CN110687224B - 雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法，以0.1mg.mL‑1的雷公藤内酯甲的乙醇溶液为对照品溶液，通过溶剂系统正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水的建立并优化获得了相应体积比范围，使雷公藤内酯甲在溶剂系统中的分配系数K在0.5‑2之间，通过对液液分配色谱分离柱转速和流动相流速的优化与控制，结合高效液相色谱检测雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的方法。该方法操作过程简单，专属性强，重现性好，分离成本大大降低，雷公藤内酯甲色谱分离度高，产品回收率高，样品用量少，稳定性好，精密度高，定性、定量准确度高，能够对雷公藤药材及雷公藤多苷片的品质进行有效评价。
Description
技术领域
本发明涉及一种雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法，属于中药材和药品质量控制的技术领域。
背景技术
雷公藤(Tripterygiμm wilfordii Hook.f.)系卫矛科(Celastraceae)雷公藤属多年生藤本植物，药用部位为全根或去皮根木质部。现代药理及临床研究发现，雷公藤具有抗炎免疫调节、抗肿瘤及抗生育、抗氧化，抗HIV病毒和对阿尔茨海默病有治疗效果等多种生物活性。雷公藤多苷是其根经提取精制的有效部位混合物，是我国首先研究利用的抗炎免疫调节中药提取物。雷公藤多苷片与其他雷公藤制剂相比具有用量小、不良反应少等优点，早在1984年就投入临床使用，广泛应用于治疗麻风、类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、肾病综合征、白塞综合征及皮肤病等疾病，疗效显著。雷公藤药材及其雷公藤多苷片含有许多有效成分，具有其他很多药物无法比拟的效果，雷公藤内酯甲作为其活性成分之一，目前《卫生部药品标准·中药成方制剂(第十七册)》和现行标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准WS3－B-3350－98－2011，均以雷公藤内酯甲的含量作为控制指标。
雷公藤及其雷公藤多苷片成分非常复杂，且雷公藤内酯甲紫外吸收较弱，雷公藤药材或雷公藤多苷片提取物直接进样分析，难以检测到雷公藤内酯甲色谱峰。已有文献报道采用中性氧化铝柱，硅胶柱等洗脱后结合薄层扫描法，紫外高效液相法或直接使用蒸发光散射测定器，液质联用进行含量测定。但薄层扫描法定量重现性差，准确度低；使用中性氧化铝柱等操作复杂，容易将少量样品吸附到固体载体上，难以从基体中分离出来，造成含量分析存在一定误差。直接使用蒸发光散射测定器，雷公藤内酯甲的峰分离不理想，很难进行准确的含量测定。液液分配色谱法(Liquid-liquid chromatography,LLC)原理是基于样品在两种互不混溶的溶剂之间的分配作用，溶质中各组分在通过两溶剂相过程中因分配系数不同而得以分离,是一种不用固态支撑体的全液体色谱方法。与其他传统分离方法相比，液液分配色谱具有仪器价格低廉，性能可靠，易于操作，分离速度快、溶剂消耗低、回收率高等优点，已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品的众多领域。目前，液液分配色谱多用于某种或多种物质的分离纯化，但将其作为样品前处理技术富集复杂样品中含量相对较小的目标组分的研究尚未有相关报道。因此，有必要建立一种操作简单、快速、有效的雷公藤内酯甲定量分析方法，用于雷公藤药材及制剂的分析。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种应用液液分配色谱富集雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲并通过高效液相色谱检测的方法。
本发明通过以下技术方案加以实现：
本发明以雷公藤内酯甲为对照品，通过溶剂系统正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水的建立并优化获得了相应体积比范围，使雷公藤内酯甲在溶剂系统中的分配系数K在0.5-2之间，通过对液液分配色谱仪分离柱的旋转速度的控制和流动相流速的控制，结合高效液相色谱富集并检测雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的方法。
进一步，较为具体的，所述的雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法，按照如下步骤进行：
(1)雷公藤内酯甲对照品溶液的制备：
精密称取雷公藤内酯甲的对照品适量，用乙醇溶解，并稀释成含雷公藤内酯甲0.1mg.mL-1的对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
①溶剂系统的配制：将正己烷、乙酸乙酯、乙醇及水按体积比2～4:1～3:2～4:1～3混合，然后剧烈振摇5～10min，然后置于分液漏斗中，静置分层，分层后上相溶液作为固定相，下相溶液作为流动相，超声波脱气10～20min；
②样品的粗提：取雷公藤多苷片20片研细，精密称取1.5g，加入30～100mL乙酸乙酯，超声处理30～60min，用适量乙酸乙酯分次洗涤，合并滤液和洗液并蒸干，得到残渣，然后将残渣用10mL上相溶液和10mL下相溶液溶解，超声溶解脱气后作为分离样品溶液备用；
或将雷公藤药材粉碎(过四号筛)，取5～15.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入乙酸乙酯超声处理3次，每次乙酸乙酯的加入量为200mL，超声时间为30min，然后过滤并合并三次滤液，浓缩近干，得到残渣；然后将残渣用10mL上相溶液和10mL下相溶液溶解，超声溶解脱气后作为分离样品溶液备用；
③样品的富集：将液液分配色谱分离柱填满固定相，开启速度控制器，控制转速为700～800rmp，设置柱温为25℃，以1～3mL/min的流速将流动相泵入柱内，待整个固定相-流动相体系达到流体动力学平衡，即待色谱柱出口不再有固定相流出时，将步骤②制备的分离样品溶液通过进样阀进样，根据高效液相色谱法测出雷公藤内酯甲的保留时间，收集与保留时间为对应的流出液，蒸干，残渣用乙腈溶解，转移至2～10mL的容量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，过0.22μm的滤膜，得到的滤液即为供试品溶液；
(3)高效液相色谱方法测定雷公藤内酯甲的含量：
色谱条件：十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈：0.1％磷酸水＝90～60：10～40；测定波长为210nm；流速：1.0mL·min-1；检测器：紫外；柱温：35℃；进样量：20μL；
测定：分别精密吸取所述的对照品溶液和所述的供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定并记录色谱图，计算得到雷公藤内酯甲的含量；
所述的雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的含量不得少于0.1mg/g。
本发明将液液分配色谱作为前处理技术富集雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲。
进一步，所述的正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水体积比优选为3：2：3：2，富集的样品杂质含量相对较少，符合含量测定的要求。
进一步，优选的，本案所述的超声参数为：功率300W，频率40kHz。
本发明收集保留时间为137-170min的液液分配色谱的流出液。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过液液分配色谱对雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片进行前处理，富集雷公藤内酯甲，再通过高效液色谱法进行含量检测。该方法操作过程简单，专属性强，重现性好，分离成本大大降低，分离效果好，产品回收率高，样品用量少，稳定性好，精密度高，定性、定量准确度高，能够对雷公藤药材及雷公藤多苷片的品质进行有效评价。
附图说明
图1雷公藤内酯甲线性回归方程；
图2雷公藤多苷片的液液分配色谱图；
图3雷公藤药材的液液分配色谱图；
图4雷公藤多苷片未处理前的高效液相色谱图；
图5雷公藤内酯甲对照品高效液相色谱图；
图6雷公藤多苷片供试品的高效液相色谱图；
图7雷公藤药材供试品的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的阐述，应当理解此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1、仪器与试药
1.1仪器：上海伍丰LC100液相色谱仪；TBE-200V型高速逆流分配色谱；
1.2试药与试剂：雷公藤内酯甲标准品(来源：成都曼斯特生物科技有限公司)磷酸为分析纯；乙腈为色谱纯；正己烷为分析级；乙酸乙酯为分析级；乙醇为分析级；水为重蒸水；色谱柱为phenomenex SYNERGI(250×4.6mm 4u)；样品来源及产地见下面表5和表7。
2、方法与结果：
2.1雷公藤内酯甲对照品溶液的制备：精密称取雷公藤内酯甲对照品适量用乙醇溶解并稀释成含雷公藤内酯甲0.1mg/mL的对照品溶液；
2.2供试品溶液的制备：
①溶剂系统的配制:将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水溶液按体积比3:2:3:2混合，然后剧烈振摇5min，置于分液漏斗中，静置分层，分层后上相溶液作为固定相，下相溶液作为流动相，超声波脱气15min；
②样品的粗提：取雷公藤多苷片20片研细，精密称取1.5g，加入100mL乙酸乙酯，超声处理30min，用90mL乙酸乙酯分3次洗涤容器和滤器，合并滤液和洗液，蒸干；③样品的富集处理：用计量泵以10mL/min流速将固定相注满色谱分离柱后，开启直流电机转速调至800rmp，柱温设置为25℃，将流动相以2mL/min的流速从色谱分离柱入口泵入，在色谱分离柱出口收集流出的固定相；待色谱柱尾端不再有固定相流出时，将上述制备的样品溶液通过进样阀进样，收集137-170min的流出液，蒸干，残渣用乙腈溶解，转移至10mL的容量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，过0.22μm的滤膜，得到的滤液即为供试品溶液；
3、高效液相色谱法测定：
色谱条件：十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈：0.1％磷酸水＝75:25；检测波长为210nm；流速：1.0mL·min-1；测定器：紫外；柱温：35℃；进样量：20μL；
测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱，检测，记录35min的色谱图，即得；
雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的含量不得少于0.1mg/g。
4、方法学的考察
4.1线性关系考察:取质量浓度为100μg/mL的对照品溶液，分别进样2，4，6，8，10，15，20μL，测定。以峰面积(Y)为纵坐标、进样量(μg，X)为横坐标进行线性回归，得回归方程Y＝685.06X+18.648，r＝0.9999(n＝7)。结果表明，雷公藤内酯甲进样量在0.2～2μg范围内线性关系良好，见图1。
4.2精密度试验：取同一对照品溶液，按照上述色谱条件一天内连续进样6次，连续三天进样，每天2次，结果日内峰面积的RSD为0.67％(n＝6)，日间峰面积的RSD为1.14％(n＝6)表明仪器精密度良好，结果见表1。
表1精密度实验参数表
4.3稳定性试验:取同一供试品溶液，按照上述色谱条件分别在0，2，4，6，8，12，24h时测定其稳定性。结果雷公藤内酯甲峰面积的RSD为1.33％(n＝7)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好，结果见表2。
表2稳定性试验结果
4.4重复性试验：称取同一批样品(1号样品)5份，按照2.2供试品溶液的制备方法同法操作，并依据上述色谱条件测定雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的含量。结果平均含量为0.5044mg/g，RSD为1.70％(n＝6)表明方法重复性良好，结果见表3。
表3重复性试验结果
4.5回收率试验；称取已知雷公藤内酯甲含量(含量为0.2105mg/g)的雷公藤多苷片(2号样品)粉末约1.125g，精密称定，加入5mL浓度为0.0416mg/mL的雷公藤内酯甲的乙酸乙酯溶液(对照品溶液)，再加入95mL乙酸乙酯超声处理30min，合并滤液和洗液，蒸干；并按照2.2步骤①和③供试品溶液的制备方法分别制备5份，然后分别测定溶液中雷公藤内酯甲量的含量，再根据加样回收率公式计算得出回收率，结果表明雷公藤内酯甲的加样回收率良好，结果见表4。
表4雷公藤内酯甲回收试验结果
4.6样品中雷公藤内酯甲的含量测定
分别取6个不同厂家的雷公藤多苷片，按照2.2的制备步骤分别制备供试品溶液并测定，按外标法计算含量，样品及样品中雷公藤内酯甲的含量数据见表5所示。
表5样品参数及样品中雷公藤内酯甲的含量数据
实施例2：
雷公藤内酯甲对照品溶液的制备：精密称取雷公藤内酯甲对照品适量用乙醇溶解并稀释成含雷公藤内酯甲0.1mg/mL的对照品溶液；
供试品溶液的制备：①溶剂系统的配制:将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水溶液按体积比7:3:7:3混合，然后剧烈振摇5min，置于分液漏斗中，静置分层，分层后上相溶液作为固定相，下相溶液作为流动相，超声波脱气15min；
②样品的粗提：取雷公藤多苷片20片研细(样品3)，精密称取1.5g，加入50mL乙酸乙酯，超声处理30min，用90mL乙酸乙酯分3次洗涤，合并滤液和洗液，蒸干，残渣用10mL上相溶液和10mL下相溶液溶解，超声溶解脱气后作为被富集样品溶液备用；
③样品的富集处理：用计量泵以10mL/min的流速将固定相注满螺旋管后，开启转速调至800rmp，设置柱温为25℃，将流动相以2mL/min的流速从色谱分离柱泵入，在色谱分离柱出口用量筒收集流出的固定相；待色谱分离柱出口不再有固定相流出时，通过进样阀进上述制备的样品溶液，收集63-90min的流出液，蒸干，残渣用乙腈溶解，转移至5mL的容量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，过0.22μm的滤膜，得到的滤液即为供试品溶液；
高效液相色谱法测定：
色谱条件：十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈：0.1％磷酸水＝80:20；检测波长为210nm；流速：1.0mL·min-1；检测器：紫外；柱温：35℃；进样量：20μL；
含量测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱，检测，记录35min的色谱图，即得；
雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的含量不得少于0.1mg/g。
结果测的样品中雷公藤内酯甲的含量为0.2435mg/g，与实施例1中4.6同一个样品中测的雷公藤内酯甲含量0.2460mg/g，含量测定结果一致。
实施例3：
分别取三种不同产地的雷公藤药材进行雷公藤内酯甲的含量测定，样品编号及产地见表6，以样品7为例：
雷公藤内酯甲对照品溶液的制备：精密称取雷公藤内酯甲对照品适量用乙醇溶解并稀释成含雷公藤内酯甲0.1mg/mL的对照品溶液；
供试品溶液的制备：①溶剂系统的配制:将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水溶液按体积比3:2:3:2混合，然后剧烈振摇5min，置于分液漏斗中，静置分层，分层后上相溶液作为固定相，下相溶液作为流动相，超声波脱气15min；
②样品的粗提：将雷公藤药材粉碎过四号筛(样品8)，取10.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入乙酸乙酯超声处理(功率300W，频率40kHz)3次(每次30min，200mL)，滤过，合并三次滤液，浓缩近干，残渣用10mL上相溶液和10mL下相溶液溶解，超声5min溶解脱气后作为被富集样品溶液备用；
③样品的富集处理：用计量泵以10mL/min的流速将固定相注满色谱分离柱后，开启直流电机转速调至800rmp，柱温设置为25℃，将流动相以2mL/min的流速从色谱分离柱入口泵入，在色谱分离柱出口用量筒收集流出的固定相；待色谱分离柱出口不再有固定相流出时，通过进样阀进上述制备的样品溶液，收集137-170min的流出液，蒸干，残渣用乙腈溶解，转移至2mL的容量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，过0.22μm的滤膜，得到的滤液即为供试品溶液；
高效液相色谱法测定：
色谱条件：十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈：0.1％磷酸水＝75:25；检测波长为210nm；流速：1.0mL·min-1；检测器：紫外；柱温：35℃；进样量：20μL；
含量测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱，检测，记录35min的色谱图，即得，如图7所示。
结果测的雷公藤药材中雷公藤内酯甲的含量为0.0027mg/g。
样品8和9以同样的实验步骤进行实验，测得结果如表6所示。
表6样品参数及样品中雷公藤内酯甲的含量数据
综上，本发明所建立的将液液分配色谱作为样品前处理技术，结合高效液相色谱法测定雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲含量的方法，具有精密度好，重复性、稳定性，回收率良好的特点，能满足复杂样品中雷公藤内酯甲的含量测定要求。
Claims (4)
1.一种雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法，其特征在于：所述的方法按照如下步骤进行：
(1)雷公藤内酯甲对照品溶液的制备：
精密称取雷公藤内酯甲的对照品适量，用乙醇溶解，并稀释成含雷公藤内酯甲0.1mg.mL-1的对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
①溶剂系统的配制:将正己烷、乙酸乙酯、乙醇及水按体积比2～4:1～3:2～4:1～3混合，然后剧烈振摇5～10min，然后置于分液漏斗中，静置分层，分层后上相溶液作为固定相，下相溶液作为流动相，超声波脱气10～20min；
②样品的粗提：取雷公藤多苷片20片研细，精密称取1.5g，加入30～100mL乙酸乙酯，超声处理30～60min，用适量乙酸乙酯分次洗涤，合并滤液和洗液并蒸干，得到残渣，将所述的残渣用10mL上相溶液和10mL下相溶液溶解，超声溶解脱气后作为分离样品溶液备用；
或将雷公藤药材粉碎过四号筛，取5～15.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入乙酸乙酯超声处理3次，每次乙酸乙酯的加入量为200mL，超声时间为30min，然后过滤并合并三次滤液，浓缩近干，得到残渣；然后将所述的残渣用10mL上相溶液和10mL下相溶液溶解，超声溶解脱气后作为分离样品溶液备用；
③样品的富集：将液液分配色谱分离柱填满固定相，开启速度控制器，控制转速为700～800rmp，设置柱温为25℃，以1～2mL/min的流速将流动相泵入柱内，待整个固定相-流动相体系达到流体动力学平衡，即待色谱柱出口不再有固定相流出时，将步骤②制备的分离样品溶液通过进样阀进样，根据高效液相色谱法测出雷公藤内酯甲的保留时间，收集与保留时间为对应的流出液，蒸干，残渣用乙腈溶解，转移至2～10mL的容量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，过0.22μm的滤膜，得到的滤液即为供试品溶液；
(3)高效液相色谱方法测定雷公藤内酯甲的含量：
色谱条件：十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈：0.1％磷酸水＝90～60：10～40；测定波长为210nm；流速：1.0mL·min-1；检测器：紫外；柱温：35℃；进样量：20μl；
测定：分别精密吸取所述的对照品溶液和所述的供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定并记录色谱图，计算得到雷公藤内酯甲的含量；
所述的雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的含量不得少于0.1mg/g。
2.如权利要求1所述的雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法，其特征在于：所述的正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水体积比为3：2：3：2。
3.如权利要求1所述的雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法，其特征在于：所述的超声参数为：功率300W，频率40kHz。
4.如权利要求1所述的雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法，其特征在于：所述的保留时间为137～170min。
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