，3，8，12，17，24小时进样测定，记录蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、巴戟天寡糖5聚糖色谱峰峰面积，并计算峰面积RSD值，测定结果见表6。
表6稳定性考察结果
实验结果显示供试品溶液在24小时内测定蔗糖峰面积RSD值为1.66%，蔗果三糖RSD值为2.48%，耐斯糖峰面积RSD值为2.16%，巴戟天寡糖5聚糖峰面积RSD值为2.10%，表明供试品溶液在24小时内稳定。
1.3.5检测方法的重复性考察
取同一批巴戟天配方颗粒约0.13g，精密称定，平行称定6份，按实施例1中的制备方法，制备供试品溶液6份，测定供试品溶液中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、巴戟天寡糖5聚糖的含量，并计算RSD值，测定结果见表7。
表7重复性考察结果
实验结果显示，重复测定6份供试品，蔗糖含量RSD值为0.72%，蔗果三糖含量RSD值为0.64%，耐斯糖含量RSD值为0.59%，巴戟天寡糖5聚糖含量RSD值为1.22%，表明该分析方法重复性良好。
1.3.5检测方法的准确度考察
取另一批次的均匀的巴戟天配方颗粒样品，按对照品加入量所取供试品中待测成分量之比在1:1左右，设计6组实验，并计算各指标准确度，实验结果见表8。
表8 蔗糖准确度
实验结果显示蔗糖、蔗果三糖、巴戟天寡糖5聚糖、耐斯糖的准确度在92.2%~104.3%的范围内，RSD值在0.79%~4.93%范围内，准确度良好，各色谱峰能准确定量测定。同时对于不同批次的产品，本申请的检测的4中糖类均能有较高的回收率，进一步论证了本申请一测
1.4相对校正因子的测定
1.4.1相对校正因子的测定
采用多点校正法计算巴戟天寡聚糖类成分间的相对校正因子，计算公式：
f i/s=
=
Mi为待测组分的进样质量，Ai为待测组分的峰面积，Ms为内参物的进样质量，As为内参物的峰面积。
取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、巴戟天寡糖5聚糖线性对照品溶液，注入液相色谱仪，以耐斯糖为内参物，计算蔗糖、蔗果三糖、巴戟天寡糖5聚糖的相对校正因子，并计算RSD值。结果见表9。
表9相对校正因子的测定
实验结果显示，采用多点法计算蔗糖、蔗果三糖、巴戟天寡糖5聚糖相对与耐斯糖的相对校正因子、均值及RSD值，相对校正因子分别为0.95，1.20，1.13，RSD值分为为3.80%，3.73%，2.72%。
1.4.2相对校正因子不同柱温耐用性考察
采用Waters ACQUITY UPLC Amide 色谱柱（柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm），取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、巴戟天寡糖5聚糖线性对照品溶液，注入液相色谱仪，以耐斯糖为内参物，测定柱温分别在32℃、35℃、38℃下各成分间的相对校正因子，并计算RSD值。
表10相对校正因子柱温耐用性考察结果
实验结果显示，在不同柱温下各成分的相对校正因子RSD值在0.91%~3.11%范围内，表明柱温的耐用性较好。
1.4.3相对校正因子不同流速耐用性考察
采用Waters ACQUITY UPLC Amide 色谱柱（柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm），取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、巴戟天寡糖5聚糖线性对照品溶液，注入液相色谱仪，以耐斯糖为内参物，测定流速分别在0.38ml/min、0.40ml/min、0.42ml/min下各成分间的相对校正因子，并计算RSD值。
表11相对校正因子流速耐用性考察结果
实验结果显示，在不同流速下各成分的相对校正因子RSD值在3.44%~5.86%范围内，表明流速的微小变动对相对校正因子的测定结果影响较大，因此固定流速为0.40ml/min。
1.5待测成分色谱峰定位的测定
1.5.1相对保留时间的测定
取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、巴戟天寡糖5聚糖线性对照品溶液，注入液相色谱仪，测定。以耐斯糖为参照峰S，计算其他成分与S峰的相对保留时间。
表12待测成分相对保留时间测定结果
实验结果显示，以耐斯糖为参照峰，蔗糖、蔗果三糖、巴戟天寡糖5聚糖的相对保留时间分别为0.51，0.78，1.16。
1.5.2相对保留时间不同柱温耐用性考察
采用Waters ACQUITY UPLC Amide 色谱柱（柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm），取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、巴戟天寡糖5聚糖线性对照品溶液，注入液相色谱仪，以耐斯糖为参照峰S，测定柱温分别在32℃、35℃、38℃下各成分间的相对保留时间，并计算RSD值。
表13相对保留时间不同柱温耐用性考察结果
实验结果显示，以耐斯糖为参照峰，蔗糖、蔗果三糖、巴戟天寡糖5聚糖的相对保留时间在不同柱温下RSD值在0.45%~0.80%范围内，表明柱温的耐用性良好。
1.5.3相对保留时间不同流速耐用性考察
采用Waters ACQUITY UPLC Amide 色谱柱（柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm），取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、巴戟天寡糖5聚糖线性对照品溶液，注入液相色谱仪，以耐斯糖为参照峰S，测定流速分别在0.32ml/min、0.40ml/min、0.42ml/min下各成分间的相对保留时间，并计算RSD值。
表14相对保留时间不同流速耐用性考察结果
实验结果显示，以耐斯糖为参照峰，蔗糖、蔗果三糖、巴戟天寡糖5聚糖的相对保留时间在不同流速下RSD值0.57%~1.50%范围内，表明流速的耐用性良好。
通过上述实验，表明采用本申请的色谱条件和供试品溶液的制备方法，可以有效的从配方颗粒中提取出4中寡聚糖，同时提取出的4中寡聚糖的线性相关性较好，为一测多评提供了条件。
实验例2
2.1检测结果准确性测试
对另一批次的10批不同批号的巴戟天配方颗粒分别采用外标法与实施例1中的一测多评法进行含量测定，如图2和3所示，并运用SPSS 20.0分析两种方法含量测定结果的差异。
表15巴戟天配方颗粒寡聚糖含量测定结果
表19外标法与一测多评法测定结果统计学分析
统计分析结果显示，以耐斯糖为内参物，计算的蔗糖、蔗果三糖、巴戟天寡糖5聚糖含量结果与外标法测定结果无显著性差异（P＞0.05），表明当前的一测多评方法应用于巴戟天配方颗粒中4种寡聚糖含量测定具有良好的准确性。
从上述实验结果可知，采用本申请中的一测多评法可以有效的检测巴戟天配方颗粒中的4中寡聚糖，检测结果同外标法并无明显区别，检测方法的准确度较高。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
Claims (2)
1.一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法，其特征在于，包括：
S11.取巴戟天配方颗粒0.1~0.5g，经过处理后，得到供试品溶液；
S12.取耐斯糖标准品，加入溶剂制成50~150μg/ml的对照品溶液；
S13.取对照品溶液1~3μL，供试品溶液1~3μL，分别注入液相色谱仪，采用外标两点法得到供试品溶液中耐斯糖的含量；
S14.以耐斯糖为内参物，同时测定蔗果三糖、蔗糖、巴戟天寡糖5聚糖含量；
所述液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm，填充剂为酰胺基键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度洗脱；流速为0.38~0.42mL/min；柱温为32~38℃；检测器为电喷雾化学检测器；
所述梯度洗脱的流程为：0~1min，流动相A由90%降至81%，流动相B由10%提升至19%；1~7min，流动相A由81%降至76%，流动相B由19%提升至24%；7~13min，流动相A由76%降至67%，流动相B由24%提升至33%；13~30min，流动相A由67%降至49%，流动相B由33%提升至51%；
所述巴戟天配方颗粒的处理方法为：取巴戟天配方颗粒0.1~0.5g，研磨后加入溶剂，称重后，超声或加热回流提取10~45min，取出，再次称重，用同浓度的溶剂补充减少的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得到供试品溶液；
所述溶剂为3~10%的甲醇，所述溶剂的用量为15~50mL。
2.根据权利要求1所述的一种巴戟天配方颗粒中寡聚糖的检测方法，其特征在于，所述称重后，超声提取10~30min，超声的功率为250W，频率45kHz。
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Denomination of invention: A detection method for oligosaccharides in formula granules of Morinda officinalis Effective date of registration: 20231225 Granted publication date: 20220503 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Foshan branch Pledgor: GUANGDONG YIFANG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023980073969 |