CN104034826A - 一种银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法，原料为银杏叶提取物，经乙酸乙酯磁力搅拌提取后得到溶液，旋蒸浓缩至干，采用甲醇溶解并超声处理，作为检测样品，高效液相色谱-蒸发光散射检测器分析检测。本发明检测结果与中国药典方法检测结果一致，在银杏叶萜类内酯提取分离中，本发明更方便实用。检测每个样品时间低于12min(中国药典方法45min)，大大提高了检测效率，缩短试验周期，节约成本，经济环保。该方法可以用于银杏叶内酯的定性与定量分析，本发明经方法学验证表明，分离效果良好，方法线性、稳定性、重现性、加样回收率等均符合要求。本发明还适用于检测以单种或多种银杏叶萜类内酯作为原料的制剂，适于工业化生产使用，有较大的应用价值。

Description

一种银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测方法，具体涉及中药提取物的检测方法，尤其涉及一种检测银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法。

背景技术

银杏叶为银杏科银杏属植物的叶子，主要化学成分为黄酮类和萜类内酯化合物，具有重要的药用价值和市场价值，因此，市场上已开发了许多银杏叶系列产品。随着社会的进步和经济的发展，银杏叶萜类内酯的重要性越来越受人们的关注。银杏叶萜类内酯是仅在银杏叶中发现的一类具有特殊结构及显著药理活性的重要成分，迄今尚未发现存在于其他任何植物中，更重要的是它们具有独特的药理作用和治疗价值，常见的银杏叶萜类内酯为银杏内酯A、B、C，白果内酯B，均为强血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)受体拮抗剂，具有很好的药用价值，它们独特的药理作用和治疗价值已引起世界范围制药工业的极大兴趣。随着对银杏叶内酯的深度开发研究，准确、方便、快捷的内酯检测方法有着关键性的作用。

蒸发光散射检测器(ELSD)的检测方法消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，它不同于紫外(UV)和荧光(FLD)检测器，ELSD的响应不依赖与样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。蒸发光散射检测器灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗脱液相色谱联用。《中国药典》2010年版中对银杏叶萜类内酯含量的测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以正丙醇-四氢呋喃-水(1:15:84)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。但是每个样品的检测时间长达45min，因此，不能满足银杏叶内酯快速的测定，需要进一步改进检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计快速、准确检测银杏叶萜类内酯的方法，缩短试验周期，提高检测效率。本发明提供了一种银杏叶萜类内酯的检测方法，本发明的技术方案是：以银杏叶提取物为原料，经乙酸乙酯磁力搅拌提取后得到银杏叶萜类内酯组合物溶液，旋蒸浓缩至干，采用甲醇溶解并超声处理，作为检测样品，进行高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测，以外标两点法定量，色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈与水作为流动相，流动相流速为0.1～2.0mL/min，梯度洗脱，柱温箱温度20℃～50℃，蒸发光散射检测器检测(漂移管温度为60℃～110℃，载气压力为1.0～5.0bar，气体流速0.5L/min～3.5L/min)。

具体的，本发明方法包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈为有机相，纯化水为水相，梯度洗脱；蒸发光散射检测器检测(漂移管温度为60℃～110℃，载气压力为1.0～5.0bar，气体流速0.5L/min～3.5L/min)。理论板数按白果内酯峰计算应不低于3500；

(2)对照品溶液的制备：分别精密称取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品适量，加甲醇制成每1mL各含2mg、1mg、1mg、1mg的混合溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取银杏叶提取物0.15g，精密称定，用乙酸乙酯40℃恒温提取3次(分别用30mL、20mL、10mL)，同时磁力搅拌器搅拌，每次10min，合并3次提取液，旋转蒸发仪回收乙酸乙酯至干，残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液5μL、10μL，供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，各内酯总量即为银杏内酯含量。

本发明方法所述色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶。

所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为60℃～110℃，载气压力为1.0～5.0bar，气体流速0.5L/min～3.5L/min。

所述流动相条件：流动相为有机相/水相，二者体积比为20：80～70：30；有机相为色谱级甲醇或乙腈或它们的混合溶液，所述混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为10：90～80：20，水相为纯化水。

柱温箱温度20℃～50℃。

流动相流速0.1～2.0mL/min。

梯度洗脱程序：

时间(分钟)	水相(％)	有机相(％)
			0	75	25
3	75	25
			8	35	65
12	35	65

本发明对于检测方法的各种重要条件经过了很多次的研究、设计和改进试验，例如：在洗脱时，如果最初甲醇体积比小于20％，则白果内酯和银杏内酯G分离度降低，且各峰理论板数降低，检测时间延长；若到后面梯度变化时，甲醇体积大于70％，虽然样品检测时间缩短，但银杏内酯A和B分离度降低，小于1.5，因此，本发明最终确定了梯度洗脱时，甲醇与水的体积变化比20：80～70：30。

使用本发明方法检测的结果与中国药典方法检测结果一致，但是，本发明方法样品处理方法更为方便，检测所用时间仅为中国药典方法中所用时间的27％，节约了73％的时间，大大提高了检测效率，所用试剂为甲醇，更加经济环保。本发明使用的流动相为有机相与水，梯度洗脱，每个样品分析时间仅需12min，在实验室银杏叶内酯分离纯化过程中，极大地节约了检测时间，缩短试验周期，提高了工作效率，节约成本，经济环保。该方法可以用于银杏叶内酯的定性与定量分析，能很好地控制样品的质量。本发明经方法学验证表明，分离效果良好，方法线性、稳定性、重现性、加样回收率等方法学考察均符合定量测定的要求。本发明还适用于检测以单种或多种银杏叶萜类内酯作为原料或原料之一的制剂，包括注射剂、片剂、胶囊剂等临床或药学上可接受的常用剂型，适于工业化生产使用，有较大的应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例以举例的方式给出，并不构成对本发明的限制。

用于实施例的银杏叶提取物和银杏叶购买自市售产品，质量要求符合2010版中国药典“银杏叶提取物”和“银杏叶”各项质量标准。

仪器：安捷伦1100高效液相色谱仪，CHEMStation工作站，美国奥泰ELSD2000ES蒸发光散射检测器，梅特勒·托利多PL204电子天平。

试药：白果内酯B，银杏内酯A、B、C对照品，含量测定用，购买自中国药品生物制品检定所。

甲醇、正丙醇、四氢呋喃：色谱纯，水：自制双蒸水。

样品：银杏叶提取物，银杏叶。

对比例1：实施《中国药典》2010年版本银杏叶提取物中银杏叶萜类内酯的检测方法：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以正丙醇-四氢呋喃-水(1:15:84)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。

对照品溶液制备：分别精密称取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品20mg、10mg、10mg、10mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容制成每1mL各含2mg、1mg、1mg、1mg的混合溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液制备：取银杏叶提取物0.15g，精密称定，加水10mL，置水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(15mL、10mL、10mL、10mL)合并提取液，用5％醋酸钠溶液20mL洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯10mL洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液5μL、10μL，供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，分析柱：C18柱，流动相：正丙醇-四氢呋喃-水(1:15:84)，流速0.7mL/min，柱温箱温度30℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度100℃，载气压力2.5bar，气体流速2.7L/min.。用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，各内酯总量即为银杏内酯含量。

表1、按《中国药典》2010年版测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的结果

结果表明：按上述方法，平行取5份样品处理后，测得银杏叶提取物中银杏内酯含量的结果分别为6.1％、6.2％、6.2％、6.1％、6.3％。RSD％为1.35％。每个样品进样时间为45min，共计225min。所用试剂为甲醇、四氢呋喃、正丙醇。白果内酯理论板数为5000。

实施例1：本发明银杏叶萜类内酯检测系统适用性试验

取对比例1中的对照品溶液，进样检测。分析柱：C18柱，流速0.7mL/min，柱温箱温度30℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度100℃，载气压力2.5bar，气体流速2.7L/min.。流动相条件：有机相甲醇加水相，甲醇与水的体积比变化25：75～65：35；梯度洗脱程序

时间(分钟)	水相(％)	有机相(％)
			0	75	25
3	75	25
			8	35	65
12	35	65

银杏内酯的出峰顺序依次为白果内酯B、银杏内酯G、银杏内酯A、银杏内酯B，峰形良好，对称性好。各峰分离良好，分离均达到2.5以上。

实施例2：实施本发明银杏叶提取物萜类内酯的检测方法

使用对比例1中所用的对照品和供试品，进样检测：分别精密吸取对照品溶液5μL、10μL，供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，分析柱：C18柱，流动相流速0.7mL/min，柱温箱温度30℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度100℃，载气压力2.5bar，气体流速2.7L/min.。流动相条件：有机相甲醇加水相，甲醇与水的体积比变化25：75～65：35；柱温箱温度30℃，梯度洗脱程序

时间(分钟)	水相(％)	有机相(％)
			0	75	25
3	75	25
			8	35	65
12	35	65

用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，总量即为银杏内酯含量。银杏内酯的出峰顺序依次为白果内酯B、银杏内酯G、银杏内酯A、银杏内酯B，

峰形良好，对称性好。各峰分离良好，分离到均达到2.5以上。

表2 本发明方法中测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的结果

结果表明：按上述方法，平行取5份样品处理后，测得银杏叶提取物中银杏内酯含量的结果分别为6.3％、6.2％、6.1％、6.1％、6.3％。RSD％为1.61％。每个样品进样时间为12min，共计60min。所用试剂为甲醇。白果内酯理论板数为9500。

实施例3：银杏叶提取物中萜类内酯定量检测

对照品溶液同对比例1；

供试品溶液的制备：取银杏叶提取物约0.15g，精密称定，用乙酸乙酯40℃恒温提取3次(30mL、20mL、10mL)，同时磁力搅拌器搅拌，每次10min，合并提取液，旋转蒸发仪回收乙酸乙酯至干，残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液即得。

检测方法同实施例2；

表3 本发明方法中测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的结果

结果表明：按上述方法，平行取5份样品处理后，测得银杏叶提取物中萜类内酯含量的结果分别为6.1％、6.2％、6.1％、6.1％、6.2％。RSD％为0.89％。每个样品进样时间为12min，共计60min，白果内酯理论板数为9500。

实施例2和实施例3结果与对比例1结果比较，本发明检测结果与中国药典方法检测结果一致，并且本发明样品处理方法更为方便，检测所用时间仅为中国药典方法中所用时间的27％，节约了73％的时间，大大提高了检测效率，所用试剂为甲醇，更加经济环保。

实施例4：银杏叶中萜类内酯定性检测

将银杏叶粉碎并取银杏叶粉末1g，加入50mL、40mL、30mL乙酸乙酯于40℃磁力搅拌提取3次，每次20min，合并乙酸乙酯提取液并于60℃旋蒸至干，加入5mL甲醇溶解并超声处理，溶液过0.45μm滤膜，取续滤液即为供试品溶液，进样检测。

分析柱：C18柱，流动相流速0.7mL/min，柱温箱温度30℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度100℃，载气压力2.5bar，气体流速2.7L/min.。流动相条件：有机相甲醇加水相，甲醇与水的体积比变化25：75～65：35；梯度洗脱程序：

时间(分钟)	水相(％)	有机相(％)
			0	75	25
3	75	25
			8	35	65

12

35

65

萜类内酯的出峰顺序依次为白果内酯B、银杏内酯G、银杏内酯A、银杏内酯B，各峰分离良好，分离度均达到2.5以上。白果内酯理论板数达9500。

实施例5：银杏叶中萜类内酯的检测

取对比例中的对照品溶液和实施例4中的样品溶液，按照以下方法检测：分析柱：C18柱，流动相流速0.6mL/min，柱温箱温度30℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度100℃，载气压力2.5bar，气体流速2.5L/min.。流动相条件：有机相甲醇加水相，甲醇与水的体积比变化15：85～60：40；梯度洗脱程序

时间(分钟)	水相(％)	有机相(％)
			0	85	15
6	85	15
			14	40	60
22	40	60

对照品溶液和样品溶液萜类内酯的出峰顺序依次为白果内酯B、银杏内酯G、银杏内酯A、银杏内酯B，各样品峰宽较大，理论塔板数降低，白果内酯B、银杏内酯G分离度低于2，最终样品出峰时间延长至22min。不如实施例1～3中的检测条件实用。

实施例6：银杏叶中萜类内酯的检测

取对比例中的对照品溶液和实施例4中的样品溶液，按照以下方法检测：分析柱：C18柱，流动相流速0.6mL/min，柱温箱温度30℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度100℃，载气压力2.5bar，气体流速2.5L/min.。流动相条件：有机相甲醇加水相，甲醇与水的体积比变化20：80～80：20；梯度洗脱程序

时间(分钟)	水相(％)	有机相(％)
			0	80	20
4	80	20
			7	20	80
11	20	80

对照品溶液和样品溶液萜类内酯的出峰顺序依次为白果内酯B、银杏内酯G、银杏内酯A、银杏内酯B，虽然最终样品出峰时间较短，仅为11min，但银杏内酯A、银杏内酯B分离度低于1.5，不如实施例1～3中的检测条件实用。

实施例7 本发明检测方法的线性实验

精密量取对比例1中的对照品溶液各1μL、5μL、10μL、15μL、20μL检测，检测方法同实施例2，以对照品含量(μg)对数值为横坐标，峰面积对数值为纵坐标，经线性回归，回归方程见下表。

表4 标准曲线线性回归表

对照品	线性方程	r值	线性范围(μg)
				白果内酯B(BB)	lgA＝1.63lgM+6.65	0.9998	2.011～40.22
银杏内酯A(GA)	lgA＝1.54lgM+6.66	0.9999	1.009～20.18
				银杏内酯B(GB)	lgA＝1.55lgM+6.61	0.9998	1.002～20.04
银杏内酯C(GC)	lgA＝1.73lgM+6.55	0.9997	1.006～20.12

实施例8 本发明检测方法的稳定性实验

取实施例3中的供试品溶液分别于第0,2,4,6,8,24h取10μL检测，检测方法同实施例3，测定峰面积，白果内酯B和银杏内酯A，B，C的RSD％分别为0.10％，0.22％，0.74％，1.08％，表明本发明方法稳定性良好。

表5 稳定性检测峰面积结果

实施例9 本发明检测方法重现性实验

对照品溶液：配制方法同对比例1。

供试品溶液：取相同银杏叶提取物约0.15g，精密称定，按照实

施例3中的方法制备。

检测方法同实施例3。

表6 重复检测萜类内酯含量的结果

结果表明：按上述方法，平行取5份样品处理后，测得银杏叶提取物中萜类内酯含量的结果分别为6.2％、6.1％、6.2％、6.1％、6.3％。RSD％为1.4％。本次检测结果同实施例3中的一致，表明本方法重现性良好。

实施例10本发明检测方法回收率实验

采用加样回收法，精密称取已知含量的银杏叶提取物0.15g(其中含白果内酯B1.7％，银杏内酯A，B，C分别含1.7％，2.0％，0.8％)按照实施例3供试品制备的方法处理，再分别加入白果内酯B对照品2.59mg，银杏内酯A对照品2.61mg，银杏内酯B对照品3.06mg，银杏内酯C对照品1.28mg，最终定容至10mL，取续滤液，作为供试品溶液，对照品溶液同实施例9，检测方法同实施例3。

表7 加样回收率实验结果

通过加样回收率实验数据可知：本方法回收率较好，白果内酯B，银杏内酯A，B，C的平均回收率分别为98.8％，98.6％，98.3％，97.6。

Claims (5)

1.一种银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法，使用高效液相色谱-蒸发光散射检测器分析检测，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机相/水相为流动相，梯度洗脱；蒸发光散射检测器检测，理论板数按白果内酯峰计算应不低于3500；

(2)对照品溶液的制备：分别精密称取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品适量，加甲醇制成每1mL各含2mg、1mg、1mg、1mg的混合溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取银杏叶提取物0.15g，精密称定，用乙酸乙酯40℃恒温分别用30mL、20mL、10mL提取3次，同时磁力搅拌器搅拌，每次10min，合并3次提取液，旋转蒸发仪回收乙酸乙酯至干，残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液5μL、10μL，供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，各内酯总量即为银杏内酯含量。

2.根据权利要求1所述银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)色谱柱的柱温箱温度20℃～50℃。

3.根据权利要求1所述银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)蒸发光散射检测器的漂移管温度为60℃～110℃，载气压力为1.0～5.0bar，气体流速0.5L/min～3.5L/min。

4.根据权利要求1所述银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)流动相为有机相/水相，二者体积比为20：80～70：30；有机相为色谱级甲醇或乙腈或它们的混合溶液，所述混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为10：90～80：20，水相为纯化水。

5.根据权利要求1所述银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)流动相流速0.1～2.0mL/min；

梯度洗脱程序：