CN105954432B

CN105954432B - 一种银杏内酯b含量的检测方法

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Publication number: CN105954432B
Application number: CN201610562926.9A
Authority: CN
Inventors: 胡林森; 李丁; 孙蓉; 刘斐; 肖志勇; 吕署; 吕署一
Original assignee: SHANGHAI SINE PROMD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI SINE PROMD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2016-07-18
Filing date: 2016-07-18
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2036-07-18
Also published as: CN105954432A

Abstract

本发明公开了一种银杏内酯B含量的检测方法，包括：(1)色谱条件与系统适用性试验；(2)对照品溶液的制备；(3)供试品溶液的制备；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液，注入液相色谱仪，通过高效液相色谱‑蒸发光散射检测器(HPLC‑ELSD)分析检测其含量，即得。本发明检测方法应用方便快速，结果准确可靠，可以用于银杏内酯B的定性与定量分析，本发明经方法学验证表明，专属性、线性范围、稳定性、重复性、加样回收率等均符合要求。适于工业化生产使用，有较大的应用价值。

Description

一种银杏内酯B含量的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测方法，具体涉及中药提取物的检测方法，尤其涉及一种银杏内酯B含量的检测方法。

背景技术

银杏叶所含化学成分复杂，其中黄酮类和萜类内酯化合物具有重要的药用价值和市场价值，目前已有许多银杏叶系列产品。随着社会的进步和经济的发展，银杏叶萜类内酯的重要性越来越受到人们的关注。银杏叶萜类内酯是仅在银杏叶中发现的一类具有特殊结构及显著药理活性的重要成分，迄今尚未发现存在于其他任何植物中，更重要的是它们具有独特的药理作用和治疗价值。常见的银杏叶萜类内酯为银杏内酯A、B、C，白果内酯B，均为强血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)受体拮抗剂，它们独特的药理作用和治疗价值已引起世界范围制药工业的极大兴趣，市场上已有银杏内酯注射液产品。随着研究的深入，发现银杏内酯B活性最强，药效优于总内酯，银杏内酯B是脂溶性物质，能顺利通过血脑屏障，银杏内酯B注射液临床试验初步证明，该药可以治疗包括急性缺血性脑梗塞在内的脑缺血性疾病，有望成为急性脑缺血类疾病治疗药物的新选择。由于银杏内酯B至今没有公开的质量标准，而质量标准对其含量检测是控制质量的重要项目，因此，研究银杏内酯B的含量检测方法对银杏内酯B的开发有积极作用。

高效液相色谱(HPLC)结合蒸发光散射检测器(ELSD)的检测方法常用于检测银杏内酯含量，ELSD的响应不依赖与样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。ELSD灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗脱液相色谱联用。《中国药典》2015版一部中对银杏叶萜类内酯含量的测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以正丙醇-四氢呋喃-水(1:15:84)为流动相；用ELSD检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。但是每个样品的检测时间长达45min，因此，不能满足银杏叶内酯B高效率的测定，需要进一步改进检测方法；发明专利《一种银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法(专利号ZL 2014 1 0321649.3)》，介绍了快速检测银杏内酯含量的方法，但对银杏内酯B单一成分检测的专属性不好，而且在甲醇溶液里，银杏内酯B单体溶液更易降解。因此设计针对银杏内酯B单一成分的检测方法有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计专属性好，经济环保，效率高的银杏内酯B含量的检测方法。

本发明提供了一种银杏内酯B含量的检测方法，

本发明方法包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机相/水相为流动相，梯度洗脱；蒸发光散射检测器检测，理论板数按银杏内酯B峰计算应不低于4000，各峰分离度大于2.0；

(2)对照品溶液的制备：精密称取银杏内酯B对照品适量，加含0.1％甲酸的甲醇制成每1ml含5mg的溶液，摇匀，得5mg/ml贮备液；

对照品溶液1的制备精密吸取贮备液2ml至25ml量瓶，加含0.1％甲酸的60％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

对照品溶液2的制备精密吸取贮备液3ml至25ml量瓶，加含0.1％甲酸的60％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

(3)供试品溶液的制备：取银杏内酯B约50mg至10ml量瓶，加含0.1％甲酸的甲醇溶解稀释至刻度，摇匀；精密吸取该溶液1ml至10ml量瓶，加含0.1％甲酸的60％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液1，对照品溶液2，供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯B的含量，即得。

本发明方法所述步骤(1)：色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶。

蒸发光散射检测器的漂移管温度为55℃～90℃，气体流速1.0L/min～4.0L/min。

流动相为有机相/水相，有机相与水相的体积比为25：75～47：53；有机相为色谱级甲醇，水相为纯化水；水相和有机相分别含0.05％～0.3％甲酸。

流动相流速为1.0～2.0mL/min。

柱温箱温度30℃～55℃。

梯度洗脱程序：

本发明方法的供试品银杏内酯B通过下列方法制备：

(该方法参考专利ZL201310624971.9《一种银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法》)

取市售银杏叶提取物浸膏(含量标准为总内酯含量≥6％，总黄酮含量≥24％，银杏酸含量≤10ppm)1000g，用水2000mL稀释至0.5g生药/mL，每次加入1000ml乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，于45℃减压浓缩至无溶剂，加入10％乙醇100ml使浓缩液浓度约为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30％乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度1BV/h，再用40％乙醇以同样流速洗脱树脂，收集后3BV洗脱液，于45℃减压浓缩至1g/ml的浸膏，加入500ml 70％甲醇，加热至溶解，4℃冰箱静置24h析晶，析出晶体后，抽滤，得到银杏内酯B的粗品，将得到的银杏内酯B粗品加80％乙醇50ml，加热至溶解，于4℃静置24h，析出结晶，抽滤，结晶于80℃烘干最终得到银杏内酯B。作为供试品检测银杏内酯B含量。

本发明使用的奥泰ELSD3300检测器，由于不同型号的ELSD使用的理想条件不尽相同，本发明人针对银杏内酯B的特点，对检测方法的各种重要条件经过了很多次的研究和改进试验，设计了相适应的HPLC条件和ELSD参数设置，可以准确快速测定银杏内酯B的含量。

本发明方法有显著效果：

(1)通常，在配制银杏内酯B溶液时加入磷酸使其稳定，但是，磷酸的挥发性不好，导致检测时在图谱中发生干扰。本发明予以改进，配制银杏内酯B溶液时加入适量甲酸，避免了银杏内酯B在中性溶液中的降解现象，使其稳定性好。延长了银杏内酯B对照品的使用时间，保证了准确度，尤其当处理大量样品时，能增强样品稳定性，有利于确保检测的稳定和准确性。

(2)本发明方法样品配制溶液中有甲酸，流动相中加入甲酸更利于峰形稳定，柱效提高，在主峰附近基线噪音降低。

(3)银杏内酯B的含量用外标两点法对数方程计算得到，本发明中，将对照品配制成不同浓度，进样量相同，作为外标两点对照，若手动进样，有利于减小误差。

(4)由于流动相进行梯度洗脱时容易发生基线下沉现象，本发明结合具体实际情况，设计出比较理想的HPLC条件和ELSD参数，调节漂移管温度和气体流速，解决了这些问题。

本发明检测方法应用方便快速，结果准确可靠，可用于银杏内酯B的定性与定量分析，本发明经方法学验证表明，专属性、线性范围、稳定性、重复性、加样回收率等均符合要求。适于工业化生产使用，有较大的应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例以举例的方式给出，并不构成对本发明的限制。

用于实施例的银杏叶提取物购买自市售产品，质量要求符合2015版中国药典“银杏叶提取物”各项质量标准。

仪器：安捷伦1100高效液相色谱仪，CHEMStation工作站，美国奥泰ELSD3300蒸发光散射检测器，梅特勒·托利多PL204电子天平，梅特勒·托利多XP205电子天平。

试药：银杏内酯B对照品，含量测定用，购买自中国药品生物制品检定所。

甲醇：色谱纯；甲酸：分析纯；水：自制双蒸水。

样品：银杏叶提取物。

实施例1：本发明银杏内酯B样品制备

取市售银杏叶提取物浸膏(含量标准为总内酯含量≥6％，总黄酮含量≥24％，银杏酸含量≤10ppm)1000g，用水2000mL稀释至0.5g生药/mL，每次加入1000ml乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，于45℃减压浓缩至无溶剂，加入10％乙醇100ml使浓缩液浓度约为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30％乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度1BV/h，再用40％乙醇以同样流速洗脱树脂，收集后3BV洗脱液，于45℃减压浓缩至1g/ml的浸膏，加入500ml 70％甲醇，加热至溶解，4℃冰箱静置24h析晶，析出晶体后，抽滤，得到银杏内酯B的粗品2.15g，将得到的银杏内酯B粗品加80％乙醇50ml，加热至溶解，于4℃静置24h，析出结晶，抽滤，结晶于80℃烘干最终得到银杏内酯B1.93g。作为供试品检测银杏内酯B含量。(该银杏内酯B制备方法参考自《一种银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法》(授权专利号ZL201310624971.9))

实施例2本发明银杏内酯B含量检测及专属性研究

(2)对照品溶液的制备：精密称取银杏内酯B对照品适量，加甲醇(含0.1％甲酸)制成每1ml含5mg的溶液，摇匀，得5mg/ml贮备液；

对照品溶液1的制备精密吸取贮备液2ml至25ml量瓶，加60％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液2的制备精密吸取贮备液3ml至25ml量瓶，加60％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得。

(3)供试品溶液的制备：取实施例1制得的银杏内酯B约50mg至10ml量瓶，精密称定，加甲醇(含0.1％甲酸)溶解稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液1ml至10ml量瓶，加60％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得；

同时取适量60％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)作为空白对照溶液。

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液1，对照品溶液2，供试品溶液，空白对照溶液各15μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标两点法对数方程计算银杏内酯B的含量，即得。

分析柱：C18柱，流速1mL/min，柱温箱温度45℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度70℃，气体流速2.0L/min.。流动相条件：有机相甲醇(含0.1％甲酸)与水相(含0.1％甲酸)，有机相与水相的体积比变化30：70～45：55；梯度洗脱程序

时间(分钟)	有机相(％)	水相(％)
			0	30	70
5	45	55
			10	45	55
15	30	70
			20	30	70

结果显示银杏内酯B峰形良好，对称性高，理论塔板数8500，主峰附近杂质峰分离均达到2.0以上，用外标两点法对数方程计算银杏内酯B的含量为93.9％；空白对照溶液基线平稳，噪音低，无杂峰，表明该方法专属性良好。

实施例3：本发明银杏内酯B含量的检测

使用实施例2中所用的对照品和供试品，进样检测：分别精密吸取对照品溶液15μL，注入液相色谱仪，测定，分析柱：C18柱，流动相流速0.7mL/min，柱温箱温度，40℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度65℃，气体流速1.8L/min.。流动相条件：有机相甲醇(含0.05％甲酸)与水相(含0.05％甲酸)，甲醇与水的体积比变化25：75～46：54；梯度洗脱程序

时间(分钟)	有机相(％)	水相(％)
			0	25	75
8	46	54
			15	46	54
20	25	75
			22	25	75

本方法相对于实施例2，银杏内酯B出峰时间略为延长2分钟，峰形良好，对称性高，理论塔板数9000，主峰附近杂质峰分离均达到2.5以上，用外标两点法对数方程计算银杏内酯B的含量为94.2％。实施例4：本发明银杏内酯B含量的检测

使用实施例2中所用的对照品和供试品，进样检测：分别精密吸取对照品溶液15μL，注入液相色谱仪，测定，分析柱：C18柱，流动相流速1.2mL/min，柱温箱温度，50℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度70℃，气体流速2.0L/min.。流动相条件：有机相甲醇(含0.3％甲酸)与水相(含0.3％甲酸)，甲醇与水的体积比变化30：70～47：53；梯度洗脱程序

时间(分钟)	有机相(％)	水相(％)
			0	30	70
6	47	53
			12	47	53
16	30	70
			18	30	70

本方法相对于实施例2，银杏内酯B出峰时间减少2分钟，峰形良好，对称性高，理论塔板数8000，主峰附近杂质峰分离均达到2.0以上，但基线噪音比实施例2略高，仍在合理范围内。用外标两点法对数方程计算银杏内酯B的含量为94.5％。

实施例5比较甲酸对样品溶液稳定性的影响

对照品溶液为实施例2使用。

含甲酸供试品溶液的制备：取银杏内酯B(实施例1制得)50mg至10ml量瓶，精密称定，加甲醇(含0.1％甲酸)溶解稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液1ml至10ml量瓶，加60％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得；

不含甲酸的供试品溶液制备：取银杏内酯B(实施例2制得)50mg至10ml量瓶，精密称定，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液1ml至10ml量瓶，加60％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，

即得；

检测方法同实施例2。

表1配制溶液中是否加甲酸银杏内酯B含量的结果

结果表明：供试品配制溶液中加甲酸，五天后含量与最初一致；供试品溶液中不加甲酸，五天后含量下降约2％，因此，甲酸有增加样品稳定性的作用，同理也可以延长对照品的使用时间。

实施例6检测方法的线性实验

精密量取实施例2中的对照品贮备液，加60％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)，分别稀释成浓度为0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，1mg/ml的溶液，精密吸取各溶液15μL，按实施例2方法检测，以对照品含量(μg)对数值为横坐标，峰面积对数值为纵坐标，经线性回归；回归方程见下表。

表2标准曲线线性回归表

线性方程	r值	线性范围(μg)
			lgA＝1.37lgM+6.73	0.9998	1.5～15.0

实施例7检测方法的稳定性实验

取实施例2中的供试品溶液分别于第0,2,4,6,8,24h取15μL检测，检测方法同实施例2，测定峰面积，RSD％为0.89％，表明本发明方法稳定性良好。

表3稳定性检测峰面积结果

实施例8检测方法重现性实验

更换另一试验人员操作，在另外一台液相安捷伦1260和ELSD3300上操作。

对照品溶液：配制方法同实施例2。

供试品溶液：取同一批银杏内酯B(实施例1制得)50mg，精密称定，按照实施例2中的方法制备。

检测方法同实施例2。

表4重复检测银杏内酯B含量的结果

结果表明：按上述方法，平行取6份样品处理后，测得样品银杏内酯B含量为94.3％，RSD％为0.43％。本次检测结果同实施例2中的一致，表明本方法重现性良好。

实施例9检测方法回收率实验

采用加样回收法，分别精密称取已知含量的银杏内酯B(实施例1制得)25mg，40mg，50mg，每份3个平行，再分别加入银杏内酯B对照品(购买自中国药品生物制品检定所)5mg，按照实施例2供试品制备的方法处理，最终定容至10mL，再精密吸取上述溶液1ml至10ml量瓶，加60％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)稀释至刻度，摇匀，即得作为供试品溶液，对照品溶液同实施例2，检测方法同实施例2。

表5加样回收率实验结果

通过加样回收率实验结果可知：本方法回收率较好，银杏内酯B的平均回收率为99.3％，RSD为1.16％

实施例10：比较银杏内酯B含量检测—流动相中不含甲酸

使用实施例2中所用的对照品和供试品，进样检测：分别精密吸取对照品溶液15μL，注入液相色谱仪，测定，分析柱：C18柱，流速1mL/min，柱温箱温度45℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度70℃，气体流速2.0L/min.。流动相条件：有机相甲醇与水相，均不含甲酸，有机相与水相的体积比变化30：70～45：55；梯度洗脱程序

本实施例方法相对于实施例2，银杏内酯B出峰时间一致，但峰形较差，对称性不及实施例2好，理论塔板数5000，各峰分离达到2.0以上，但基线噪音比实施例2略高，尤其是主峰附近，用外标两点法对数方程计算银杏内酯B的含量为93.6％。由此说明，流动相中加入甲酸，利于提高柱效。

Claims

1.一种银杏内酯B含量的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(2)对照品溶液的制备：精密称取银杏内酯B对照品适量，加含0.1％甲酸的甲醇，制成每1ml含5mg的溶液，摇匀，得5mg/ml贮备液；

对照品溶液2的制备精密吸取贮备液3ml至25ml量瓶，加含0.1％甲酸的60％甲醇稀水溶液释至刻度，摇匀，即得；

(3)供试品溶液的制备：取银杏内酯B50mg至10ml量瓶，精密称定，加含0.1％甲酸的甲醇溶解稀释至刻度，摇匀；精密吸取该溶液1ml至10ml量瓶，加含0.1％甲酸的60％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液1，对照品溶液2，供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯B的含量，即得；

所述步骤(1)色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；蒸发光散射检测器的漂移管温度为55℃～90℃，气体流速1.0L/min～4.0L/min；流动相为有机相/水相，有机相与水相的体积比为25：75～47：53；有机相为色谱级甲醇，水相为纯化水；水相和有机相分别含0.05％～0.3％甲酸；流动相流速为1.0～2.0mL/min；柱温箱温度30℃～55℃。

2.根据权利要求1所述一种银杏内酯B含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)梯度洗脱程序：