CN108802255B - 测定复方制剂中灵芝三萜类成分含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种测定复方制剂中灵芝酸A和灵芝三萜类成分含量的方法，其要点在于：使用乙酸乙酯提取样品和正己烷除杂，使用HZ816固相萃取小柱对样液进行纯化，定容，过膜得到检测供试品；使用梯度变化的乙腈、甲醇和水溶液作为高效液相色谱流动相，对供试品进行检测，以灵芝酸A作为对照品测定样品中灵芝酸A的含量和灵芝三萜类成分含量。本发明使用不同溶剂对样品进行除杂和纯化，用固相萃取柱进行纯化，有良好的重复性和回收率；优化了高效液相色谱测定灵芝酸A的方法，有较好的精密度、稳定性和分离度；以灵芝酸A为对照品测定制剂中的灵芝酸A含量，以相对于灵芝酸A的保留时间鉴别其他灵芝三萜类成分，以相对校正因子进行换算测定其含量。

Description

测定复方制剂中灵芝三萜类成分含量的方法

技术领域

本发明属于天然产物提取和分析化学领域，具体涉及一种测定复方制剂中灵芝酸A和灵芝三萜类成分含量的方法。

背景技术

灵芝：多孔菌科真菌灵芝的子实体。主要活性成分为灵芝三萜和灵芝多糖，灵芝三萜具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老和护肝等药理功效。灵芝三萜类成分化合物有二百余种，其中灵芝酸A(Ganoderma acid A)最早被研究者从灵芝中分离并鉴定结构；在以往专利及文献中，灵芝酸A常被作为对照品来检测灵芝及其提取物的质量。

高效液相色谱(High-performance liquid chromatography,HPLC)技术具有分离效能高、分析速度快、仪器自动化强等特点，可采用多种检测器以及种类丰富的色谱柱，HPLC技术在各种天然产物成分指标的质量控制中得到不断推广和应用。目前在灵芝的应用多为将灵芝用有机溶剂提取得到三萜及甾醇，用十八烷基键合硅胶(C18)反向色谱柱进行检测灵芝三萜类成分含量；将将灵芝用水提取得到灵芝多糖，水解并衍生化后用C18反向色谱柱检测，内标法检测单糖组分和含量；或直接将分离纯化的单一灵芝多糖使用凝胶排阻色谱柱以出峰时间检测分子量。以往文献专利如CN102721764一种灵芝醇提物的质量控制方法和CN102735772 一种灵芝水提物的质量控制方法都需要多种昂贵的对照品如灵芝酸B、C2和G等，配置对照品溶液过程中易受人员操作差异，对照品纯度，操作步骤多等各种因素影响，检测结束后需分别计算各自灵芝三萜类含量，过程较繁琐且易出现误差。

中药质量控制和评价是中药现代化的瓶颈，中药多成分的复杂性决定了单一成分或指标评价难以表达中药的质量，并由此提出多成分质量控制的模式；多指标的质量评价模式，必需有足够量的化学对照品，由于中药化学对照品分离难度大，或单体不稳定难以供应或供应价格高等因素，致使对照品的供应和使用困难。鉴于目前单成分质量控制尚缺乏对照品供应，更不用说多指标成分的质量控制模式，该模式也仅限于科研，难以应用到实际质量监督和评价中。故有学者提出增加指纹图谱进行质量控制的模式，但指纹图谱的模糊性特点决定了其难以进行定量分析，增大了在实际生产、监督中应用的难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能较为准确测定复方制剂中灵芝酸A和灵芝三萜类成分含量的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种测定复方制剂中灵芝酸A和灵芝三萜类成分含量的方法，其要点在于：使用乙酸乙酯提取样品和正己烷除杂，使用HZ816固相萃取小柱对样液进行纯化，定容，过膜得到检测供试品；使用梯度变化的乙腈、甲醇和水溶液作为高效液相色谱(HPLC)流动相，对供试品进行检测，以灵芝酸A作为对照品测定样品中灵芝酸A的含量和灵芝三萜类成分含量。

针对不同成分，样品制作方法不同：

对于富含非极性成分的样品：称取相当于灵芝生药量200mg重量的复方制剂，100ml正己烷提取，离心弃上清；渣用100ml乙酸乙酯提取，离心取上清，浓缩蒸干，固体用水超声混悬成悬浊液，加入活化后的HZ816固相萃取小柱上样，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4ml 甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5ml，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液。

对于富含极性成分的样品：称取相当于灵芝生药量200mg重量的复方制剂，用100ml 乙酸乙酯提取，离心取上清，浓缩蒸干，固体用水超声混悬成悬浊液，加入活化HZ816固相萃取小柱上样，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5ml，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液。

对于富含非极性和极性成分的样品：称取相当于灵芝生药量200mg重量的复方制剂，用100ml乙酸乙酯提取，离心取上清，浓缩蒸干，固体加入正己烷超声混悬，离心弃上清，沉淀用水超声混悬成悬浊液，加入活化的HZ816固相萃取小柱上样，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5ml，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液。

使用梯度变化的乙腈、甲醇和水溶液作为HPLC流动相，色谱柱为C18反向色谱柱，柱温40℃，检测波长254nm，流速1.0ml/min，检测时间45min，供试品溶液和灵芝酸A 对照品溶液进样量20μL，以灵芝酸A为对照品测定制剂中的灵芝酸A含量，同时以相对于灵芝酸A的保留时间鉴别灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸B、灵芝酸H、灵芝酸D、灵芝酸F 这6种灵芝三萜类成分，并以相对校正因子进行换算测定其含量。

表1流动相梯度变化表

时间(min)	乙腈(％)	甲醇(％)	水(％)
				0	20	20	60
30	30	20	50
				35	38	20	42
40	20	20	60
				45	20	20	60

表2以灵芝酸A计算样品中灵芝三萜类成分含量

成分	相对保留时间	相对校正因子F
			灵芝酸C2	0.74	1.051
灵芝酸G	0.79	1.182
			灵芝酸B	0.89	1.100
灵芝酸A	1.00	1.000
			灵芝酸H	1.08	1.539
灵芝酸D	1.17	1.080
			灵芝酸F	1.29	1.453

以往专利文献中以单一的灵芝作为对象进行提取制备供试品，并未考虑到灵芝作为一种常用的中药材，会与其他中药材或食品进行搭配，其他中药材或者食品中含有大量的非极性成分如挥发油、油脂、脂溶性色素和蜡质等，或含有大量极性成分如多糖、生物碱、有机酸、水溶性色素和皂苷等；非极性成分会部分溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷等常见用于提取灵芝三萜类成分的有机溶剂中，会改变提取液的性质如乳化分层，堵塞滤头，染色等意想不到的结果，最终影响供试品溶液质量。极性成分会部分溶于正丁醇、甲醇和乙醇，带来了结晶，表面活性改变，供试品溶液pH值波动等问题。若供试品溶液未经纯化直接在HPLC 条件下进行检测时，会出现堵塞滤膜、堵塞色谱柱、鬼峰、基线飘移和稳定性、重复性、分离度降低等诸多问题。部分文献使用碳酸盐溶液对三氯甲烷等有机溶剂进行萃取操作以避免杂质，但是该步骤对实验人员操作要求高，有时还需调节pH值，极易损失灵芝三萜类成分从而影响精密度和回收率。

本发明在反复试验的基础上，发现乙酸乙酯对复方制剂中的灵芝酸A的溶出效果较好，本发明经过反复试验发现样品溶剂比(样品与提取溶剂比值，重量/体积，w/v)达到500以上时，超声提取30min与加热回流2h、索式提取8h效果一致，对复方制剂中的灵芝三萜类成分提取完全；因HPLC检测方法所需样品重量和所含对照品浓度较小，而超声提取较为简便快捷，故选择超声提取作为制备供试品溶液的主要方法；极性最弱的石油醚(30～60℃)，石油醚 (60～90℃)和正己烷对于非极性成分的溶解性较好，但石油醚成分复杂，毒性大，提取后沉淀中的残留杂质较正己烷多，故选择正己烷作为除去非极性成分的溶剂。极性最大的水对于灵芝酸A也具有一定的溶解度，故不宜采用水作为除去极性成分的溶剂,但可作为进行柱纯化前混悬样品的理想溶剂。

固相萃取柱(Solid Phase extraction Cartridges,SPE cartridges)是从层析柱发展而来的一种用于萃取、分离、浓缩的样品前处理装置。具有低流失，高回收率，简单方便等特点。主要应用于各种食品、农畜产品、环境样品以及生物样品中目标化合物的样品前处理，被广泛地使用在许多国标(GB/T)以及行业分析标准中；固相萃取技术以不同填料针对不同天然产物的分离检测上的应用也越来越多。

大孔树脂具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，富集效果好，解吸条件温和，再生简便，使用周期长等优点，被广泛应用于实验室样品制作和工业化生产。HZ816树脂为弱极性大孔树脂，对带有一定极性的三萜酸的吸附率和脱附率高。但HZ816作为固相萃取柱填料的应用来检测灵芝酸还尚未见相关报道。

本发明采用HZ816固相萃取小柱对溶剂提取过的样品进行特异性纯化，固相萃取小柱的使用方便，对杂质的处理能力强，与直接溶剂提取上样的样品的图谱对比，消除了大部分鬼峰，色素峰，杂质峰和基线飘移现象，效果较常规纯化操作如萃取和盐析更佳。HZ816固相萃取小柱处理过的样品的重复性，精密度的相对标准偏差(Relative standarddeviation,RSD) ＜1％，回收率＞98.50％。对于其他固相萃取小柱如C8、C18、AB-8、D101、GDX系列和 XAD系列具有显著的优势，但由于一般所用的固相萃取小柱的体积有限制(5ml),其承载量有上限(200mg/5ml)，仍需要在上样前尽量减少杂质避免堵塞柱子使柱效下降，本发明将前处理和柱纯化结合起来，从杂质较多的样品中得到了较纯净的供试品溶液，易于HPLC检测样品中的微量灵芝酸A。

本发明在反复试验的基础上得到一种较为快速简便的检测方案，使用梯度变化的乙腈、甲醇和水溶液作为HPLC流动相，色谱柱为C18反向色谱柱，柱温40℃，检测波长254nm，流速1.0ml/min，，检测时间45min，进样量20μL，梯度变化下的乙腈、甲醇和水溶液的搭配，在单位时间内如1min内可减少每种流动相的消耗体积，这样在每种流动相在单位体积下如1000ml时可检测的样品量更多，本发明在保证分离度的前提下，用梯度变化加快了灵芝酸A的出峰速度，缩短了一定的检测时间，在单位时间内可检测更多样品，提高了检测效率，适合大批量长时间自动进样操作；本发明在保证分离度的前提下，尽可能升高柱温，降低对色谱柱的压力，延长色谱柱寿命，另外由于液相色谱仪器的柱温箱升温能力较强，但降温能力较弱，外部低温(冬季)时柱温可保持恒定，但外部高温(夏季)时柱温温度难以保持在室温如25-30℃以下，本发明液相方法中的柱温达到40℃，抗干扰能力较强，出峰时间稳定，保证了相对保留时间的精密度、重复性和稳定性，可用于鉴别以其他灵芝三萜类成分。

一测多评法(Quantitative analysis of multi-components bya singlemarker,QAMS)是通过测定中药材中一种成分(具代表性且该对照品易得者)的含量，依据相对校正因子(Relative correction factor,RCF)推算其他待测成分的含量，并使计算值与实测值符合定量方法学要求的一种多指标同步定量控制的方法。QAMS法有利于实现对中药材中多个成分含量的同步测定，近年来QAMS法也逐渐得到广泛认可，2015年版《中国药典》收载了通过QAMS法测定黄连、丹参等中药材中多种有效成分的含量。QAMS法中化合物的母核结构相似时，其计算值与实测值的相似度较大，而灵芝酸A作为灵芝三萜的代表性成分，与其他灵芝三萜都为四环三萜类的羊毛甾烷衍生物，在成分结构上十分相似，另有文献报道以灵芝酸A作为对照品，使用QAMS法计算灵芝酸C2的相对校正因子为1.125，RSD为1.07％，含量计算值与实测值无统计学差异(P>0.05)。本发明研究了采用QAMS方法测定多种灵芝三萜成分的相对校正因子并应用到复方制剂检测中。经过反复试验，检测不同流动相，不同柱温和不同色谱柱后，不同来源的灵芝酸C2对照品后，最终测定了灵芝酸C2的相对校正因子为1.051， RSD＝0.11％，提高了数据的可信度，并同法计算出其他5种灵芝三萜类对于灵芝酸A的相对校正因子。

附图说明

图1是灵芝酸A对照品溶液色谱图

图2是样品1供试品溶液色谱图

图3是样品2供试品溶液色谱图

图4是样品3供试品溶液色谱图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

一种测定复方制剂中灵芝酸A和灵芝三萜类成分含量的方法：使用具有针对性的有机溶剂提取样品或除杂，使用HZ816固相萃取小柱对样液进行纯化，定容，过膜,得到检测供试品；使用梯度变化的乙腈、甲醇和水溶液作为HPLC流动相，对供试品进行检测，测定并计算样品中灵芝酸A和灵芝三萜类成分含量的含量。其中：

1.1对于富含非极性成分的样品：称取相当于灵芝生药量200mg重量的复方制剂，100ml正己烷提取，离心弃上清；渣用100ml乙酸乙酯提取，离心取上清，浓缩蒸干，固体用水超声混悬成悬浊液，加入活化后的HZ816固相萃取小柱上样，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4ml 甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5ml，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液。

1.2对于富含极性成分的样品：称取相当于灵芝生药量200mg重量的复方制剂，用100 ml乙酸乙酯提取，离心取上清，浓缩蒸干，固体用水超声混悬成悬浊液，加入活化HZ816固相萃取小柱上样，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5ml，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液。

1.3对于富含非极性和极性成分的样品：称取相当于灵芝生药量200mg重量的复方制剂，用100ml乙酸乙酯提取，离心取上清，浓缩蒸干，固体加入正己烷超声混悬，离心弃上清，沉淀用水超声混悬成悬浊液，加入活化的HZ816固相萃取小柱上样，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5ml，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液。

2.对照品溶液的配制和标准曲线的制定：精确称取灵芝酸A对照品，用甲醇定容，即成约0.10mg/ml灵芝酸A对照品溶液；分别精确吸取对照品溶液用甲醇稀释成约6.3、12.5、 25.0、50.0和100.0μg/ml，

3.使用梯度变化的乙腈、甲醇和水溶液作为HPLC流动相，色谱柱为C18反向色谱柱，柱温 40℃，检测波长254nm，流速1.0ml/min，，检测时间45min，供试品溶液和不同浓度灵芝酸A对照品溶液进样量20μL。

4.对不同浓度灵芝酸A对照品溶液和供试品溶液进行测定。得到各自峰面积，以对照品质量(m)和峰面积(A)进行线性回归。得到回归方程后，根据供试品溶液峰面积计算出相应对照品浓度，并计算出供试品中的灵芝酸A和灵芝三萜类成分含量。

本发明所述的复方制剂中的灵芝是指多孔菌科真菌赤芝(Ganodermalucidum(Leyss.Ex Fr.)Karst.)或紫芝(GanodermasinenseZhao,Xu et Zhang)的干燥子实体。

实施例1

1.主要仪器：

高效液相色谱仪：岛津SHIMAZU，LC-20A

检测器：岛津SHIMAZU，SPD-20A，二极管阵列检测器

电子天平：梅特勒托勒多，METTLER TOLEDO XS105DU

超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司，KQ-500

旋转蒸发仪：上海申科仪器有限公司，R-20S

离心机：上海安亭科学仪器厂，TDL-40B

2.主要试剂

甲醇：色谱纯，纯度≥99.9％，广东光华科技有限公司

乙酸乙酯：色谱纯，纯度≥97.0％，广东光华科技有限公司

乙腈：色谱纯，纯度≥99.9％，广东光华科技有限公司

正己烷：分析纯，纯度≥99.5％，广东光华科技有限公司

纯化水：18.2MΩ.cm。

3.样品1的制备：取某保健食品灵芝软胶囊剪破，挤出内容物，精密称取0.1024g(相当于灵芝生药量200mg)置于具塞锥形瓶中，加入100ml正己烷，超声30min；将溶液倒入离心管离心，离心后，弃去离心管内的上清液，并将具塞锥形瓶内残留的正己烷挥干，将离心管内沉淀倒回原锥形瓶，用100ml乙酸乙酯分多次洗离心管，清洗液加入原锥形瓶，超声30min；再倒入离心管离心，离心后，取离心管内的上清液加入具塞圆底烧瓶，用旋转蒸发仪浓缩蒸干，用20ml乙酸乙酯洗涤原锥形瓶后，倒入离心管离心，离心后，取离心管内溶液的上清液，加入原圆底烧瓶，重复3次，用旋转蒸发仪浓缩蒸干；用2ml水超声混悬圆底烧瓶内的固体，加入活化后的HZ816固相萃取小柱(5ml甲醇洗后用5ml水洗活化)，再用2ml 水超声洗圆底烧瓶，加入固相萃取小柱，重复3次，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5ml，过0.45μm滤膜，即得样品1供试品溶液。

4.灵芝酸A对照品溶液的制备：取五氧化二磷减压干燥至恒重的灵芝酸A(纯度97.3％)对照品，精密称定10.10mg，用甲醇定容成1.010mg/ml灵芝酸A对照品溶液；分别精确吸取对照品溶液用甲醇稀释成6.3、12.6、25.3、50.5、101.0μg/ml。

5.样品1的检测和灵芝对照品标准曲线的制定，得出的曲线如图1是灵芝酸A对照品溶液色谱图、图2是样品1供试品溶液色谱图

5.1样品1的检测:

使用梯度变化的乙腈、甲醇和水溶液作为HPLC流动相，梯度变化见表3

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm，5μm)；

柱温：40℃，

检测波长：254nm，

流速：1.0ml/min，

检测时间：45min，

表3流动相梯度变化表

时间(min)	乙腈(％)	甲醇(％)	水(％)
				0	20	20	60
30	30	20	50
				35	38	20	42
40	20	20	60
				45	20	20	60

取供试品溶液和不同浓度灵芝酸A对照品溶液各20μl注入液相色谱仪得到供试品溶液和不同浓度灵芝酸A对照品溶液中灵芝酸A、的峰面积，供试品溶液和对照品溶液中的灵芝酸A 理论塔板数不低于5000；以对照品质量(m)和峰面积(A)进行线性回归。回归方程灵芝酸A为 y＝2E+07x+8E-12，相关系数r＝0.9999，线性范围6.3—101.0μg/ml，通过对照品中灵芝酸A的浓度计算样品中灵芝酸A的含量。

5.2灵芝酸A含量计算：

W—样品中灵芝酸A的含量，mg/100g；

C—根据标准曲线计算得到的相应浓度，mg/ml；

V—样品提取液的定容体积，ml；

M—样品取样量g；

计算得到样品1的灵芝酸A含量为309.28mg/100g

2015版中国药典方法(中华人民共和国药典2015版一部[S],中国医药出版社,2015:188-189) 检测得样品1中的三萜含量≥30％，本发明方法检测得到样品1中的灵芝酸A含量为309.28 mg/100g；

样品1按1:1重量比加入某食用油,混合后检测得三萜含量≥58％，本发明方法检测得样品1 中的灵芝酸A含量为155.47mg/100g；

结论：加入食用油后，药典法测得三萜含量受影响较大，本发明方法检测的灵芝酸A含量受影响较小。本发明方法可用于评价样品1质量。

5.3其他灵芝三萜类成分含量计算：

表4以灵芝酸A计算样品1灵芝三萜类成分含量

成分	相对保留时间	相对校正因子F	含量mg/100g
				灵芝酸C2	0.74	1.051	127.62
灵芝酸G	0.79	1.182	154.90
				灵芝酸B	0.89	1.100	215.13
灵芝酸A	1.00	1.000	309.28
				灵芝酸H	1.08	1.539	599.50
灵芝酸D	1.17	1.080	425.83
				灵芝酸F	1.29	1.453	329.01

W—样品中相应灵芝酸的含量，mg/100g；

C—根据标准曲线计算得到的相应浓度，mg/ml；

F—相应灵芝酸的相对校正因子；

V—样品提取液的定容体积，ml；

M—样品取样量，g；

计算得到样品1的灵芝三萜类成分含量见表3

6精密度、稳定性、重复性和回收率试验

6.1精密度：精密吸取供试品混合液20μL，重复进样6次，结果灵芝酸A的平均峰面积为 1411269，RSD为0.70％；

6.2稳定性：精密吸取供试品混合液20μl，分别于O、2、4、6、8、12h测定，结果灵芝酸A平均峰面积分别为1400143。RSD为0.29％；

6.3重复性：取同一批次供试品6份，按“3.”项下方法制备供试品溶液，各自吸取20μL 进样测定，结果灵芝酸A平均峰面积分别为1422465，RSD分别为0.27％；

6.4回收率：精密称取6份已知灵芝酸A含量的样品1，分别准确加入“步骤4”项下对照品溶液各6份，按“步骤3和5”项下制备上机测定。依据结果计算灵芝酸A平均回收率分别为98.76％，RSD为2.57％。

实施例2

1.样品2的制备：取某灵芝中成药颗粒剂，粉碎过筛100目，精密称取2.1058g(相当于灵芝生药量200mg)置于具塞锥形瓶中，加入100ml乙酸乙酯，超声30min，乙酸乙酯倒入离心管离心，离心后，取离心管内乙酸乙酯上清液加入具塞圆底烧瓶，用旋转蒸发仪浓缩蒸干，用20ml乙酸乙酯洗涤原锥形瓶和渣，乙酸乙酯倒入离心管离心，离心后，取离心管内乙酸乙酯上清液，加入原圆底烧瓶，重复3次，用旋转蒸发仪浓缩蒸干；用2ml水超声混悬圆底烧瓶内的固体，加入活化后的HZ816固相萃取小柱，再用2ml水超声洗圆底烧瓶，加入固相萃取小柱，重复3次，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5 ml，过0.45μm滤膜，即得样品2供试品溶液。

其余未述部分同实施例1。

2.样品2的检测，得出如图3所示的样品2供试品溶液色谱图

取供试品溶液和实施例1中的对照品溶液各20μl注入液相色谱仪得到各自溶液中灵芝酸A 的峰面积，计算得到样品1的灵芝酸A含量为15.98mg/100g。

2015版中国药典方法检测得样品2中的三萜含量≥0.5％，本发明方法检测得到样品2 中的灵芝酸A含量为15.98mg/100g。

样品2按100:1重量比加入人参皂苷Re(纯度97.4％),混合后检测得三萜含量≥1％，本发明方法检测得样品2中的灵芝酸A含量为15.61mg/100g。

结论：加入人参皂苷Re后，药典法测得三萜含量受影响较大，本发明方法检测的灵芝酸A含量受影响较小。本发明方法可用于评价样品2质量。

表5以灵芝酸A计算样品2灵芝三萜类成分含量

成分	相对保留时间	相对校正因子F	含量mg/100g
				灵芝酸C2	0.74	1.051	8.69
灵芝酸G	0.79	1.182	10.54
				灵芝酸B	0.89	1.100	11.43
灵芝酸A	1.00	1.000	15.98
				灵芝酸H	1.08	1.539	23.10
灵芝酸D	1.17	1.080	15.76
				灵芝酸F	1.29	1.453	12.04

计算得到样品2的灵芝三萜类成分含量见表4。

其余未述部分同实施例1。

3精密度、稳定性、重复性和回收率试验

3.1精密度：精密吸取供试品混合液20μL，重复进样6次，结果灵芝酸A的平均峰面积为 1482925，RSD为0.44％；

3.2稳定性：精密吸取供试品混合液20μL,，分别于O、2、4、6、8、12h测定，结果灵芝酸A平均峰面积分别为1477207，RSD为0.53％；

3.3重复性：取同一批次供试品6份，按“实施例2中步骤1.”项下方法制备供试品溶液，各自吸取20μL进样测定，结果灵芝酸A平均峰面积分别为1486981，RSD分别为0.97％；

3.4回收率：精密称取6份已知灵芝酸A含量的样品2，分别准确加入“实施例1中步骤4”项下对照品溶液各6份，按“实施例2中步骤1和2”项下制备上机测定。依据结果计算灵芝酸A平均回收率分别为99.53％，RSD为1.52％。

实施例3

1.样品3的制备：取某灵芝保健食品撕开包装，倒出粉末，精密称取5.0500g(相当于灵芝生药量200mg)置于具塞锥形瓶中，加入100ml乙酸乙酯，超声30min，乙酸乙酯倒入离心管离心，离心后，取离心管内乙酸乙酯上清液加入具塞圆底烧瓶，用旋转蒸发仪浓缩蒸干，用 20ml乙酸乙酯洗涤原锥形瓶和渣，乙酸乙酯倒入离心管离心，离心后，取乙酸乙酯上清液，加入原圆底烧瓶，重复3次，用旋转蒸发仪浓缩蒸干；圆底烧瓶加入20ml正己烷超声混悬，正己烷倒入离心管离心，离心后，弃去离心管内正己烷上清，重复3次，挥干圆底烧瓶和离心管内的正己烷；用2ml水超声混悬圆底烧瓶内固体和离心管内沉淀，加入活化后的HZ816 固相萃取小柱，再用2ml水超声洗圆底烧瓶和离心管，加入固相萃取小柱，重复3次，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5ml，过0.45μm滤膜，即得样品3供试品溶液。

其余未述部分同实施例1。

2.样品3的检测，得出如图4所示的样品3供试品溶液色谱图

取供试品溶液和实施例1中的对照品溶液各20μl注入液相色谱仪得到各自溶液中灵芝酸A 的峰面积，计算得到样品3的灵芝酸A含量为5.02mg/100g。

2015版中国药典方法检测得样品3中的三萜含量≥50％，本发明方法检测得到样品3 中的灵芝酸A含量为5.02mg/100g。

样品3中实际灵芝含量≤4％。

结论：药典方法无法测得真实的灵芝三萜含量，本发明方法检测的灵芝酸A含量受影响较小。本发明方法可用于评价样品3质量。

表6以灵芝酸A计算样品3灵芝三萜类成分含量

成分	相对保留时间	相对校正因子F	含量mg/100g
				灵芝酸C2	0.74	1.051	2.85
灵芝酸G	0.79	1.182	2.73
				灵芝酸B	0.89	1.100	3.88
灵芝酸A	1.00	1.000	5.02
				灵芝酸H	1.08	1.539	9.65
灵芝酸D	1.17	1.080	7.84
				灵芝酸F	1.29	1.453	6.76

计算得到样品3的灵芝三萜类成分含量见表5。

其余未述部分同实施例1。

3.精密度、稳定性、重复性和回收率试验

3.1精密度：精密吸取供试品混合液20μL，重复进样6次，结果灵芝酸A的平均峰面积为 1138218，RSD为0.66％；

3.2稳定性：精密吸取供试品混合液20μL,，分别于O、2、4、6、8、12h测定，结果灵芝酸A平均峰面积分别为1149606，RSD为0.89％；

3.3重复性：取同一批次供试品6份，按“实施例3中1.”项下方法制备供试品溶液，各自吸取20μL进样测定，结果灵芝酸A平均峰面积分别为1149606，RSD分别为0.74％；

3.4回收率：精密称取6份已知灵芝酸A含量的样品3，分别准确加入“实施例1中的步骤 4.”项下对照品溶液各6份，按“实施例3中1.和2.”项下制备上机测定。依据结果计算灵芝酸A平均回收率分别为98.89％，RSD为2.71％。

Claims (2)

1.一种测定复方制剂中灵芝三萜类成分含量的方法，其特征在于：

供试品溶液的制作：对于富含非极性成分的样品：称取相当于灵芝生药量200 mg重量的复方制剂，100 ml正己烷提取，离心弃上清；渣用100 ml乙酸乙酯提取，离心取上清，浓缩蒸干，固体用水超声混悬成悬浊液，加入活化后的HZ816固相萃取小柱上样，上样后用5 ml水洗柱，弃去，用4 ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5 ml，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液；对于富含极性成分的样品：称取相当于灵芝生药量200 mg重量的复方制剂，用100 ml乙酸乙酯提取，离心取上清，浓缩蒸干，固体用水超声混悬成悬浊液，加入活化HZ816固相萃取小柱上样，上样后用5 ml水洗柱，弃去，用4 ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5ml，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液；对于富含非极性和极性成分的样品：称取相当于灵芝生药量200 mg重量的复方制剂，用100 ml乙酸乙酯提取，离心取上清，浓缩蒸干，固体加入正己烷超声混悬，离心弃上清，沉淀用水超声混悬成悬浊液，加入活化的HZ816固相萃取小柱上样，上样后用5ml水洗柱，弃去，用4 ml甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容5 ml，过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液；

使用梯度变化的乙腈、甲醇和水溶液作为高效液相色谱流动相，对供试品溶液进行检测；色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 ，150 mm×4.6 mm，5 μm；梯度变化见下表：

流动相梯度变化表

以灵芝酸A作为对照品测定样品中灵芝三萜类成分含量，所述的灵芝三萜类成分为灵芝酸A、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸B、灵芝酸H、灵芝酸D和灵芝酸F。

2.根据权利要求1中所述的一种测定复方制剂中灵芝三萜类成分含量的方法，其特征在于：柱温：40 ℃，检测波长：254 nm，流速：1.0 ml/min，检测时间：45 min，供试品溶液和灵芝酸A对照品溶液进样量为20μL，以灵芝酸A为对照品测定制剂中的灵芝酸A含量，同时以相对于灵芝酸A的保留时间鉴别灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸B、灵芝酸H、灵芝酸D、灵芝酸F共6种灵芝三萜类成分，并以相对校正因子进行换算测定其含量。

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