CN105628851B - 一种中药制剂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药制剂的检测方法，利用该检测方法测定中药制剂有效成分含量，确保药品质量符合药品标准，进而保证其疗效稳定。本发明检测方法包括：利用TLC法对其中牛膝、丹参、栀子、淫羊藿和决明子进行定性鉴别以及用HPLC法对其中的丹酚酸B和天麻素的含量进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药制剂的检测方法，属于中药技术领域。
背景技术
丹膝颗粒由丹参、牛膝、天麻、牡丹皮等12味中药组成。传统医学认为其具有养阴平肝，熄风通络，清热除烦的功效，用于中风病中经络恢复期瘀血阻络兼肾虚证，症见半身不遂，口舌歪斜，舌强语蹇，偏身麻木，头晕目眩，腰膝酸软等，效果较好。目前该制剂的质量控制标准尚不完善且部分鉴别操作繁琐，无法简便有效地定性定量检测中药制剂有效成分。
发明内容
本发明的目的是提供一种丹膝颗粒的检测方法，利用该检测方法，可简便有效地定性定量检测中药制剂有效成分，确保对药品质量有效控制。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种中药制剂丹膝颗粒的检测方法，其特征在于包括：利用TLC法对其中牛膝、丹参、栀子、淫羊藿和决明子进行定性鉴别以及用HPLC法对其中的丹酚酸B和天麻素的含量进行测定。
所述的牛膝、丹参、栀子、淫羊藿和决明子的定性鉴别包括如下步骤：
A.牛膝的TLC法鉴别：取丹膝颗粒20g，研细，加乙醇30～80mL，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液蒸干，加水15mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，合并水洗液，备用；正丁醇液蒸干，残渣加乙醇5mL使溶解，加入中性氧化铝柱(100～200目，10g，直径1.5cm)，先用乙酸乙酯40mL洗脱，乙酸乙酯液备用；再用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5～15μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B.丹参的TLC法鉴别：取A项下的备用乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材1g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液；再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
C.栀子的TLC法鉴别：取A项下的备用水洗液，蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取栀子对照药材0.5g，加乙醇30mL，超声处理10～40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为对照药材溶液；再取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各1～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
D.淫羊藿的TLC法鉴别：取丹膝颗粒16g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿对照药材1g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，制成对照药材溶液；再取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各3～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
E.决明子的TLC法鉴别：取丹膝颗粒10g，研细，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流20～40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；另取决明子对照药材0.2g，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流20～40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，制成对照药材溶液；再取大黄酚对照品、大黄素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。
上述对牛膝、丹参、栀子、淫羊藿和决明子的定性鉴别可进一步优选为如下步骤：
A.牛膝的TLC法鉴别：取丹膝颗粒20g，研细，加乙醇50mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，加水15mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，合并水洗液，备用；正丁醇液蒸干，残渣加乙醇5mL使溶解，加入中性氧化铝柱(100～200目，10g，直径1.5cm)，先用乙酸乙酯40mL洗脱，乙酸乙酯液备用；再用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B.丹参的TLC法鉴别：取鉴别A项下的备用乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材1g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液；再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
C.栀子的TLC法鉴别：取鉴别A项下的备用水洗液，蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取栀子对照药材0.5g，加乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为对照药材溶液；再取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
D.淫羊藿的TLC法鉴别：取丹膝颗粒16g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿对照药材1g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，制成对照药材溶液；再取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
E.决明子的TLC法鉴别：取丹膝颗粒10g，研细，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；另取决明子对照药材0.2g，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，制成对照药材溶液；再取大黄酚对照品、大黄素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。
所述的丹酚酸B的含量测定，照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录ⅥD试验，步骤如下：
(1)色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10:1:59)，等度洗脱；流速：0.8～1.2mL·min-1；检测器为UV，检测波长：280～290nm，优选值为283～288nm，更优选为286nm；柱温30～40℃；进样量5～20μL；理论板数按丹酚酸B计不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：取丹膝颗粒粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂50mL，塞密，称定重量，用一定方法提取适当时间，放冷，再称定重量，用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；其中所述的丹膝颗粒粉末为粗粉；所述的提取溶剂可以为乙醇、甲醇、20％甲醇、50％甲醇或75％甲醇中的任一一种，优选为75％甲醇，所述的提取方法可以为超声提取法、回流提取法、闪式提取法或索式提取法中的任一一种，优选回流提取法；所述的提取适当时间为30～90min，优选为60min。
本发明中用HPLC法测定所述丹膝颗粒中丹酚酸B含量，规定所述丹膝颗粒中丹酚酸B含量不得低于3.60mg/g。
所述的天麻素的含量测定，照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D试验，步骤如下：
(1)色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.05％磷酸(3:97)，等度洗脱；流速：0.8～1.2mL·min-1；检测波长：210～230nm，优选为220nm；柱温30～40℃；进样量5～20μL。理论板数按天麻素计不低于5000；
(2)对照品溶液的制备：取天麻素对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含50μg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：取本品粉末约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂50mL，塞密，称定重量，用一定方法提取适当时间，放冷，再称定重量，用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加60％～80％乙醇2mL使溶解，加在中性氧化铝(100～200目，10g，内径为1～1.5cm)上，用60％～80％乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加水溶解，并转移至5mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；其中所述的丹膝颗粒粉末为粗粉；所述的提取溶剂为乙醇、甲醇、30％甲醇、50％甲醇或70％甲醇中的任一一种，优选为甲醇；所述的提取方法为超声提取法、回流提取法、闪式提取法或索式提取法中的任一一种，优选回流提取法；所述的提取适当时间为30～90min，优选为60min。
本发明用HPLC法测定所述丹膝颗粒中天麻素含量，规定所述丹膝颗粒中天麻素含量不得低于0.15mg/g。
为了更好地理解本发明，以下通过试验例进一步阐述本发明的有益效果，旨在说明本发明的作用，而非限制本发明。
发明人对丹膝颗粒的检测方法进行了深入研究，详述如下：
1.丹酚酸B含量测定：
照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D试验，并进行方法学考察，试验如下：
1.1仪器与试药：Waters 2695-2998高效液相色谱仪；DZKW型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；KQ-300DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CP225D型电子分析天平；AY220型电子分析天平(日本岛津公司)；色谱柱：HypersilODS-2(250×4.6mm,5μm)和Kromasil 100-C18(250×4.6mm,5μm)；
丹酚酸B(含量以95.4％计，批号：111562-201212，中国药品生物制品检定所)，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。丹膝颗粒样品批次依次为：20121211、20130116、20130311、20130516、20130913、20131111、20131113、20131210、20140217、20140428，所有批次样品研细后备用。
1.2方法与结果
1.2.1对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，置于25mL量瓶中，加入适量75％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.1919mg/mL的对照品母液。精密吸取对照品母液2.0mL置于10mL量瓶中，用75％甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.03839mg/mL的对照品溶液。
1.2.2检测波长的选择：精密吸取对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，于200～400nm波长范围内扫描，结果丹酚酸B在255.9nm、288.0nm、309.4nm波长处有最大吸收，因中国药典2010版一部70页“丹参药材”项下含量测定方法丹酚酸B的检测波长为286nm，故选择286nm作为检测波长。结果见附图1。
1.2.3流动相的选择：本实验考察了甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10:1:59)(《中国药典》2010年版一部70页丹参药材含量测定项下丹酚酸B方法)、乙腈-0.1％甲酸(22:78)(《中国药典》2010年版一部766页利脑心胶囊含量测定项下丹酚酸B方法、甲醇-1％醋酸(38:62)(《中国药典》2010年版一部806页软脉灵口服液含量测定项下丹酚酸B方法)三种流动相。结果甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10:1:59)流动相下丹酚酸B保留时间适宜，图谱基线较为平滑，分离度良好，故选择其作为流动相。
1.2.4供试品溶液的制备
1.2.4.1提取溶剂的选择：取20131111批次粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入20％甲醇、50％甲醇、75％甲醇、甲醇、乙醇50mL，平行两份，塞密，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，结果见表1。
表1 提取溶剂的选择含量测定结果比较
结果表明：75％甲醇提取丹酚酸B含量最高，峰形好，故选择用75％甲醇作为提取溶剂。
1.2.4.2提取方法与时间的选择：取20131111批次粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50mL，塞密，称定重量，分别超声0.5h、1h、1.5h和回流0.5h、1h、1.5h，各平行两份，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见表2。
表2 提取方法与时间的选择含量测定结果比较
结果表明：回流提取法总体超声提取法较提取率高。回流提取1h比超声提取0.5h和1.5h的样品丹酚酸B含量高，提取丹酚酸B较为完全，故选择回流提取1h作为提取方法与时间。
综合上述的考察结果，供试品溶液的制备方法确定为：取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50mL，塞密，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.2.5专属性考察：按处方量制备缺丹参的阴性样品。按上述供试品制备方法制成缺丹参的阴性对照溶液，依法测定。结果表明：阴性对照的色谱图中，在丹酚酸B对照品色谱峰的相对应的保留时间处无色谱峰，说明阴性对照样品无干扰，结果见附图2～4。
1.2.6线性关系考察：分别精密吸取对照品母液1.5mL、2.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL置于50mL、25mL、10mL、10mL、10mL量瓶中，加75％甲醇稀释至刻度，得到一系列不同浓度的对照品溶液。分别进样10μL，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归。回归方程为：y＝1*107x-46345，r＝0.9993。结果表明丹酚酸B在0.005757～0.1919mg/mL范围内线性关系良好。结果见附图5。
1.2.7检测限：精密吸取对照品溶液(0.005757mg/mL)3mL，置于10mL量瓶中，用75％甲醇稀释至刻度，即得。精密吸取2μL，注入高效液相色谱仪，s/n约为3，测定结果为3.454ng。
1.2.8定量限：精密吸取对照品溶液(0.005757mg/mL)2μL，注入高效液相色谱仪，s/n约为10，定量限为11.51ng。连续测定6次，峰面积平均值为10287.0，RSD为2.82％。结果见表3。
表3 定量限试验结果
1.2.9精密度试验：精密吸取同一供试品溶液(批号：20131111)，连续进样6次，每次10μl，测定，结果丹酚酸B峰面积的RSD为0.45％，表明仪器精密度良好。结果见表4。
表4 精密度试验结果
1.2.10稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于配制后的0、2、4、8、16、24小时，精密吸取10μl，注入高效液相色谱仪，测定，结果见表5。结果表明供试品溶液在配制后24小时内稳定。
表5 稳定性试验结果
1.2.11重复性试验：取同一批号(20131111)样品，照供试品溶液项下制备6份供试品溶液，测定，结果见表6。结果表明本方法重复性良好。
表6 重复性试验结果
1.2.12加样回收试验：取已知含量为5.61mg/g的样品粉末约0.25g，共6份，精密称定。分别精密加入浓度为1.898mg/mL的丹酚酸B对照品溶液。精密加入75％甲醇50mL，塞密，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果测得平均回收率为101.36％，RSD为2.19％。结果见表7。
表7 加样回收试验测定结果
1.2.13耐用性试验：采用拟定的方法，使用2个不同品牌的色谱柱对三批样品进行测定，结果表明该方法耐用性良好。结果见表8。
表8 耐用性试验结果
| 批号 | Kromasil 100-C18(250*4.6mm,5μm) | Hypersil ODS-2(250*4.6mm,5μm) | 相对偏差(％) |
| 20131111 | 6.04 | 6.16 | 1.39 |
| 20131210 | 5.00 | 5.23 | 3.18 |
| 20130311 | 4.77 | 4.94 | 2.48 |
1.2.14样品含量测定：取10个批次样品，照供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，依次进样10μL，结果见表9。
表9 样品含量测定结果
| 批号 | 含量(mg/g) |
| 20121211 | 2.87 |
| 20130116 | 4.89 |
| 20130311 | 4.43 |
| 20130516 | 4.99 |
| 20130913 | 3.97 |
| 20131111 | 5.52 |
| 20131113 | 4.70 |
| 20131210 | 4.83 |
| 20140217 | 5.58 |
| 20140428 | 5.36 |
2.天麻素含量测定：
照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录ⅥD试验，并进行方法学考察，试验如下：
2.1仪器与试药：Waters 2695-2998高效液相色谱仪；DZKW型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；KQ-300DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CP225D型电子分析天平；AY220型电子分析天平(日本岛津公司)；色谱柱：HypersilODS-2(250×4.6mm,5μm)、Kromasil 100-C18(250×4.6mm,5μm)和Inertsil ODS-3(250×4.6mm,5μm)；
天麻素(批号：0807-9702，中国药品生物制品检定所)，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。丹膝颗粒样品批次依次为：20121211、20130116、20130311、20130516、20130913、20131111、20131113、20131210、20140217、20140428，所有批次样品研细后备用。
2.2方法与结果
2.2.1对照品溶液的制备：取天麻素对照品适量，精密称定，置于25mL量瓶中，加适量水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.6612mg/mL的对照品母液。精密吸取对照品母液0.8mL置于10mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀制成质量浓度为0.05290mg/mL的对照品溶液。
2.2.2检测波长的选择：精密吸取对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，于200～400nm波长范围内扫描，结果天麻素在220.5nm、269.0nm波长处有最大吸收，因中国药典2010版一部54页“天麻药材”含量测定项下天麻素的检测波长为220nm，故选择220nm作为检测波长。结果见附图6。
2.2.3流动相的选择：本实验考察了乙腈-0.05％磷酸(3:97)(《中国药典》2010年版一部54页天麻药材含量测定项下天麻素方法)、甲醇(A)-1％冰醋酸(B)[0～10min(13％A),10～15min(13％～40％A),15～35min(40％～70％A),35～40min(70％～13％A),40～43min(13％A)](赵辉,武晓红,蒲晓辉.HPLC法同时测定天舒胶囊中阿魏酸和天麻素[J].中成药,2014,36(1):111-114.)、甲醇-0.1％磷酸(3:97)(马宏达,史国兵,安晔,等.天宁颗粒的质量标准研究[J].解放军药学学报,2013,29(1):55-56,59.)三种流动相。结果乙腈-0.05％磷酸(3:97)流动相下天麻素保留时间适宜，图谱基线较为平滑，分离度良好，故选择其作为流动相。
2.2.4供试品溶液的制备
2.2.4.1提取溶剂的选择：取20131111批次粉末约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇50mL，平行两份，塞密，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％乙醇2mL使溶解，加在中性氧化铝(100～200目，10g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加水溶解，并转移至5mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，结果见表10。
表10 提取溶剂的选择含量测定结果比较
结果表明：甲醇提取天麻素含量最高，故选择用甲醇作为提取溶剂。
2.2.4.2提取方法与时间的选择：取20131111批次粉末约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，塞密，称定重量，分别超声0.5h、1h、1.5h和回流0.5h、1h、1.5h，各平行两份，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％乙醇2mL使溶解，加在中性氧化铝(100～200目，10g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加水溶解，并转移至5mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。结果见表11。
表11 提取方法与时间的选择含量测定结果比较
结果表明：回流提取法较超声提取法提取率高。其中回流提取1h较回流提取0.5h和1h提取率高，故选择回流提取1h作为较佳的提取方法与时间。
综合上述的考察结果，供试品溶液的制备方法确定为：取本品粉末约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，塞密，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％乙醇2mL使溶解，加在中性氧化铝(100～200目，10g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加水溶解，并转移至5mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
2.2.5专属性考察：按处方量制备缺天麻的阴性样品。按上述供试品制备方法制成缺天麻的阴性对照溶液，依法测定。结果表明：阴性对照的色谱图中，在天麻素对照品色谱峰的相对应的保留时间处无色谱峰，说明阴性对照样品无干扰，结果见附图7～9。
2.2.6线性关系考察：分别精密吸取对照品母液1.0mL、1.0mL、1.0mL、0.8mL、0.8mL、2.0mL置于100mL、50mL、25mL、10mL、5mL、5mL量瓶中，加水稀释至刻度，得到一系列不同浓度的对照品溶液。分别进样10μL，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归。回归方程为：y＝17747x+8964.6，r＝0.9999。结果表明天麻素在0.006612～0.2645mg/mL范围内线性关系良好。结果见图10。
2.2.7检测限：精密吸取对照品溶液(0.006612mg/mL)3μL，注入高效液相色谱仪，s/n约为3，测定结果为1.984ng。
2.2.8定量限：精密吸取对照品溶液(0.006612mg/mL)10μL，注入高效液相色谱仪，s/n约为10，定量限为6.612ng。连续测定6次，峰面积平均值为12445.7，RSD为3.58％。结果见表12。
表12 定量限试验结果
2.2.9精密度试验：精密吸取同一供试品溶液(批号：20131111)，连续进样6次，每次10μl，测定，结果见表13。结果天麻素峰面积的RSD为0.24％，表明仪器精密度良好。
表13 精密度试验结果
2.2.10稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于配制后的0、2、4、8、16、24小时，精密吸取10μl，注入高效液相色谱仪，测定，结果见表14。结果表明供试品溶液在配制后24小时内稳定。
表14 稳定性试验结果
2.2.11重复性试验：取同一批号(20131111)样品，照供试品溶液项下制备6份供试品溶液，测定，结果见表15。结果表明本方法重复性良好。
表15 重复性试验结果
2.2.12加样回收试验：取已知含量为0.3900mg/g的样品粉末约1.25g，共6份，精密称定。分别精密加入浓度为0.5290mg/mL的天麻素对照品溶液。精密加入甲醇50mL，塞密，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％乙醇2mL使溶解，加在中性氧化铝(100～200目，10g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加水溶解，并转移至5mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。结果测得平均回收率为97.34％，RSD为2.32％。结果见表16。
表16 加样回收试验测定结果
2.2.13耐用性试验：采用拟定的方法，使用3个不同品牌的色谱柱对三批样品进行测定，结果表明该方法耐用性良好。结果见表17。
表17 耐用性试验结果
2.2.14样品含量测定：取10个批次样品，照供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，依次进样，结果见表18。
表18 样品含量测定结果
| 批号 | 含量(mg/g) |
| 20121211 | 0.2427 |
| 20130116 | 0.2470 |
| 20130311 | 0.1996 |
| 20130516 | 0.1882 |
| 20130913 | 0.2644 |
| 20131111 | 0.4071 |
| 20131113 | 0.2878 |
| 20131210 | 0.2914 |
| 20140217 | 0.1177 |
| 20140428 | 0.2414 |
3.薄层鉴别
3.1牛膝的TLC法鉴别：取丹膝颗粒20g，研细，加乙醇50mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，加水15mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，合并水洗液，备用。正丁醇液蒸干，残渣加乙醇5mL使溶解，加入中性氧化铝柱(100～200目，10g，直径1.5cm)，先用乙酸乙酯40mL洗脱，乙酸乙酯液备用；再用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；见附图11。
3.2丹参的TLC法鉴别：取鉴别3.1项下的备用乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材1g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液。再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；见附图12。
C.栀子的TLC法鉴别：取鉴别A项下的备用水洗液，蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取栀子对照药材0.5g，加乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为对照药材溶液。再取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；见附图13。
D.淫羊藿的TLC法鉴别：取丹膝颗粒16g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取淫羊藿对照药材1g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，制成对照药材溶液。再取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；见附图14。
E.决明子的TLC法鉴别：取丹膝颗粒10g，研细，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取决明子对照药材0.2g，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，制成对照药材溶液。再取大黄酚对照品、大黄素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色；见附图15。
本发明的有益效果：
(1)对君药丹参和牛膝进行了薄层色谱鉴别，且对丹参、牛膝、栀子的薄层鉴别供试品可以一次制备过程中都制备出来，简化了操作步骤、操作时间和溶剂使用量。
(2)对丹膝颗粒中丹参和天麻进行了含量测定，比原方法中只检测专属性不够高的齐墩果酸具有更强的专属性。
(3)本发明所述检测方法，是一种检测项目更全面，含量测定方法较好，质量控制指标更科学、合理，操作更简化的能进一步确保药品安全和疗效的质量控制方法。本发明的定性定量检测方法，既可以用于丹膝颗粒的定性定量检测，又可以用来对相同处方的其他剂型如胶囊、颗粒等剂型的定性定量检测。
附图说明
图1为丹酚酸B对照品溶液紫外全波长扫描图
图2为丹酚酸B对照品HPLC色谱图
图3为丹膝颗粒供试品溶液HPLC色谱图
图4为缺丹参阴性样品溶液HPLC色谱图
图5为丹酚酸B标准曲线图
图6为天麻素对照品溶液紫外全波长扫描图
图7为天麻素对照品HPLC色谱图
图8为丹膝颗粒供试品溶液HPLC色谱图
图9为缺天麻阴性样品溶液HPLC色谱图
图10为天麻素标准曲线图
图11牛膝薄层鉴别图
图12丹参薄层鉴别图
图13栀子薄层鉴别图
图14淫羊藿薄层鉴别图
图15决明子薄层鉴别图
图2 保留时间：7.369min；理论塔板：6445；对称因子：1.07
图3 保留时间：7.459min；理论塔板：4932；对称因子：1.11
图7 保留时间：10.668min；理论塔板：14087；对称因子：1.08
图8 保留时间：10.659min；理论塔板：14366；对称因子：1.09
图11 1-缺牛膝阴性样品；2、3-β-蜕皮甾酮对照品；4～13-丹膝颗粒1～10批样品
图12 1-缺丹参阴性样品；2-丹参酮IIA对照品；3-丹参对照药材；4～13-丹膝颗粒1～10批样品
图13 1-缺栀子阴性样品；2-栀子苷对照品；3-栀子对照药材；4～13-丹膝颗粒1～10批样品
图14 1-缺淫羊藿阴性样品；2-淫羊藿苷对照品；3-淫羊藿对照药材；4～13-丹膝颗粒1～10批样品
图15 1-缺决明子阴性样品；2-大黄素、大黄酚对照品；3-决明子对照药材；4～13-丹膝颗粒1～10批样品
具体实施方式
实施例1
丹膝颗粒批号：20131111
1、鉴别
A.牛膝的TLC法鉴别：取丹膝颗粒20g，研细，加乙醇50mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，加水15mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，合并水洗液，备用。正丁醇液蒸干，残渣加乙醇5mL使溶解，加入中性氧化铝柱(100～200目，10g，直径1.5cm)，先用乙酸乙酯40mL洗脱，乙酸乙酯液备用；再用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B.丹参的TLC法鉴别：取鉴别A项下的备用乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材1g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液。再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
C.栀子的TLC法鉴别：取鉴别A项下的备用水洗液，蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取栀子对照药材0.5g，加乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为对照药材溶液。再取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
D.淫羊藿的TLC法鉴别：取丹膝颗粒16g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取淫羊藿对照药材1g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，制成对照药材溶液。再取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
E.决明子的TLC法鉴别：取丹膝颗粒10g，研细，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取决明子对照药材0.2g，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，制成对照药材溶液。再取大黄酚对照品、大黄素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。
2、含量测定
(1)丹酚酸B照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10:1:59)为流动相；流速：0.8mL·min-1；检测波长：286nm；柱温35℃；进样量10μL；理论板数按丹酚酸B计不低于3000。
对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成没1mL含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50mL，塞密，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
含量测定结果：本批次每1g含丹参按丹酚酸B(C36H30O16)计，为5.52mg。
(2)天麻素照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05％磷酸(3:97)为流动相；流速：1.0mL·min-1；检测波长：220nm；柱温40℃；进样量10μL。理论板数按天麻素计不低于5000。
对照品溶液的制备：取天麻素对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含天麻素50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，塞密，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％乙醇2mL使溶解，加在中性氧化铝(100～200目，10g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加水溶解，并转移至5mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
含量测定结果：本批次每1g含天麻按天麻素(C13H18O7)计，为0.41mg。
实施例2
丹膝颗粒批号：20131113
1、鉴别
A.牛膝的TLC法鉴别：取丹膝颗粒20g，研细，加乙醇80mL，加热回流1.5小时，滤过，滤液蒸干，加水15mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，合并水洗液，备用。正丁醇液蒸干，残渣加乙醇5mL使溶解，加入中性氧化铝柱(100～200目，10g，直径1.5cm)，先用乙酸乙酯40mL洗脱，乙酸乙酯液备用；再用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各15μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B.丹参的TLC法鉴别：取鉴别A项下的备用乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材1g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液。再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
C.栀子的TLC法鉴别：取鉴别A项下的备用水洗液，蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取栀子对照药材0.5g，加乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为对照药材溶液。再取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
D.淫羊藿的TLC法鉴别：取丹膝颗粒16g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取淫羊藿对照药材1g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，制成对照药材溶液。再取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
E.决明子的TLC法鉴别：取丹膝颗粒10g，研细，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取决明子对照药材0.2g，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，制成对照药材溶液。再取大黄酚对照品、大黄素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶3∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。
2、含量测定
(1)丹酚酸B照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-甲酸-水(30:10:1:59)为流动相；流速：0.8mL·min-1；检测波长：283nm；柱温35℃；进样量10μL；理论板数按丹酚酸B计不低于3000。
对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成没1mL含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，塞密，称定重量，超声提取1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
含量测定结果：本批次每1g含丹参按丹酚酸B(C36H30O16)计，为5.36mg。
(2)天麻素照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05％磷酸(3:97)为流动相；流速：1.0mL·min-1；检测波长：215nm；柱温40℃；进样量10μL。理论板数按天麻素计不低于5000。
对照品溶液的制备：取天麻素对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含天麻素50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，塞密，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％乙醇2mL使溶解，加在中性氧化铝(100～200目，10g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加水溶解，并转移至5mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。含量测定结果：本批次每1g含天麻按天麻素(C13H18O7)计，为0.39mg。
Claims (8)
1.一种中药制剂丹膝颗粒的检测方法，其特征在于，包括：利用TLC法对牛膝、丹参、栀子、淫羊藿和决明子进行定性鉴别以及用HPLC法对丹酚酸B和天麻素的含量进行测定；其中所述的牛膝、丹参、栀子、淫羊藿和决明子的定性鉴别包括如下步骤：
A.牛膝的TLC法鉴别：取丹膝颗粒20g，研细，加乙醇30～80mL，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液蒸干，加水15mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，合并水洗液，备用；正丁醇液蒸干，残渣加乙醇5mL使溶解，加入中性氧化铝柱，柱规格为100～200目、10g、直径1.5cm； 先用乙酸乙酯40mL洗脱，乙酸乙酯液备用；再用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～15μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为4∶1的乙酸乙酯-乙醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B.丹参的TLC法鉴别：取A项下的备用乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材1g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液；再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为12∶3∶0.15的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
C.栀子的TLC法鉴别：取A项下的备用水洗液，蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取栀子对照药材0.5g，加乙醇30mL，超声处理10～40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为对照药材溶液；再取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为4∶1的乙酸乙酯-乙醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
D.淫羊藿的TLC法鉴别：取丹膝颗粒16g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿对照药材1g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，制成对照药材溶液；再取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各3～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为10∶1∶1∶1乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
E.决明子的TLC法鉴别：取丹膝颗粒10g，研细，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流20～40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；另取决明子对照药材0.2g，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流20～40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，制成对照药材溶液；再取大黄酚对照品、大黄素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为12∶3∶0.15环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的牛膝、丹参、栀子、淫羊藿和决明子的定性鉴别包括如下步骤：
A.牛膝的TLC法鉴别：取丹膝颗粒20g，研细，加乙醇50mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，加水15mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，合并水洗液，备用；正丁醇液蒸干，残渣加乙醇5mL使溶解，加入中性氧化铝柱，柱规格为100～200目、10g、直径1.5cm，先用乙酸乙酯40mL洗脱，乙酸乙酯液备用；再用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为4∶1乙酸乙酯-乙醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B.丹参的TLC法鉴别：取鉴别A项下的备用乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材1g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液；再取丹参酮IIA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为12∶3∶0.15环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
C.栀子的TLC法鉴别：取鉴别A项下的备用水洗液，蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取栀子对照药材0.5g，加乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为对照药材溶液；再取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为4∶1乙酸乙酯-乙醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
D.淫羊藿的TLC法鉴别：取丹膝颗粒16g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿对照药材1g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，制成对照药材溶液；再取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为10∶1∶1∶1乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
E.决明子的TLC法鉴别：取丹膝颗粒10g，研细，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；另取决明子对照药材0.2g，加乙酸乙酯30ml，盐酸1ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，制成对照药材溶液；再取大黄酚对照品、大黄素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为12∶3∶0.15环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的丹酚酸B的含量测定，照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录ⅥD试验，步骤如下：
(1)色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为比例为30:10:1:59的甲醇-乙腈-甲酸-水，等度洗脱；流速：0.8～1.2mL·min-1；检测器为UV，检测波长：280～290nm，柱温30～40℃；进样量5～20μL；理论板数按丹酚酸B计不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：取丹膝颗粒粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂50mL，塞密，称定重量，用一定方法提取适当时间，放冷，再称定重量，用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；其中所述的丹膝颗粒粉末为粗粉；所述的提取溶剂为乙醇、甲醇、20％甲醇、50％甲醇或75％甲醇中的任一种，所述的提取方法为超声提取法、回流提取法、闪式提取法或索式提取法中的任一种；所述的提取适当时间为30～90min。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(1)所述的检测波长为286nm。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(3)所述的提取适当时间为60min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的天麻素的含量测定，照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录ⅥD试验，步骤如下：
(1)色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为比例为3:97的乙腈-0.05％磷酸，等度洗脱；流速：0.8～1.2mL·min-1；检测波长：210～230nm；柱温30～40℃；进样量5～20μL，理论板数按天麻素计不低于5000；
(2)对照品溶液的制备：取天麻素对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含50μg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：取本品粉末约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂50mL，塞密，称定重量，用一定方法提取适当时间，放冷，再称定重量，用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加60％～80％乙醇2mL使溶解，加在中性氧化铝柱上，柱规格为100～200目、10g、内径为1～1.5cm，用60％～80％乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加水溶解，并转移至5mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；其中所述的丹膝颗粒粉末为粗粉；所述的提取溶剂为乙醇、甲醇、30％甲醇、50％甲醇或70％甲醇中的任一种；所述的提取方法为超声提取法、回流提取法、闪式提取法或索式提取法中的任一种；所述的提取适当时间为30～90min。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤(1)所述的检测波长为220nm。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤(3)所述的提取适当时间为60min。
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| HPLC法测定天麻定眩胶囊中天麻素的含量;李咏梅 等;《中药新药与临床药理》;20140531;第25卷(第3期);第343页左栏首段，第343-344页第2节，第345页第3节 * |
| HPLC测定丹膝颗粒中丹酚酸B的含量;李翔 等;《中国实验方剂学杂志》;20121130;第18卷(第22期);第135页左栏首段，摘要，第1节，第135-136页第2节，第136页第3节 * |
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|---|---|
| CN105628851A (zh) | 2016-06-01 |
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