CN107315058A - 一种检测银杏叶提取液中总银杏酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测银杏叶提取液中总银杏酸的方法，其中包括如下步骤：制备供试品溶液；制备对照品溶液；采用高效液相色谱法，分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测，分别获得色谱图；依据对照品色谱图与供试品色谱图中各自的总银杏酸峰面积，采用外标法计算所述待测银杏叶提取液中总银杏酸的含量。本发明制备样品溶液的方法操作简便、快捷；并且检测方法稳定、均一、可控、便捷，能快速、准确的反应出待测银杏叶提取液中的真实情况。

Description

一种检测银杏叶提取液中总银杏酸的方法

技术领域

本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种检测银杏叶提取液中总银杏酸的方法。

背景技术

银杏素有“植物界的活化石”之称，原产中国，银杏资源在中国的拥有量占有世界总量的70％。银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo bilobaL.)的干燥叶，性甘、苦、涩、平，归心、肺经，具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛等功效；常用于治疗冠心病、心绞痛及高脂血症。银杏叶经加工制成的银杏叶提取物，其制剂是目前国内外畅销的药品及保健品；作为天然药物，在治疗心脑血管疾病及老年痴呆症中具有非常显著的效果。因此银杏叶和银杏叶提取物作为原料，被广泛用于治疗心脑血管等疾病的药品制剂中，仅《中国药典》就收载了包括银杏叶在内的5个相关品种。

银杏中有一类毒性成分—银杏酸，银杏酸具有致敏性、胎盘毒性和免疫毒性，对人类的健康具有潜在的危害。其主要存在于银杏叶、果和外种皮中，在常规的银杏叶提取物中也经常含有，且部分提取物中含量不低，为控制产品质量进而确保患者的用药安全，因此对银杏叶提取物中银杏酸含量的检测显得尤为重要。

WHO及多国药典对银杏提取物及其制剂中总银杏酸的含量都进行了限定。例如，舒血宁注射液制剂就由银杏叶提取液制成，其中限定总银杏酸的含量每1ml不得过20ng。但现有的总银杏酸的检测方法并不能准确测定样品中的含量，因此，建立更为准确、便捷的银杏酸分析方法就显得极其重要。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种检测银杏叶提取液中总银杏酸的方法，具体包括以下步骤：

1)取待测银杏叶提取液，加工成粉末，得供试品；以甲醇水溶液为溶剂充分溶解，过滤，取滤液，即得供试品溶液；

2)取白果新酸对照品，以甲醇水溶液为溶剂溶解，即得对照品溶液；

3)采用高效液相色谱法，分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测，分别获得供试品色图谱和对照品色谱图；所述检测的条件具体为：

色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相由流动相A和流动相B组成，其中，含0.1％-0.2％三氟乙酸的乙腈为流动相A，0.1％-0.2％三氟乙酸的水溶液为流动相B；按如下条件进行梯度洗脱：

4)依据所述对照品色谱图与供试品色谱图中各自的银杏酸峰面积，采用外标法计算所述待测银杏叶提取液中总银杏酸的含量。

其中，所述梯度洗脱中，0～35min，“75→90”代表的含义是，流动相A的比例由75％逐渐增加至90％，“25→10”代表的含义是，流动相B的比例由25％逐渐降低至10％；其他时间段的含义与之类似。该梯度洗脱条件，可将供试品溶液中总银杏酸中的5个银杏酸成分有效分离，同时可避免梯度变化对色谱基线的影响。

总银杏酸包含了银杏酸C15∶0、银杏酸C17∶1、银杏酸C13∶0、银杏酸C15∶1、银杏酸C17∶2等。

由于样品中待测定的总银酸非单一成分，是一类酚酸类物质；供试品中除了含有黄酮类、内酯类，可能还涉及很多其他成分，而白果新酸对照品及总银杏酸对照品的成分固定，又是固体粉末状态，只需直接溶解即可，因此对照溶液与供试品溶液的制备方法有所不同。供试品溶液的制备过程不仅可使供试品中总银杏酸完全溶解，又可降低供试品中的其他成分对检测的影响。

步骤4)中所述银杏酸峰面积，其中供试品色谱图中指总银杏酸峰面积；对照品色谱图中指白果新酸峰面积。

所述外标法采用如下计算公式：

式中：A_供：为供试品溶液中总银杏酸成分的总峰面积；

A_对：为白果新酸对照品溶液的峰面积；

m_对：为白果新酸对照品的称样量，mg；

V_对：为白果新酸对照品稀释体积，ml；

V_供：为供试品的稀释体积，ml；

V：用于制粉的银杏叶提取液体积，ml；

W_供：为供试品溶液制备过程中称取银杏叶提取粉样品重量，g；

W：银杏叶提取液制成粉的总重量，g；

T：银杏叶提取液中总黄酮醇苷含量，mg/ml；

在检测过程中，白果新酸对照品与供试品溶液色谱图的总银杏酸峰面积是供后续计算总银杏酸含量的重要依据，因此需要充分注重色谱图中各个峰的整体形状特征；发明人针对银杏叶提取液中总银杏酸的检测方法进行了大量研究，发现在检测过程中会出现溶剂效应，导致色谱峰的峰形不好，峰面积的重复性不好。

发明人经过研究，最终确定了溶剂甲醇溶液的体积百分比为70％-90％，优选80％的甲醇水溶液。该体积比的甲醇效果可消除溶剂效应，可使色谱峰的峰形尖锐、峰面积的重复性好，保证色谱图的稳定性。

本发明进一步还包括所述银杏叶提取是以银杏叶为原料，采用如下方式制备：用乙醇提取银杏叶，树脂吸附，乙醇洗脱，回收乙醇，水稀释，即得；

优选地，所述银杏叶提取液的制备方法为：银杏叶采用乙醇回流提取，回收乙醇，加水定容，采用树脂吸附，乙醇洗脱，过滤取滤液，回收乙醇，浓缩、醇沉、滤过，回收乙醇，加水稀释，即得。

具体制备银杏叶提取液工艺为：取银杏叶，净选，采用乙醇回流提取，调节PH值后静置，过滤，取滤液将乙醇回收至无醇味，再加水定容；调节PH值，离心分取上清液；采用大孔吸附树脂对所述上清液进行吸附，使用纯化水冲洗树脂柱，使用乙醇对树脂柱进行洗脱；将洗脱液过滤，取滤液将乙醇回收至无醇味，浓缩，醇沉，调节pH值，静置；过滤，取滤液将乙醇回收至无醇味，加入注射用水稀释，即得银杏叶提取液。本发明进一步还包括制备定位用对照品溶液，具体为：取总银杏酸对照品，以甲醇水溶液为溶剂溶解，即得；

采用步骤3)所述高效液相色谱法检测所述定位用对照品溶液，获得定位用对照品色谱图；

所述步骤4)依据所述对照品色谱图、所述供试品色谱图以及所述定位用对照品色谱图中各自的银杏酸峰及峰面积，采用外标法计算所述待测银杏叶提取液中总银杏酸的含量；

优选地，所述步骤4)依据所述定位用对照品色谱图，确定所述供试品色谱图中总银杏酸峰。

实际待检测样品中可能包含多种成分，这类成分需要用总银杏酸对照品来进行定位，即通过色谱图上各峰的比对进行定位；再根据供试品色谱图中总银杏酸成分的色谱峰面积总和与白果新酸对照品色谱图的峰面积进行比较，采用外标法计算这类成分的含量。

本发明进一步包括所述供试品溶液的浓度为40～65mg/mL；

所述对照品溶液的浓度为0.5～2μg/mL；

优选地，所述供试品溶液的浓度为50mg/mL；

所述对照品溶液的浓度为1μg/mL。

另外需要制备定位用对照溶液，该溶液的浓度是白果新酸对照品溶液的20倍，即对照品溶液中白果新酸C13∶0对照品溶解在所述80％甲醇中的浓度为1μg/mL，则定位用对照溶液中总银杏酸对照品溶解在所述80％甲醇中的浓度为20μg/mL。

本发明进一步包括所述采用高效液相色谱法时，所述供试品溶液与对照品溶液的进样量均为50μl。

本发明进一步包括步骤1)所述加工采用喷雾干燥法。

由于所检测银杏叶提取液样品是液体，并且银杏酚酸类物质本身在样品中的含量就极低；实验室采用的热浓缩法或者其他类似溶解方法，经常会造成样品损失，导致检测的数据不准确。发明人经过大量研究，发现若将样品制成固体粉末，可明显增强样品的溶解效果，所述固体粉末可达到待测成分浓缩富集作用。因此发明人想到采用喷雾干燥法使提取液转变为固体粉末，所述喷雾干燥法不仅大大降低了样品的损失，并且在喷雾过程中，液体成雾状会大大增加比表面积，显著提高溶解的效率和溶解率。

本发明进一步包括步骤3)所述检测条件还包括：检测波长220nm-240nm、300nm-320nm；和/或，柱温为25℃-35℃；

流速为0.8-1.2mL/min。

优选地，所述检测波长为310nm；

柱温为30℃。

本发明进一步包括所述色谱柱尺寸为：柱长150mm-200mm、250mm，柱内径4mm-5mm；

优选地，所述柱长为150mm，柱内径4.6mm；

所述填充剂的粒径为3.5-5μm，优选为5μm。

本发明的检测过程优先采用Agilent Zorbax XDB C18色谱柱，由实施例方法学考察8中，不同厂家色谱柱考察的结果可以看出Agilent色谱柱的效果最好，分离效果好于另外两根色谱柱。

作为优选方案，提供一种检测银杏叶提取液总银杏酸的方法，其中，包括以下步骤：

1)取待测银杏叶提取液，采用喷雾干燥法加工成粉末，得供试品；以百分比为70％～90％的甲醇水溶液为溶剂充分溶解，过滤，取滤液，即得供试品溶液；

2)取白果新酸对照品，以百分比为70％～90％的甲醇水溶液为溶剂溶解，即得对照品溶液；取总银杏酸对照品，以百分比为70％～90％的甲醇水溶液为溶剂溶解，即得定位用对照品溶液；

3)采用高效液相色谱法，分别对所述供试品溶液、对照品溶液及定位用对照品溶液进行检测，分别获得供试品色图谱、对照品色谱图及定位用对照品色谱图；所述检测的条件具体为：

色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相由流动相A和流动相B组成，其中，含0.1％-0.2％三氟乙酸的乙腈为流动相A，0.1％-0.2％三氟乙酸的水溶液为流动相B；按如下条件进行梯度洗脱：

0～35min：流动相A占流动相总体积的百分比由75％增加至90％；

35～36min：流动相A占流动相总体积的百分比为90％；

36～45min：流动相A占流动相总体积的百分比为90％减少至75％；

所述检测波长为310nm；所述柱温为30℃；所述柱长为150mm，柱内径4.6mm；所述填充剂的粒径为5μm。

4)依据所述定位用对照品色谱图与供试品色谱图，确定供试品溶液中总银杏酸峰及其峰面积，再与对照品色谱图中白果新酸峰面积比较，采用外标法计算所述待测银杏叶提取液中总银杏酸的含量。

本发明所提供的检测方法，是一种采用通过快速溶解、定容样品，准确、便捷的检测银杏叶提取液中总银杏酸含量的方法。本发明中制备样品溶液的方法操作简便、快捷；不仅大大提高了溶解率，几乎对样品中的银杏酸不会造成任何损失。发明人通过优化梯度洗脱条件以及色谱仪的检测条件，从而达到增加检测的准确性、便捷性，从而快速、准确的反应出待测样品中真实情况。

本发明的检测方法能够有效地判断银杏叶提取液样品中总银杏酸的含量，本发明保证其检测的稳定、均一、可控，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为总银杏酸对照品色谱图

图2为供试品色谱图

图3为白果新酸对照品色谱图(检测限)

图4为白果新酸对照品色谱图(定量限)

图5为银杏酸线性关系图

图6为1#柱总银杏酸对照品色谱图

图7为2#柱总银杏酸对照品色谱图

图8为3#柱总银杏酸对照品色谱图

图9为流速为0.8ml/min的总银杏酸对照品色谱图

图10为流速为1ml/min的总银杏酸对照品色谱图

图11流速为1.2ml/min的总银杏酸对照品色谱图

图12为柱温为25℃的总银杏酸对照品色谱图

图13为柱温为30℃的总银杏酸对照品色谱图

图14为柱温为35℃的总银杏酸对照品色谱图

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例进行详细说明；以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明实施例采用的仪器和试剂如下：

1、样品及来源

银杏叶提取液：黑龙江珍宝岛药业股份有限公司鸡西分公司

批号：B20160301(提取液457.92g，制粉5.87g)

批号：B20160302(提取液455.24g，制粉6.24g)

批号：B20160303

2、仪器

喷雾干燥机(型号：DC1500厂家：上海达程实验设备有限公司)

高效液相色谱仪(型号：Agilent 1260VL厂家：美国安捷伦公司)

高效液相色谱仪(型号：Waters e2685/2489厂家：美国沃特世公司)

超声波清洗器(型号：P180H厂家：Elma公司)

电子天平(百万分之一)(型号：MSE6.6s-OCE，厂家：德国赛多利斯公司)

电子天平(万分之一)(型号：BS224S，厂家：德国赛多利斯公司)

电子天平(百分之一)(型号：JD2000-2，厂家：沈阳龙腾电子有限公司)

色谱柱：

1#/Agilent Zorbax XDB C18 150×4.6mm 5μm(厂家：美国安捷伦公司)

2#/Waters symmtry C18 150×4.6mm 5μm(厂家：美国沃特世公司)

3#/Phenomenex Gemini C18 150×4.6mm 5μm(厂家：美国菲罗门公司)

3、试剂、对照品

三氟乙酸(级别：HPLC，厂家：天津科密欧化学试剂有限公司)

乙腈(级别：HPLC，厂家：DiKMA)

冰醋酸(级别：HPLC，厂家：国药集团化学试剂有限公司)

甲醇(级别：HPLC，厂家：DiKMA)

甲醇(级别：A.R，厂家：天津科密欧化学试剂有限公司)

白果新酸对照品(批号：111690-201403，中国食品药品检定研究院)

总银杏酸对照品(批号：111594-201304，中国食品药品检定研究院)

以下实施例中涉及到的样品提取粉均是采用喷雾干燥法制成固体粉末，并详细记录银杏叶提取液的喷入量和制粉量。

实施例1

取黑龙江珍宝岛药业股份有限公司鸡西分公司生产的批号为B20160301的银杏叶提取液，检测银杏叶提取液中总银杏酸的检测方法，包括以下步骤：

1)对照品溶液的制备：精密称取白果新酸对照品适量，加入体积百分比为80％的甲醇溶液内，其中添加比例为：每1mL80％甲醇溶液中加入1μg的白果新酸对照品。

另外再制备定位用对照品溶液：精密称取总银杏酸对照品适量，加入体积百分比为80％的甲醇溶液内，其中添加比例为：每lml80％甲醇溶液中加入20μg总银杏酸对照品，作为定位用对照溶液。

2)供试品溶液的制备：样品银杏叶提取液采用喷雾干燥法制成固体粉末，精密称取样品粉末0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入体积百分比为80％的甲醇10mL，称定重量并记录，采用超声使其溶解，自然放置常温，用体积百分比为80％的甲醇补足溶解过程中缺失的重量，使其重量与前述所记录的重量一致；摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

3)高效液相色谱法测定

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，其中色谱柱长为150mm，柱内径为4.6mm，填充剂的粒径为5μm；检测波长为310nm；流动相A为含0.1％三氟乙酸的乙腈，流动相B为含0.1％三氟乙酸的水，按如下条件进行梯度洗脱：

精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照品溶液各50μ1,注入液相色谱仪，获得供试品、对照品及定位用对照品色谱图。

4)、计算总银杏酸含量；依据定位用对照品色谱图的总银杏酸峰，确定供试品色谱图中总银杏酸峰及峰面积；以白果新酸色谱图的峰面积，采用外标法计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，计算待测样品中总银杏酸含量。

经检测，未检出样品中含有银杏酸。

采用相同的方法分别检测批号B20160302和批号B20160303的银杏提取液中银杏酸，均未检出。

实施例2

分别选择百分比为70％的甲醇溶液、百分比为80％的甲醇溶液、百分比为90％的甲醇溶液以及纯甲醇做为溶剂，进行溶剂的实验对比；

采用实施例1相同的实验方法，制备白果新酸对照品溶液及供试品溶液，仅有甲醇溶液的百分比不同，采用高效液相色谱法检测。通过测定对照品溶液的响应因子及色谱峰的对称性来考察上述不同百分比的甲醇溶剂，如表1所示：

表1 不同浓度甲醇的对比

由上述数值可知，70％的甲醇溶液、80％的甲醇溶液及90％的甲醇溶液的供试品溶液峰形都对称。

方法学考察

1、专属性试验

取总银杏酸对照品溶液与供试品溶液进样，银杏叶提取粉供试品色谱图(如图2所示)与总银杏酸对照品色谱图(如图1所示)比较，供试品色谱图中无与总银杏酸对照品的5个色谱峰保留时间相同的色谱峰，且无其它峰干扰测定，本法专属性良好。

2、检测限与定量限

采用信噪比法确定检测限与定量限，取白果新酸对照品溶液稀释至适宜浓度，注入液相色谱仪，考察其峰高与基线噪音的比值(即信噪比S/N)，如图3及图4所示，当S/N为3∶1时，此时的浓度为检测限；当S/N为10∶1时，此时的浓度为定量限。

结果：本法的检测限为3.04ng、定量限为11.16ng。

3、线性关系考察

制备浓度为10μg/mL的白果新酸对照品溶液：精密称取白果新酸对照品适量，加入体积百分比为80％的甲醇内，充分溶解，过滤，取滤液，即得白果新酸对照品溶液；其中添加比例为，每1mL甲醇水溶液中加入10μg的白果新酸对照品。分别吸取对照品溶液1μl、2μl、5μl、8μl、10μl、15μl、20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；如图5所示，以峰面积积分值为纵坐标，以进样量(ng)为横坐标，进行线性回归，回归方程为：y＝Bx+A，结果见表2。

表2 白果新酸线性关系考察结果

结果表明：银杏酸进样量在10.15ng～203.00ng之间，峰面积与进样量呈良好的线性关系。

4、精密度考察

取白果新酸对照品溶液，并按照上述高效液相色谱法的色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算峰面积平均值及相对标准偏差，结果见表3。

表3 进样精密度考察结果(n＝6)

进样次数	峰面积
		1	30.702
2	30.821
		3	31.000
4	31.196
		5	31.000
6	30.552
		平均值	30.879
RSD％	0.76

结果表明：连续6次进样银杏酸峰面积的RSD值为0.76％，说明仪器进样精密度良好。

5、重复性考察

取本品制备供试品溶液，平行制备六份，按上述高效液相色谱法的色谱条件进样，记录色谱图，计算含量，结果见表4。

表4 银杏叶提取液重复性试验结果(n＝6)

结果表明：六份平行银杏叶提取液样品总银杏酸含量结果均未检出，重复性试验良好。

6、稳定性试验

取对照品溶液及供试品溶液，按上述高效液相色谱法的色谱条件分别在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20、24小时进样测定其峰面积，考察供试品溶液的稳定性，结果见表5、表6。

表5 白果新酸溶液稳定性考察结果

时间(小时)	峰面积
		0	30.778
2	31.182
		4	30.619
6	31.031
		8	31.226
12	30.998
		16	30.784
20	30.950
		24	31.307
平均值	30.986
		RSD％	0.26

结果表明：不同进样时间银杏酸峰面积的RSD值为0.26％，对照品溶液在24小时内稳定性良好。

表6 银杏叶提取液供试品溶液稳定性考察结果

结果表明：六份平行银杏叶提取液样品总银杏酸含量结果均未检出。

7、回收率试验

制备白果新酸对照品溶液：精密称取白果新酸对照品10.15mg，置于100ml量瓶中，加入甲醇使用溶解并定容至量瓶刻度，制成每1ml甲醇中含银杏酸0.1mg的对照品贮备液。精密量取对照品贮备液1ml，置于100ml量瓶中，加适量甲醇及20ml水混匀后用甲醇稀释至量瓶刻度混匀，即得浓度为1.015μg/ml的白果新酸对照品溶液。

其中，银杏叶提取液(批号B20160302)：455.24g制粉量6.24g，总银杏酸含量(ng/g)：未检出

加样回收供试品溶液制备：取银杏叶提取物粉0.25g,精密称定，置具塞锥形瓶中，平行操作12份；其中6份分别精密加入10ml浓度为1.015μg/ml的白果新酸对照品溶液，称定重量，超声溶解，冷却至室温，采用体积百分比为80％甲酵补足在前述操作中缺失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

其中3份分别精密加入5ml浓度为1.015μg/ml的白果新酸对照品溶液，再精密加入5ml体积百分比为80％的甲醇,称定重量，超声溶解，冷却至室温，采用体积百分比为80％甲酵补足在前述操作中缺失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

其中3份分别精密加入2ml浓度为1.015μg/ml的白果新酸对照品溶液，再精密加入8ml体积百分比为80％的甲醇,称定重量，超声溶解，冷却至室温，采用体积百分比为80％甲酵补足在前述操作中缺失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

按上述高效液相色谱法的色谱条件进样，测定回收率，结果见表7。

表7 银杏叶提取物粉白果新酸加样回收试验(n＝6)

结果表明：银杏叶提取物粉白果新酸加样回收样品平均回收率为：96.7％，12个样品RSD值为3.10％，该方法测定总银杏酸准确度良好。

8、不同厂家色谱柱考察

分别采用三种不同厂家填料的色谱柱，取总银杏酸对照品溶液按上述高效液相色谱法的色谱条件的方法进样，考察对照品五个峰与相临色谱峰的最小分离度。(如图6-8所示))

表8 不同厂家色谱柱考察

色谱柱	峰1(银杏酸)	峰2	峰3	峰4	峰5
						1#	2.60	2.60	4.13	1.55	1.55
2#	1.36	1.36	3.36	11.66	11.66
						3#	1.44	1.44	2.58	0.81	0.81

结果表明：2#色谱柱和3#色谱柱对总银杏酸五个成分分离情况不如1#柱理想，故标准方法使用1#色谱柱效果最好。

9、流速考察

取总银杏酸对照品溶液按上述高效液相色谱法的色谱条件的方法进样，其中色谱柱采用1#色谱柱。

流动相流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min，进样考察流速的变化对总银杏酸对照品五个峰与相临色谱峰分离度的影响。(如图9-11所示)

表9 流速考察

流速	峰1(白果新酸)	峰2	峰3	峰4	峰5
						0.8	2.55	2.55	4.08	1.45	1.45
1.0	2.64	2.64	4.18	1.55	1.55
						1.2	2.66	2.66	4.21	1.61	1.61

结果表明：使用1#色谱柱，在0.8ml/min～1.2ml/min流速下能够将总银杏酸对照品五个成分较好分离。

10、柱温考察

取总银杏酸对照品溶液按上述高效液相色谱法的色谱条件的方法进样，其中柱温分别设置为25℃、30℃、35℃，进样考察柱温的变化对总银杏酸对照品五个峰与相临色谱峰分离度的影响。(如图12-14所示)

表10 柱温考察

柱温	峰1(白果新酸)	峰2	峰3	峰4	峰5
						25℃	2.54	2.54	4.15	1.29	1.29
30℃	2.63	2.63	4.15	1.55	1.55
						35℃	2.68	2.68	4.14	1.75	1.75

结果表明：柱温为25℃时总银杏酸对照品五个成分峰分离较稍差；柱温为30℃时效果最优

11、中间精密度考察

上述实验由化验员A完成，再安排化验员B于不同日期，使用另外一台液相色谱仪(与上述化验员A使用的不是同一台)，按照上述方法，考察总银杏酸对照品五个峰与相临色谱峰的最小分离度。

表11 中间精密度考察

条件	峰1(银杏酸)	峰2	峰3	峰4	峰5
						人员A/安仪器	2.63	2.63	4.15	1.55	1.55
人员B/沃仪器	2.96	2.96	4.79	1.68	1.68

结果表明：所检测的总银杏酸对照品中，五个成分峰分离度无明显差异，表明随机变动因素对精密度影响较小，该方法准确可靠。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种检测银杏叶提取液中总银杏酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)取待测银杏叶提取液，加工成粉末，得供试品；以甲醇水溶液为溶剂充分溶解，过滤，取滤液，即得供试品溶液；

2)取白果新酸对照品，以甲醇水溶液为溶剂溶解，即得对照品溶液；

3)采用高效液相色谱法，分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测，分别获得供试品色图谱和对照品色谱图；所述检测的条件具体为：

色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相由流动相A和流动相B组成，其中，含0.1％-0.2％三氟乙酸的乙腈为流动相A，0.1％-0.2％三氟乙酸的水溶液为流动相B；按如下条件进行梯度洗脱：

0～35min：流动相A占流动相总体积的百分比由75％增加至90％；

35～36min：流动相A占流动相总体积的百分比为90％；

36～45min：流动相A占流动相总体积的百分比为90％减少至75％；

4)依据所述对照品色谱图与所述供试品色谱图中各自的银杏酸峰面积，采用外标法计算所述待测银杏叶提取液中总银杏酸的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述银杏叶提取液的制备方法为：用乙醇提取银杏叶，树脂吸附，乙醇洗脱，回收乙醇，水稀释，即得；

优选地，所述银杏叶提取液的制备方法为：银杏叶采用乙醇回流提取，回收乙醇，加水定容，采用树脂吸附，乙醇洗脱，过滤取滤液，回收乙醇，浓缩、醇沉、滤过，回收乙醇，加水稀释，即得。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述甲醇为体积百分比浓度70％-90％的甲醇水溶液，优选为80％的甲醇水溶液。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，还包括制备定位用对照品溶液，制备所述定位用对照品溶液具体为：取总银杏酸对照品，以甲醇水溶液为溶剂溶解，即得；

采用步骤3)所述高效液相色谱法检测所述定位用对照品溶液，获得定位用对照品色谱图；

步骤4)依据所述对照品色谱图、所述供试品色谱图以及所述定位用对照品色谱图中各自的银杏酸峰及峰面积，采用外标法计算所述待测银杏叶提取液中总银杏酸的含量；

优选地，步骤4)依据所述定位用对照品色谱图，确定所述供试品色谱图中总银杏酸峰。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法时，所述供试品溶液与所述对照品溶液的进样量均为50μl。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述步骤1)所述加工采用喷雾干燥法。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述检测条件还包括：检测波长220nm-240nm、300nm-320nm；和/或，柱温为25℃-35℃；和/或，流速为0.8-1.2mL/min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测波长为310nm；和/或，所述柱温为30℃。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述色谱柱尺寸为：柱长150mm-200mm、250mm，柱内径4mm-5mm；和/或，所述填充剂的粒径为3.5-5μm；

优选地，所述柱长为150mm，柱内径4.6mm；和/或，所述填充剂的粒径为5μm。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其他特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)取待测银杏叶提取液，采用喷雾干燥法加工成粉末，得供试品；以百分比为70％～90％的甲醇水溶液为溶剂充分溶解，过滤，取滤液，即得供试品溶液；

2)取白果新酸对照品，以百分比为70％～90％的甲醇水溶液为溶剂溶解，即得对照品溶液；取总银杏酸对照品，以百分比为70％～90％的甲醇水溶液为溶剂溶解，即得定位用对照品溶液；

3)采用高效液相色谱法，分别对所述供试品溶液、对照品溶液及定位用对照品溶液进行检测，分别获得供试品色图谱、对照品色谱图及定位用对照品色谱图；所述检测的条件具体为：

色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相由流动相A和流动相B组成，其中，含0.1％-0.2％三氟乙酸的乙腈为流动相A，0.1％-0.2％三氟乙酸的水溶液为流动相B；按如下条件进行梯度洗脱：

0～35min：流动相A占流动相总体积的百分比由75％增加至90％；

35～36min：流动相A占流动相总体积的百分比为90％；

36～45min：流动相A占流动相总体积的百分比为90％减少至75％；

所述检测波长为310nm；所述柱温为30℃；所述柱长为150mm，柱内径4.6mm；所述填充剂的粒径为5μm；

4)依据所述定位用对照品色谱图与供试品色谱图，确定供试品色谱图总银杏酸峰及其峰面积，再与对照品色谱图中白果新酸峰面积比较，采用外标法计算所述待测银杏叶提取液中总银杏酸的含量。