KR20100070172A

KR20100070172A - 단삼근 추출물로부터 고순도의 살비아놀산 ｂ의 분리방법

Info

Publication number: KR20100070172A
Application number: KR1020080128787A
Authority: KR
Inventors: 문제학; 이형재; 이기훈; 박근형; 문영학
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2010-06-25

Abstract

본 발명은 단삼 (Salvia miltiorrhiza) 뿌리의 메탄올추출물로부터 살비아놀산 B(salvianolic acid B, lithospermic acid B)의 분리방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 단삼 뿌리의 메탄올추출물을 여과하고 농축한 후, 얻어진 농축물의 물 현탁액을 클로로포름으로 용매분획하고, 분리한 물층을 트리플루오르아세트산을 이용하여 pH 3.0으로 조정한 다음 에틸아세테이트로 용매분획하였다. 얻어진 에틸아세테이트층을 농축하여 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그라피와 역상 컬럼을 이용한 고속액체크로마토그라피(HPLC)를 거쳐 최종적으로 순도 99% 이상의 살비아놀산 B를 분리하는 방법에 관한 것이다.

단삼근, 메탄올추출물, 살비아놀산 B, 리소스퍼믹산 B

Description

단삼근 추출물로부터 고순도의 살비아놀산 Ｂ의 분리방법{Isolation Method of Salvianolic Acid B in High Purity from Extract of Salvia miltiorrhiza Root}

본 발명은 단삼근의 메탄올추출물로부터 고순도의 살비아놀산 B의 분리 및 정제방법에 관한 것이다

단삼은 꿀풀과의 다년생 약용식물로 한방에서 자주 이용되고 있으며, 특히 동맥경화, 심근경색 등의 순환기계질환 치료에 많이 이용(Zhou L 등, J. Chin. Pharmacol., 2005, 45, p 1345-1359)되고 있으며, 단삼근으로부터 여러 종의 살비아놀산 유도체들(salvianolic acid A, B, C, D, E, F, G 및 J)과 단센수(danshensu), 카페산(caffeic acid), 프로토카테쿠산(protocatechuic acid), 그리고 프로토카테쿠알데하이드(protocatechualdehyde) 등의 다양한 페놀성 화합물들(Lu PY 등, Phytochemistry, 2000, 53, p 117-140)의 존재에 더하여 다양한 비극성화합물들의 존재에 대해서도 보고(Chang HM 등, J. Org. Chem., 1990, 55, p 3537-3543)되어진 바 있다.

Kang DG 등(Phytother. Res., 2003, 17, p 917-920)은 단삼(500 g, 건조중량)의 메탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 및 부탄올로 용매분획하여 얻은 에틸아세테이트층(946 mg)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피 및 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피를 행하여 살비아놀산 B (130.6 mg)를 분리하였다고 보고하였다. 그리고 Li HB 등(J. Chromatogr. A, 2002, 943, p 235-239)은 단삼(100 g, 건조중량)을 60% 에탄올, 30% 에탄올, 물로 3차례 추출한 여액을 헥산, 클로로포름으로 용매분획한 후 물층을 10% 염산으로 pH를 2로 조정하여 에틸아세테이트로 용매분획하였다. 얻어진 에틸아세테이트층 (5.425 g) 중에 500 mg을 대상으로 고속 counter-current 크로마토그라피를 통해서 순도 98%인 살비아놀산 B를 342 mg 얻었다고 보고하였다. 또한 Junhui C 등(Talanta, 2006, 69, p 172-179)은 단삼(100 g)을 물로 추출하고 농축한 후, D101 macroporous resin을 사용하여 정제하고 얻어진 에탄올:물 (1:1, v/v) 획분의 80 mg을 고속 counter-current 크로마토그라피를 통해서 98% 순도의 살비아놀산 B 63.4 mg을 분리하였다고 보고하였다. Xiao W 등(J. Sep. Sci., 2007, 30, p 3217-3217)은 단삼(500 g, 건조중량)을 80% 에탄올로 세 번 추출하고, 얻어진 여액을 농축하여 헥산으로 용매분획한 후, 물층을 10% 염산으로 pH를 2로 조정하여 에테르로 용매분획하였다. 얻어진 에테르층(14.5 g)의 2 g을 대상으로 pH zone-refined counter-current 크로마토그라피를 행하여 순도 94.1%인 살비아놀산 B를 572 mg 얻었다고 보고하였다. 한국 등록특허 10-0857687에서는 단삼 1 kg을 80% 메탄올로 추출하고, 물로 현탁하여 10% 염산(HCl)으로 pH 3.5로 맞추어 헥산, 에틸아세테이트로 용매분획하였다. 얻어진 물층을 pH 4.5로 조정하고 부탄 올(BuOH)로 분획한 부탄올층을 농축하여 살비아놀산 B를 18 g 얻었으며, 또한 얻어진 에틸아세테이트층에 물을 첨가하고 10% 염산(HCl)으로 pH 4.5로 조정한 후, 다시 에틸아세테이트로 분획하여 얻은 에틸아세테이트층을 농축하여 2 g의 살비아놀산 B를 얻었다고 보고되어진 바 있다.

그러나 단삼 뿌리 추출물로부터 살비아놀산 B를 단리ㆍ정제함에 있어 높은 수율의 획분을 확보할 수 있는 산처리 용매분획법과 단순한 조작의 컬럼크로마토그라피를 병용하여 고순도의 살비아놀산 B를 단리ㆍ정제한 보고는 없다.

본 발명은 단삼근(Salvia miltiorrhiza root)의 메탄올추출물로부터 고순도의 살비아놀산 B(하기의 구조식 1 참조)를 간단한 방법으로 분리하고자 하였다.

구조식 1

본 발명에서는 단삼으로부터 고순도의 살비아놀산 B를 간단한 조작에 의해 단리ㆍ정제하는 방법을 고안하였다.

단삼은 순환기계질환 치료에 이용되고 있는 한약재 중의 하나이며, 살비아놀산 B는 단삼에 대표적으로 다량 함유되어 있는 성분 중의 하나이다. 그래서 살비아놀산 B는 순환기계질환을 포함한 다양한 분야에 있어 관심의 대상 화합물이 되고 있다. 이에 본 발명은 간단한 조작에 의해 고순도의 살비아놀산 B를 높은 수율로 확보함으로써 살비아놀산 B의 활용성을 높이고, 살비아놀산 B를 이용한 연구의 활성화에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명은 단삼근을 메탄올로 추출하고 여과한 후, 얻어진 농축액을 물로 용해하여 클로로포름으로 용매분획하였다. 얻어진 물 층을 트리플루오르아세트산을 이용하여 pH 3.0으로 조정하여 에틸아세테이트로 용매분획하고, 얻어진 에틸아세테이트층을 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그라피와 분취용 HPLC를 행하여 최종적으로 고순도의 살비아놀산 B를 단리하였으며, 살비아놀산 B의 구조는 NMR 분석을 통해 동정하였다.

이하, 하기 실시 예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

(실시예 1) 살비아놀산 B의 분리

단삼 (Salvia miltiorrhiza) 뿌리는 전남 생약농업협동조합에서 구입한 것으로 절단 상태의 것을 분쇄기(후드믹서)로 분말화하여 시료로 사용하였다. 이 분말 시료(100 g)에 메탄올 500 mL를 가하고, 실온에서 24 시간 방치한 후 여과(No. 2, Whatman)하고, 잔사를 메탄올 500 mL로 재여과(No. 2, Whatman)하였다. 얻어진 1차 및 2차 여과액을 합하여 40℃에서 감압 농축하였다.

농축물(13.158 g)을 물(200 mL)로 용해한 현탁액을 클로로포름 200 mL로 3회 반복하여 용매분획함으로써 지용성 성분을 제거하였다. 얻어진 물층을 트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)을 사용하여 pH 3.0으로 조정한 후, 에틸아 세테이트 400 mL로 3회 반복하여 용매분획하였다. 용매분획 전의 추출물, 용매분획 후의 클로로포름층, 에틸아세데이트층 및 물층에 함유된 살비아놀산 B의 함량을 HPLC로 분석한 결과, 표 1과 같은 결과가 얻어졌다. 즉, 용매분획 전 메탄올 추출물 중의 살비아놀산 B의 함량을 100%로 하였을 때, 클로로포름층과 물층에 이행되는 살비아놀산 B는 각각 약 1.3%와 1.6% 정도였다. 그리고 살비아놀산 B는 산성조건에서 에틸아세테이트 추출에 의해 거의 전량(약 97%) 회수되어짐을 알 수 있었다.

표 1. 단삼 (100 g, 건조중량) MeOH 추출물과 그 추출물의 용매분획 후 각 획분에 함유된 살비아놀산 B의 함량

	용매분획전 MeOH 추출물	용매분획 후
	용매분획전 MeOH 추출물	클로로포름층	에틸아세테이트층	물층
살비아놀산 B (g)	1.446±0.208	0.019±0.000	1.487±0.006	0.023±0.001
수율 (%)	100±14.39	1.31±0.00	102.38±0.38	1.59±0.07

이어 살비아놀산 B의 순도(71%)를 보다 높이기 위해, 얻어진 에틸아세테이트층(2.092 g)을 감암 농축한 후, 물/메탄올 20:80 (v/v)을 용출용매로 한 세파덱스 LH-20 (2.0 i.d × 130 cm, 70∼230 mesh, Pharmacia, Sweden) 컬럼크로마토그라피에 의해 정제하였다. 컬럼크로마토그라피에 의해 얻어진 각 획분들을 대상으로 살비아놀산 B의 용출 위치를 확인하기 위해 박층크로마토그라피(Thin Layer Chromatography, TLC)와 고속액체크로마토그라피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 행하여 표준품의 살비아놀산 B와 비교한 결과, Ve/Vt (elution volumne/total volume) 1.75∼2.71의 용출용액(1.820 g, 살비아놀산 B의 순도 88%)이 살비아놀산 B의 주요 용출위치임이 확인되었다. 이어 이 살비아놀산 B의 주요 용출획분으로부터 고순도의 살비아놀산 B를 단리하기 위해 옥타데실실란 컬럼(20 i.d × 250 mm, 5 μm, Shim-pack PREP-ODS(H)KIT, Shimadzu, Japan)이 연결된 시스템에서, 물/아세토나이트릴 90:10 (v/v, TFA로 pH 2.65, A)과 60:40 (v/v, B)을 이용하여 A용액을 출발 용출용매로 하여 15분 후 B가 50%가 되도록 하고, 15분 동안 유지시킨 후, 이어 B가 100%가 되도록하여 15분 동안 유지시키는 용출계를 이용하였다. 그리고 280 nm (SPD-M20A, Shimadzu, Japan)의 파장과 유속 9.9 mL/min (LC-6AD, Shimadzu, Japan)의 조건으로 degaser(DGU-20A3, Shimadzu, Japan)가 장착되고, Shimadzu LC Solution의 프로그램이 설치된 분취용 고속액체크로마토그라피를 행하였다. 이 용출계에 있어 33 분에 용출된 피크(도 2)를 분취하여 노란색 분말형태의 화합물(1.076 g)을 얻었다. 얻어진 화합물의 순도를 확인하기 위하여 ODS-80Ts 컬럼(4.6 i.d × 150 mm, Tosoh, Japan)이 장착되고, 아세토나이트릴/물 10:90 (v/v, TFA로 pH 2.65 조정)을 출발용매로 하여 70분 후에 아세토나이트릴/물 40:60 (v/v)의 용매가 100%가 되도록 한 후 15분 동안 유지시키는 용매계를 사용하였다. 그리고 1.0 mL/min의 유속과 280 nm의 파장에서 고속액체크로마토그라피를 행하여, 얻어진 화합물의 순도가 99% 이상임을 확인할 수 있었다(도 3). 분리한 순도 99% 이상의 살비아놀산 B (1.076 g)는 단삼 뿌리 100 g에 함유된 살비아놀산 B (1.446 g)의 74.41%에 해당하는 양이었다.

실시예 1의 방법은 추출과정이 간단하고 높은 순도와 수율로 살비아놀산 B를 얻을 수 있는 분리법이다.

(실시예 2) 기기분석에 의한 살비아놀산 B의 구조동정

¹H-NMR 분석을 행한 결과, 단리화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼이 표준품의 살비아놀산 B의 그것과 일치하였고, 문헌(Watzke A 등, Journal of natural products, 2006, 69, p 1231-1233)의 결과와도 일치하였다. 이 결과로부터 단리화합물을 살비아놀산 B로 동정하였다.

도 1은 단삼근으로부터 고순도의 살비아놀산 B의 분리방법에 대한 흐름도이다.

도 2는 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그라피 후에 얻어진 살비아놀산 B 함유 획분을 대상으로 분취용 고속액체크로마토그라피를 행하여 살비아놀산 B를 분취한 크로마토그람이다.

도 3은 고속액체크로마토그라피를 행하여 단리된 살비아놀산 B의 순도측정을 행한 크로마토그람이다.

도 4는 단삼근의 메탄올추출물로부터 단리하여 동정된 살비아놀산 B의 구조이다.

Claims

단삼근(Salvia miltiorrhiza root) 추출물로부터 살비아놀산 B의 분리방법으로서

(a) 단삼근 추출물의 조추출물을 물로 현탁하고 클로로포름을 사용하여 용출시켜 클로로포름층과 물층으로 분리하는 지용성 성분의 제거 단계

(b) 상기 물층을 트리플루오르아세트산으로 pH를 산성으로 조정하는 단계

(c) pH가 산성으로 조정된 물층을 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트와 물층으로 분리하는 단계

(d) 상기의 에틸아세테이트층의 농축물을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피를 행하여 살비아놀산 B 함유 획분을 얻는 단계

(e) 살비아놀산 B 함유 획분을 분취용 고속액체크로마토그라피(ODS 컬럼)를 이용하여 고순도의 살비아놀산 B를 정제하는 방법