CN105218495A - 一种丹参水溶性成分新化合物、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丹参水溶性成分新化合物，其化学名称为2(R),3(S)-4-[(1E)-3-[1-羧基-2-(3,4-二羟基苯基)乙氧基]-3-氧-1-丙烯-1-基]-2-(3,4-二羟基苯基)-2,3-二氢-7-羟基-，3-[1-羧基-2-(3,4-二羟基苯基)乙氧基]酯，体外抗过氧化氢诱导PC12细胞损伤的活性实验发现，该化合物的保护率高达58.8％，具有很好的神经保护作用，有望应用于神经系统疾病的治疗，本发明还提供了该化合物的制备方法。

Description

一种丹参水溶性成分新化合物、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种新的药物化合物，特别涉及一种自丹参中提取得到的水溶性新化合物、其制备方法及应用。

背景技术

丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，又名赤参、紫丹参等，产于我国安徽河南陕西等地。丹参味苦，性微寒，归心、肝二经，具有活血化瘀、痛经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效，常用于治疗冠心病、心绞痛、脑梗塞、降血脂、多种眼科疾病、漫性肝病、疗急、慢性肾炎、经血涩少、产后瘀血腹痛、闭经腹痛等。

丹参中酚酸类成分是丹参的主要活性成分之一，目前已分离获得了20多种单体化合物，包括丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、M'、N、P、R、S、Z等，并且很多表现出多种药理活性。

其中研究最多的是丹酚酸B。丹酚酸B对心、脑、肝等器官均具有重要药理作用。文献报道丹酚酸B具有很强的抗氧化活性，明显于强维生素C、维生素E和甘露醇，是已知抗氧化活性最强的天然产物之一；动物实验研究显示丹酚酸B能减轻缺血再灌注损伤模型动物的心肌缺血程度，减小心肌梗死范围，减少LDH、CPK从胞体的溢出、降低缺血心肌组织中MDA的含量，提高SOD的活力，对抗氧自由基对心肌细胞的毒害作用，保护心肌细胞。

其次研究较多的是丹酚酸A。文献报道，丹酚酸A能有效抑制CCl₄引起的受损大鼠肝细胞中MDA的增加和GSH的减少，并能不同程度地降低超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。结果表明，抑制脂质体过氧化可能是丹酚酸A保护肝功能的主要机制；丹酚酸A还能通过抑制H₂O₂诱导的MAPK(细胞分裂素活化蛋白激酶)活性从而激活Akt/mTORC1肽信号，进而保护视网膜上皮细胞免受氧化行应激作用。

本发明人通过丹参水提取物进行分离纯化，发现了一个新的化合物，并运用现代色谱、光谱技术，结合文献报道，确定了该化合物的绝对立体构型。

现代研究表明多种神经系统疾病的发生和发展中都伴随着氧化损伤，如卒中(Stroke)、阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease,PD)等，因此抗神经细胞氧化损伤的药物在此类疾病中具有广阔的发展前景。

本发明得到的新化合物具有很好的神经保护作用，效果明显优于丹酚酸B，是一种很有潜力的治疗神经系统疾病的药物。

发明内容

本发明是从丹参SalviamiltiorrhizaBge.中提取分离得到1个新的酚酸类化合物，命名为丹酚酸Y，其化学名称为2(R),3(S)-4-[(1E)-3-[1-羧基-2-(3,4-二羟基苯基)乙氧基]-3-氧-1-丙烯-1-基]-2-(3,4-二羟基苯基)-2,3-二氢-7-羟基-，3-[1-羧基-2-(3,4-二羟基苯基)乙氧基]酯。

其立体化学结构为：

该化合物的结构解析过程为：

1、该化合物为白色无定型粉末；比旋光度为[α]_D ¹⁰＝-42°(c＝0.87,MeOH)；

2、HR-ESI-MSm/z717.1338[M-H]-，其分子量为718，分子式为C₃₆H₃₀O₁₆；

3、紫外、红外

在该化合物的紫外图谱中，207nm、255nm、289nm和307nm处表现出吸收峰，与文献报道的丹酚酸B的紫外吸收基本一致。

在红外图谱中，3357cm^-1处的吸收峰表明有-OH的存在；1721cm^-1处的吸收峰表明有羰基的存在；1611cm^-1、1527cm^-1和1448cm^-1处的吸收峰表明有苯环的存在。

4、核磁

经NMR测试，在¹H-NMR谱中存在三个ABX耦合系统，分别为I:δ6.71(1H,d,1.9,H-2'''),δ6.64(1H,d,8.0,H-5''')和δ6.57(1H,dd,8.0,1.9,H-6''')；II:δ6.48(1H,d,1.9,H-2''),δ6.56(1H,d,8.0,H-5'')和δ6.33(1H,dd,8.1,1.9,H-6'')；Ⅲ:δ6.90(1H,s,H-2')andδ6.68(2H,ov,H-5'/H-6')]；两个AB耦合系统，分别为I:δ7.11(1H,d,8.5,H-5)和δ6.77(1H,d,8.4,H-6)；II:δ5.90(1H,d,9.2,H-2)和δ4.77(1H,d,8.0,H-3)]；两个AX₂耦合系统，分别为I:δ4.35(1H,t,6.3,H-8''),2.54(1H,dd,14.0,6.1,H-7''α),2.45(1H,dd,14.0,6.6,H-7''β)；II:δ5.11(1H,t,6.7,H-8'''),3.02(1H,dd,14.3,4.8,H-7'''α),2.98(1H,dd,14.2,6.9,H-7'''β)。

在¹³C-NMR谱中表现出26个碳信号，再根据DEPT谱可知，包括2个亚甲基碳、17个次甲基碳和17个季碳。进一步研究发现这26个碳信号分别为，4个羰基碳信号：δ171.0(COOH-9''),δ170.0(COO-10''),δ171.2(COOH-9''')和δ166.7(COO-10''')；13个芳香季碳信号；δ123.2(C-4),145.4(C-7),148.2(C-8),126.8(C-9),127.8(C-1'),144.4(C-3'),143.9(C-4'),126.9(C-1''),143.8(C-3''),143.7(C-4''),127.7(C-1'''),144.8(C-3''')和144.6(C-4''')；17个次甲基碳信号；δ87.0(C-2),53.2(C-3),121.3(C-5),116.9(C-6),113.4(C-2'),114.7(C-5'),118.4(C-6'),116.4(C-2''),114.9(C-5''),120.7(C-6''),74.4(C-8''),116.4(C-2'''),114.9(C-5'''),120.8(C-6'''),73.3(C-8'''),115.5(C-11''')和142.4(C-12''')；两个亚甲基碳信号：δ36.1(C-7'')和36.4(C-7''')。

在2D-NMR的HMBC谱中，δ5.90(H-2)跟127.8(C-1')/113.4(C-2')/118.4(C-6')/53.2(C-3)/170.0(C-10'')有相关信号；δ4.77(H-3)跟87.0(C-2)/170.0(C-10'')/148.2(C-8)/126.8(C-9)/123.2(C-4)有相关信号；δ4.35(H-8'')跟171.0(C-9'')/170.0(C-10'')/36.1(C-7'')/126.9(C-1'')有相关信号；δ2.54(H-7''α),2.45(H-7''β)跟74.4(C-8'')/171.0(C-9'')/120.7(C-6'')/116.4(C-2'')/126.9(C-1'')有相关信号；δ6.48(H-2'')跟36.1(C-7'')/120.7(C-6'')/143.8(C-3'')/143.7(C-4'')有相关信号；δ7.53(H-12''')跟123.2(C-4)/121.3(C-5)/126.8(C-9)/115.5(C-11''')/166.7(C-10''')有相关信号；δ6.25(H-11''')跟123.2(C-4)/166.7(C-10''')有相关信号；δ5.11(H-8''')跟166.7(C-10''')/171.2(C-9''')/36.4(C-7''')/127.7(C-1''')有相关信号；δ3.02(H-7'''α),2.98(H-7'''β)跟73.3(C-8''')/171.0(C-9''')/127.7(C-1''')/116.4(C-2''')/120.8(C-6''')有相关信号；δ6.77(H-6)跟123.2(C-4)/148.2(C-8)有相关信号。

在¹H-¹HCOSY和HMQC谱中给出如下相关单元：CH(H-2)-CH(H-3),CH(H-5)＝CH(H-6),CH(H-11''')＝CH(H-12'''),CH(H-5'')＝CH(H-6''),CH(H-8'')-CH₂(H-7''),CH(H-8''')-CH₂(H-7''')和CH(H-5''')＝CH(H-6''')。

综合1D/2D-NMR图谱，可以解析出该化合物的平面结构。

¹H-¹HCOSY和HMBC相关关系式：

本发明所述化合物丹酚酸Y与丹酚酸B的平面结构相同；通过仔细对比本发明所述化合物与丹酚酸B的¹H-NMR和¹³C-NMR数据，发现两者的大部分NMR数据基本吻合，存在较大差异的地方为：在¹³C-NMR中，该化合物的C-3位碳的化学位移明显比丹酚酸B的C-3位向高场位移了3.4ppm；在¹H-NMR中，该化合物的H-2和H-3位的耦合常数为9.2Hz，而丹酚酸B中的H-2和H-3位的耦合常数只为4.8Hz。以上两个方面的差异同一指向C-2和C-3位，说明该化合物为丹酚酸B的差向异构体且在C-2位或(和)C-3位发生了手性反转；并且耦合常数的大小表明在该化合物中H-2和H-3处于顺式，而在丹酚酸B中H-2和H-3处于反式。

立体构型不同即为不同的化合物，且立体构型与其药理毒理活性直接密切相关，所以确定立体绝对构型是必须的。

丹酚酸Y的绝对立体构型通过圆二色谱(CD)法确定。该化合物结构中实际存在4个手性中心。其中8''和8'''位因直接来源于天然(R)-丹参素，故通常直接默认为(8''R,8'''R)。用量子化学的计算方法TD-SCF法对(2R/3S/8''R/8'''R)构型进行计算，然后将计算出ECD图谱与实测CD谱图进行比较，发现两者具有较好的一致性，故确认该化合物的绝对构型为2R/3S/8''R/8'''R。

表1.该化合物的¹H和¹³C核磁共振数据(Methanol-d₆,400MHz/100MHz)

本发明的新化合物丹酚酸Y是按照如下方法进行制备的：

取丹参药材，加水煎煮2-4次，合并煎液，用盐酸调pH值至1-3后，静置，过滤去除沉淀，滤液通过聚酰胺柱，用6-8倍柱体积水洗脱，弃去水液，再用6-8倍柱体积碳酸氢钠溶液洗脱，收集洗脱液，再用盐酸调pH值至2-4，过大孔吸附树脂柱，用2-4倍柱体积水冲洗，弃去水液，再用80％-95％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，然后用适量水溶解，过制备型高效液相，得该化合物纯品。

具体的，该化合物的制备方法为：

取丹参药材，加水煎煮提取3次，每次加3～6倍量水、煎煮0.5～2小时，合并煎液；冷却至8～14℃，用盐酸溶液调pH值至1.0～2.0，静置4～8小时，取上清液，滤过；滤液过聚酰胺柱，用7倍柱体积的纯化水冲洗，弃去流出液；再用7倍柱体积的0.1％碳酸氢钠溶液洗脱，收集碳酸氢钠洗脱液，用盐酸溶液调pH值至2.5～3.5；过AB-8型大孔吸附树脂柱，用2～3倍柱体积的纯化水冲洗，弃去水洗液；再用约2.5倍柱体积95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，调节至相对密度1.02～1.06(30℃)，2～10℃冷藏12～24小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠溶液调pH值至5.0～6.5，冷冻干燥，得提取物；将提取物用适量水溶解，通过两次半制备型RP-HPLC纯化，即得纯品。

其中，所述过聚酰胺柱，药材重量：聚酰胺重量为4：1，径高比为1：4～6，聚酰胺柱体积以1kg聚酰胺6.6L计算；纯化水冲洗流速为每小时1倍柱体积；碳酸氢钠溶液洗脱流速为每小时1倍柱体积。

所述过大孔吸附树脂柱，药材重量：大孔树脂重量为1：1，径高比约为1：5～7；纯化水冲洗流速为每小时2倍柱体积；95％乙醇洗脱流速为每小时1～2倍柱体积。

所述两次半制备型RP-HPLC纯化，色谱条件为：

一次制备条件：

色谱柱：VenusilXBPC₁₈(2)(50×250mm，10μm)

流动相A:0.05％TFA，流动相B:乙腈

梯度：

波长：UV280nm；

流速：80mL/min；

进样量：1g

收集28-30min馏分，45℃水浴减压旋蒸浓缩至体积约5ml，进行二次制备。

二次制备条件：

色谱柱：VenusilXBPC₁₈(2)(50×250mm，10μm)

流动相A:0.05％TFA，流动相B:乙腈

梯度：

波长：UV280nm；

流速：80mL/min；

进样量：5ml

收集27.5-30min馏分。

本发明新化合物丹酚酸Y的药效活性，通过以下实验进行检测：

1材料与方法

1.1药品与试剂

丹酚酸Y和丹酚酸B以DMSO配制成浓度为10mmol/ml母液，临用时以DMEM稀释至10μmol/L(DMSO＝0.1％)，此后用含0.1％DMSO的DMEM稀释至所需浓度。

高糖DMEM培养基(Gibco公司)；

胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；

胰蛋白酶(美国Amersco公司进口分装)

MTT(美国Amersco公司进口分装)；

1.2细胞株

PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬肿瘤细胞)，中国科学院上海生化细胞所提供。

1.3仪器

细胞培养箱德国Heraeus公司

超净工作台苏净集团安泰公司

倒置显微镜(XSZ-D2)重庆光学仪器厂

高压蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司

电子分析天平上海Mettler-ToledoInstr.

Milli-Q超纯水仪美国Millipore公司

磁力搅拌器金坛市医疗仪器厂

恒温水浴锅常州国华电器有限公司

酶标仪(BioTek)美国Epoch公司

1.4实验方法

1.4.1PC12细胞的培养

使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养PC12细胞，细胞传代时用0.25％的胰酶消化约50s，用含10％血清的DMEM培养基终止消化，加入新鲜的培养基将细胞吹打均匀。以10⁵个/ml的细胞密度传代。每瓶细胞加入4ml含细胞的培养液。在37℃，5％CO₂条件下培养。

1.4.2细胞接种

为保证细胞生长的湿度一致，将96孔板最外缘的36孔分别加入100μl的PBS溶液。PC12细胞在培养瓶中生长至融合状态，采用0.25％胰蛋白酶溶液消化，并反复吹打至细胞悬液，以含10％FBS的高糖DMEM培养基稀释成1.0×10⁵个/mL，每孔100μl接种于96孔培养板中每组10个复孔，在37℃，5％CO₂条件下培养24h，成融合状态。

1.4.3药物孵育

用无血清的高糖DMED培养基分别将药物稀释成10μM、1μmol/L、和0.1μmol/L。于实验前换无血清高糖DMEM培养基同步化培养1h。同步化后，分别向各给药组加入终浓度10、1、0.1μmol/L的药液100μl，其他组加入100μl无血清高糖DMEM，孵育6h。

1.4.4模型制备

向模型组和给药组每孔加入11μl的4000μmol/L的H₂O₂使其终浓度为400μmol/L，作用1h。

1.4.5细胞活力检测

50mgMTT溶解于10mLPBS，0.22μm微孔滤膜过滤。临用前稀释到0.5mg/mL。各组细胞弃去培养基，PBS洗两次，每加入0.5mg/mLMTT，37℃，5％CO₂条件下孵育3h，除去MTT工作液，每孔加入150μLDMSO溶解结晶，振摇10min，测定每孔的OD值(测定波长570nm，参比波长650nm)。以对照组OD值平均值为100％细胞活力，计算模型组和给药组的细胞活力。药物保护率＝(给药组细胞活力-模型组细胞活力)/(对照组细胞活力-模型组细胞活力)*100。

2实验结果：

10μM的丹酚酸Y对H₂O₂诱导的PC12氧化损伤具有非常显著的改善作用，保护率58.3％，但1μM和0.1μM浓度时保护作用不明显，提示丹酚酸Y较高浓度具有较强保护神经细胞氧化损伤的能力。

表2-1、丹酚酸B对过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤的影响

注： ^##P<0.01与阴性对照组比较；^**P<0.01，^*P<0.05，与模型组比较

表2-2、丹酚酸Y对过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤的影响

注： ^##P<0.01与阴性对照组比较；^**P<0.01，^*P<0.05，与模型组比较

H₂O₂是氧化应激反应密切相关的活性氧之一，其主要产物OH·具有很强的氧化性并可自由进入细胞，破坏细胞内活性氧和抗氧化代谢的平衡，使抗氧化酶如超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)等活性下降，同时会损伤体内脂质、蛋白质和DNA等生物大分子，使丙二醛((Malondialdehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)释放增加，造成细胞内代谢紊乱、DNA损伤和细胞凋亡等。

实验显示丹酚酸Y对400μMH₂O₂作用1h的PC12细胞具有明显的保护作用，相同浓度10μM下，保护率最高可达58.3％，明显高于丹酚酸B的保护率32.7％。

本发明还提供含有本发明化合物的药物组合物。

本发明的药物组合物中的药物活性物质为本发明的化合物，其在制剂中所占重量百分比可以是0.01-99.99％，其余为药物可接受的载体。

本发明的药物组合物，在使用时可以根据需要制备成药物制剂形式，如口服制剂形式，注射剂形式，阴道或肛门栓剂形式等。

本发明的药物组合物在制备成药物制剂时，根据需要可以加入药学上可接受的载体。

本发明的药物组合物，以单位剂量的制剂形式存在，所述单位剂量是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支等。

本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂、贴剂。

本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的药物制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，如可每日服用1-3次。每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片，每剂1mg-1000mg。

本发明提供的药物在用于疾病的治疗时，用于成人治疗的剂量通常将在0.02-5000mg/天的范围，优选1-1500mg每天。所需剂量可以是单一的剂量或多次的计量，按适当的间隔给药，例如每天两次、三次、四次或更多。

本发明的有益效果：

本发明通过对丹酚酸的深入研究，意外的发现一种新结构化合物，该化合物的体外抗过氧化氢诱导PC12细胞损伤的活性实验发明，丹酚酸Y的保护率高达58.3％，远远高于丹酚酸B，具有很好的神经保护作用，有望应用于神经系统疾病的治疗。

附图说明

图1：丹酚酸Y质谱图

图2：计算ECD与实测CD谱图的比较

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1丹酚酸Y的制备

取丹参，加水提取3次，第1次加5.5倍量水，煎煮1小时；药渣再加3倍量水，煎煮2次，每次0.5小时，合并提取液，冷却至8～14℃，用盐酸溶液调pH值至1.0～2.0，静置4小时，取上清液，滤过。滤液过聚酰胺柱(药材重量：聚酰胺重量约为4：1，径高比为1：4～6，聚酰胺柱体积以1kg聚酰胺6.6L计算)，用约7倍柱体积的纯化水冲洗，流速约为每小时1倍柱体积，弃去流出液；再用约7倍柱体积的0.1％碳酸氢钠溶液洗脱，流速约为每小时1倍柱体积。收集碳酸氢钠洗脱液，用盐酸溶液调pH值至2.5～3.5，过AB-8型大孔吸附树脂柱(药材重量：大孔树脂重量约为1：1，径高比约为1：5～7)，用2～3倍柱体积的纯化水冲洗，流速为每小时约2倍柱体积，弃去水洗液；再用约2.5倍柱体积95％乙醇洗脱，流速为每小时1～2倍柱体积。收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，调节至相对密度1.02～1.06(30℃)，2～10℃冷藏12～24小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠溶液调pH值至5.0～6.5，冷冻干燥，得提取物。将提取物用适量水溶解，通过两次半制备型RP-HPLC纯化，得丹酚酸Y纯品。

一次制备条件：

色谱柱：VenusilXBPC₁₈(2)(50×250mm，10μm)

流动相A:0.05％TFA，流动相B:乙腈

梯度：

波长：UV280nm；

流速：80mL/min；

进样量：1g

收集28-30min馏分，45℃水浴减压旋蒸浓缩至体积约5ml，进行二次制备。

二次制备条件：

色谱柱：VenusilXBPC₁₈(2)(50×250mm，10μm)

流动相A:0.05％TFA，流动相B:乙腈

梯度：

波长：UV280nm；

流速：80mL/min；

进样量：5ml

收集27.5-30min馏分。

实施例2

丹酚酸Y的制备

取丹参药材，加水煎煮3次，第1次加5倍量水煮1小时，第2、3次各加4倍量水、煮0.5小时，合并煎液；冷却至8～14℃，用盐酸调pH值至1.0～2.0后，静置5小时，过滤去除沉淀，滤液通过聚酰胺柱(药材重量：聚酰胺重量约为4：1，径高比为1：4～6，聚酰胺柱体积以1kg聚酰胺6.6L计算)，用7倍柱体积水洗脱，流速约为每小时1倍柱体积，弃去水液，再用7倍柱体积0.1％碳酸氢钠溶液洗脱，流速约为每小时1倍柱体积，收集洗脱液，再用盐酸调pH值至2.5～3.5，过AB-8型大孔吸附树脂柱(药材重量：大孔树脂重量约为1：1，径高比约为1：5～7)，用3倍柱体积纯化水冲洗，流速为每小时约2倍柱体积，弃去水液，再用2.5倍柱体积95％乙醇洗脱，流速为每小时1～2倍柱体积。收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，调节至相对密度1.02～1.06(30℃)，2～10℃冷藏12～24小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠溶液调pH值至5.0～6.5，冷冻干燥，得提取物；将提取物用适量水溶解，通过两次半制备型RP-HPLC纯化，即得纯品。

两次半制备型RP-HPLC纯化色谱条件同实施例1。

实施例3丹酚酸Y的制备

取丹参药材，加水煎煮提取2次，第1次加6倍量水煮2小时，第2次加4倍量水煮0.5小时，合并煎液；冷却至8～14℃，用盐酸溶液调pH值至2.0～3.0，静置8小时，取上清液，滤过；滤液过聚酰胺柱(药材重量：聚酰胺重量约为4：1，径高比为1：4～6，聚酰胺柱体积以1kg聚酰胺6.6L计算)，用6倍柱体积的纯化水冲洗，流速约为每小时1倍柱体积，弃去流出液；再用8倍柱体积的0.1％碳酸氢钠溶液洗脱，流速约为每小时1倍柱体积，收集碳酸氢钠洗脱液，用盐酸溶液调pH值至3～4；过AB-8型大孔吸附树脂柱(药材重量：大孔树脂重量约为1：1，径高比约为1：5～7)，用4倍柱体积的纯化水冲洗，流速为每小时约2倍柱体积，弃去水洗液；再用约2.5倍柱体积80％乙醇洗脱，流速为每小时1～2倍柱体积。收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，调节至相对密度1.02～1.06(30℃)，2～10℃冷藏12～24小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠溶液调pH值至5.0～6.5，冷冻干燥，得提取物；将提取物用适量水溶解，通过两次半制备型RP-HPLC纯化，即得纯品。

两次半制备型RP-HPLC纯化色谱条件同实施例1。

实施例4丹酚酸Y的制备

取丹参药材，加水煎煮提取4次，第1次加3倍量水煮1小时，第2、3、4次各加4倍量水、煮0.5小时，合并煎液；冷却至8～14℃，用盐酸溶液调pH值至1.0～2.0，静置4小时，取上清液，滤过；滤液过聚酰胺柱(药材重量：聚酰胺重量约为4：1，径高比为1：4～6，聚酰胺柱体积以1kg聚酰胺6.6L计算)，用8倍柱体积的纯化水冲洗，流速约为每小时1倍柱体积，弃去流出液；再用6倍柱体积的0.1％碳酸氢钠溶液洗脱，流速约为每小时1倍柱体积，收集碳酸氢钠洗脱液，用盐酸溶液调pH值至2～2.5；过AB-8型大孔吸附树脂柱(药材重量：大孔树脂重量约为1：1，径高比约为1：5～7)，用2～3倍柱体积的纯化水冲洗，流速为每小时约2倍柱体积，弃去水洗液；再用约2.5倍柱体积90％乙醇洗脱，流速为每小时1～2倍柱体积。收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，调节至相对密度1.02～1.06(30℃)，2～10℃冷藏12～24小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠溶液调pH值至5.0～6.5，冷冻干燥，得提取物；将提取物用适量水溶解，通过两次半制备型RP-HPLC纯化，即得纯品。

两次半制备型RP-HPLC纯化色谱条件同实施例1。

实施例5含有丹酚酸Y的胶囊剂药物组合物的制备

制备方法

丹酚酸Y、乳糖、微晶纤维素、玉米淀粉、羧甲基淀粉钠加入高效湿法制粒机中混合，加入2％聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液(80％)制粒。湿颗粒在流化床中干燥，经18目筛整粒。干颗粒中加入硬脂酸镁适当混合后装入胶囊。

实施例6颗粒剂药物组合物的制备

制备方法

丹酚酸Y、乳糖、微晶纤维素、蔗糖、羧甲基淀粉钠加入高效湿法制粒机中混合，加入2％聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液(80％)制粒。湿颗粒在流化床中干燥，经18目筛整粒。干颗粒中加入硬脂酸镁适当混合后包装。

实施例7片剂的制备

制备方法

丹酚酸Y、乳糖、微晶纤维素、玉米淀粉、羧甲基淀粉钠加入高效湿法制粒机中混合，加入2％聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液(80％)制粒。湿颗粒在流化床中干燥，经18目筛整粒。干颗粒中加入硬脂酸镁适当混合后压片。

Claims (10)

1.一种化合物，其化学名称为2(R),3(S)-4-[(1E)-3-[1-羧基-2-(3,4-二羟基苯基)乙氧基]-3-氧-1-丙烯-1-基]-2-(3,4-二羟基苯基)-2,3-二氢-7-羟基-，3-[1-羧基-2-(3,4-二羟基苯基)乙氧基]酯。

2.根据权利要求1所述的化合物，其制备方法为：取丹参药材，加水煎煮2-4次，合并煎液，用盐酸调pH值至1-3后，静置，过滤去除沉淀，滤液通过聚酰胺柱，用6-8倍柱体积水洗脱，弃去水液，再用6-8倍柱体积碳酸氢钠溶液洗脱，收集洗脱液，再用盐酸调pH值至2-4，过大孔吸附树脂柱，用2-4倍柱体积水冲洗，弃去水液，再用80％-95％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，然后用适量水溶解，过制备型高效液相，得该化合物纯品。

3.根据权利要求2所述的化合物，其制备方法为：取丹参药材，加水煎煮提取3次，每次加3～6倍量水、煎煮0.5～2小时，合并煎液；冷却至8～14℃，用盐酸溶液调pH值至1.0～2.0，静置4～8小时，取上清液，滤过；滤液过聚酰胺柱，用7倍柱体积的纯化水冲洗，弃去流出液；再用7倍柱体积的0.1％碳酸氢钠溶液洗脱，收集碳酸氢钠洗脱液，用盐酸溶液调pH值至2.5～3.5；过AB-8型大孔吸附树脂柱，用2～3倍柱体积的纯化水冲洗，弃去水洗液；再用约2.5倍柱体积95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，调节至在30℃条件下相对密度1.02～1.06，2～10℃冷藏12～24小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠溶液调pH值至5.0～6.5，冷冻干燥，得提取物；将提取物用适量水溶解，通过两次半制备型RP-HPLC纯化，即得纯品。

4.根据权利要求3所述的化合物，其制备方法中，所述的两次半制备型RP-HPLC纯化，色谱条件如下：

一次制备条件：

色谱柱：VenusilXBPC₁₈(2)(50×250mm，10μm)

流动相A:0.05％TFA，流动相B:乙腈

梯度：

波长：UV280nm；

流速：80mL/min；

进样量：1g

收集28-30min馏分，45℃水浴减压旋蒸浓缩至体积约5ml，进行二次制备；

二次制备条件：

色谱柱：VenusilXBPC₁₈(2)(50×250mm，10μm)

流动相A:0.05％TFA，流动相B:乙腈

梯度：

波长：UV280nm；

流速：80mL/min；

进样量：5ml

收集27.5-30min馏分。

5.含有权利要求1化合物的药物组合物。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，是任何一种可服用的药物制剂形式。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，所述药物制剂形式选自：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂、贴剂。

8.根据权利要求5所述的药物组合物，其中权利要求1化合物在制剂中所占重量百分比是0.01-99.99％，其余为药物可接受的载体。

9.权利要求1化合物在制备治疗神经系统疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9的应用，所述应用为神经保护药物中的应用。