RU2684100C1 - Производное филлигенина и глюкуроновой кислоты, способ его получения и его применение - Google Patents
Производное филлигенина и глюкуроновой кислоты, способ его получения и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2684100C1 RU2684100C1 RU2017138476A RU2017138476A RU2684100C1 RU 2684100 C1 RU2684100 C1 RU 2684100C1 RU 2017138476 A RU2017138476 A RU 2017138476A RU 2017138476 A RU2017138476 A RU 2017138476A RU 2684100 C1 RU2684100 C1 RU 2684100C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- forsythia
- column
- glucuronic acid
- water
- virus
- Prior art date
Links
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical class OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 title claims abstract 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 11
- 241000555712 Forsythia Species 0.000 claims abstract description 66
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 44
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 44
- CPJKKWDCUOOTEW-UHFFFAOYSA-N sylvatesmin Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1C(COC2C=3C=C(OC)C(O)=CC=3)C2CO1 CPJKKWDCUOOTEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 22
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims abstract description 13
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 43
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 21
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 18
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 abstract description 13
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 4
- DJHDOMQWAUJNKX-UHFFFAOYSA-N phillygenin Natural products COc1ccc(cc1O)C2OCC3C2COC3c4ccc(OC)c(OC)c4 DJHDOMQWAUJNKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 78
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 39
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 24
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 19
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 19
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 17
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N oseltamivir Chemical compound CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N 0.000 description 14
- 229960002194 oseltamivir phosphate Drugs 0.000 description 14
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 13
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 13
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 13
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N ethyl (e)-3-[3-amino-2-cyano-1-[(e)-3-ethoxy-3-oxoprop-1-enyl]sulfanyl-3-oxoprop-1-enyl]sulfanylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\SC(=C(C#N)C(N)=O)S\C=C\C(=O)OCC NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N 0.000 description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 11
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 10
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 10
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 9
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 229930182480 glucuronide Natural products 0.000 description 8
- 150000008134 glucuronides Chemical class 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- 229930013686 lignan Natural products 0.000 description 5
- 235000009408 lignans Nutrition 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 150000005692 lignans Chemical class 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 4
- -1 terpene glycosides Chemical class 0.000 description 4
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K trisodium;6-oxido-4-sulfo-5-[(4-sulfonatonaphthalen-1-yl)diazenyl]naphthalene-2-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=CC=C2C(N=NC3=C4C(=CC(=CC4=CC=C3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 2
- 241000709675 Coxsackievirus B3 Species 0.000 description 2
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- JJVGFDTWFVSBIM-UHFFFAOYSA-N Phillyrin Natural products COc1ccc(cc1OC)C2OCC3C2COC3c4ccc(OC)c(OC5OC(CO)C(O)C(O)C5O)c4 JJVGFDTWFVSBIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- JMFRWRFFLBVWSI-NSCUHMNNSA-N coniferol Chemical compound COC1=CC(\C=C\CO)=CC=C1O JMFRWRFFLBVWSI-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 2
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000002662 enteric coated tablet Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- ZJSJQWDXAYNLNS-UHFFFAOYSA-N (+) pinoresinol-4,4'-di-O-beta-D-glucopyranoside Natural products COC1=CC(C2C3C(C(OC3)C=3C=C(OC)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)=CC=3)CO2)=CC=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O ZJSJQWDXAYNLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGXBRUKMWQGOIE-AFHBHXEDSA-N (+)-Pinoresinol Natural products C1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2[C@@H]3[C@@H]([C@H](OC3)C=3C=C(OC)C(O)=CC=3)CO2)=C1 HGXBRUKMWQGOIE-AFHBHXEDSA-N 0.000 description 1
- BZPIKZWNIVAFRW-UHFFFAOYSA-N (+)-Pinoresinol-beta-D-glucoside Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1C(COC2C=3C=C(OC)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)=CC=3)C2CO1 BZPIKZWNIVAFRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQWVSMVXKMHKTF-JKSUJKDBSA-N (-)-Arctigenin Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C[C@@H]1[C@@H](CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)C(=O)OC1 NQWVSMVXKMHKTF-JKSUJKDBSA-N 0.000 description 1
- HGXBRUKMWQGOIE-NSMLZSOPSA-N (-)-pinoresinol Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC([C@H]2[C@H]3[C@H]([C@@H](OC3)C=3C=C(OC)C(O)=CC=3)CO2)=C1 HGXBRUKMWQGOIE-NSMLZSOPSA-N 0.000 description 1
- FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 10,10-dioxo-2-[4-(N-phenylanilino)phenyl]thioxanthen-9-one Chemical compound O=C1c2ccccc2S(=O)(=O)c2ccc(cc12)-c1ccc(cc1)N(c1ccccc1)c1ccccc1 FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 3beta-hydroxyolean-12-en-28-oic acid Chemical compound C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- YYGRXNOXOVZIKE-UHFFFAOYSA-N Arctigenin Natural products COC1CCC(CC2COC(=O)C2CC3CCC(O)C(C3)OC)CC1OC YYGRXNOXOVZIKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XOJVHLIYNSOZOO-SWOBOCGESA-N Arctiin Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C[C@@H]1[C@@H](CC=2C=C(OC)C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=CC=2)C(=O)OC1 XOJVHLIYNSOZOO-SWOBOCGESA-N 0.000 description 1
- 206010007247 Carbuncle Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- JKLISIRFYWXLQG-UHFFFAOYSA-N Epioleonolsaeure Natural products C1CC(O)C(C)(C)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C(O)=O)CCC(C)(C)CC5C4CCC3C21C JKLISIRFYWXLQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000576429 Forsythia suspensa Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- OIFFJDGSLVHPCW-UHFFFAOYSA-N Guayarol Natural products COc1ccc(CC2C(Cc3ccc(O)c(O)c3)COC2=O)cc1OC OIFFJDGSLVHPCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- NQWVSMVXKMHKTF-UHFFFAOYSA-N L-Arctigenin Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CC1C(CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)C(=O)OC1 NQWVSMVXKMHKTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000207836 Olea <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 241000207834 Oleaceae Species 0.000 description 1
- YBRJHZPWOMJYKQ-UHFFFAOYSA-N Oleanolic acid Natural products CC1(C)CC2C3=CCC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5CCC4(C)C3(C)CCC2(C1)C(=O)O YBRJHZPWOMJYKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJYXULNPSFWEK-UHFFFAOYSA-N Oleanolinsaeure Natural products C1CC(O)C(C)(C)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C(O)=O)CCC(C)(C)CC5C4=CCC3C21C MIJYXULNPSFWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001754 anti-pyretic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- BPYGTFFYYOWDBC-LOVSFRALSA-N arctiin Natural products COc1ccc(C[C@H]2COC(=O)[C@@H]2Cc3ccc(O[C@@H]4O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]4O)c(OC)c3)cc1OC BPYGTFFYYOWDBC-LOVSFRALSA-N 0.000 description 1
- BLUAFEHZUWYNDE-NNWCWBAJSA-N artemisinin Chemical compound C([C@](OO1)(C)O2)C[C@H]3[C@H](C)CC[C@@H]4[C@@]31[C@@H]2OC(=O)[C@@H]4C BLUAFEHZUWYNDE-NNWCWBAJSA-N 0.000 description 1
- 229960004191 artemisinin Drugs 0.000 description 1
- 229930101531 artemisinin Natural products 0.000 description 1
- 229960002521 artenimol Drugs 0.000 description 1
- BJDCWCLMFKKGEE-ISOSDAIHSA-N artenimol Chemical compound C([C@](OO1)(C)O2)C[C@H]3[C@H](C)CC[C@@H]4[C@@]31[C@@H]2O[C@H](O)[C@@H]4C BJDCWCLMFKKGEE-ISOSDAIHSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229940119526 coniferyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 description 1
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930016266 dihydroartemisinin Natural products 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940095399 enema Drugs 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000007227 lymph node tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- NWFYESYCEQICQP-UHFFFAOYSA-N methylmatairesinol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CC1C(=O)OCC1CC1=CC=C(O)C(OC)=C1 NWFYESYCEQICQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001225 nuclear magnetic resonance method Methods 0.000 description 1
- 229940100243 oleanolic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000005371 pilomotor reflex Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- HZLWUYJLOIAQFC-UHFFFAOYSA-N prosapogenin PS-A Natural products C12CC(C)(C)CCC2(C(O)=O)CCC(C2(CCC3C4(C)C)C)(C)C1=CCC2C3(C)CCC4OC1OCC(O)C(O)C1O HZLWUYJLOIAQFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004879 pulmonary tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 208000009421 viral pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
- C07H1/08—Separation; Purification from natural products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Изобретение также относится к противовирусному производному общей формулы (I), фармацевтическим композициям на его основе, способу его получения, которые могут быть использованы в фармацевтической и медицинской отрасли:,где R=CH, R=CH, R=H или R-R=-CH-, R=CH; n=1-30. Предложенный способ включает смешивание листьев форсайтии с водой, нагревание с кипячением и экстракцией с получением водного экстракта форсайтии; разделение водного экстракта форсайтии на колонке с макропористой смолой; проведение хроматографии элюата из форсайтии, полученного на колонке с макропористой смолой, на колонке с силикагелем, сбор элюата, его высушивание. Предложены новое производное филлигенина и глюкуроновой кислоты, новый эффективный способ его получения, фармацевтические композиции на его основе для приготовления лекарств, эффективных для предотвращения и лечения гриппа. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 пр., 9 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к способу получения производного филлигенина и глюкуроновой кислоты и к противовирусному эффекту такого производного филлигенина и глюкуроновой кислоты.
Уровень техники
Глюкурониды филлигенина - это активные вещества, выделяемые из высушенных листьев форсайтии пониклой (форзиции свисающей) Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl. из семейства маслиновых (Oleaceae). Это растение используется в традиционной китайской медицине на протяжении двух тысячелетий; впервые оно описано в классическом фармакологическом сочинении о травах и лекарственных средствах «Shennong's Herbal Classic» («Трактат Шэнь-нуна о корнях и травах») следующим образом: «форсайтию применяют в основном для лечения озноба и жара, карбункулов, злокачественных язв, стойкой лихорадки и золотухи»
С тех пор, как Murakami впервые выделил из плодов форсайтии олеаноловую кислоту, сообщалось о более чем шестидесяти компонентах этого и родственных ему растений. В их число входят, главным образом, терпены, фенэтиловый спирт и его терпеновые гликозиды, лигнаны, флавоноиды и некоторые спирты, простые и сложные эфиры, кетоны и другие химические соединения.
Лигнаны в форсайтии представлены в основном лигнанолидами и бисэпоксилигнанами. В 1978 г. Nishibe с коллегами выделили из форсайтии арктигенин, матарезинол, арктиин и матайрезинозид. В 1985 г. Tsukamoto с коллегами выделили из плодов форсайтии филлигенин, (+)-пинорезинол, филлирин, (+)-пинорезинол-β-D-глюкозид и (+)-эпинорезинол-4-O-глюкозид. В 1977 г. Liu Donglei с коллегами выделили из плодов форсайтии (+)-пинорезинолмонометиловый эфир-β-D-глюкозид. Недавние исследования биосинтеза показали, что предшественником лигнанов в форсайтии является конифериловый спирт. Что касается лигнанов и лигнановых гликозидов форсайтии, то возможны полностью замещенные в положениях 3,3' метокси или полностью замещенные в положениях 4,4' гидроксилпроизводные, замещенные метокси или же образующие гликозиды с сахаридами.
Три глюкуронида филлигенина были впервые выделены из листьев форсайтии. Производные глюкуроновой кислоты обладают важными биологическими активностями, например производные глюкуроновой кислоты и артемизинина (Efficient Preparations of the β-Glucuronides of Dihydroartemisinin and Structural Confirmation of the Human Glucuronide Metabolite. Paul M. O'Neill, Feodor Scheinmann, Andrew V. Stachulski, James L. Maggs, и B. Kevin Park. J. Med. Chem., 2001, 44 (9), pp 1467-1470); производные глюкуроновой кислоты и эдаравона (Synthesis of the metabolites of a free radical scavenger edaravone (MCI-186, Radicut™). Kazutoshi Watanabe, Masao Taniguchi, Masaki Shinoda. Redox Report, Vol. 8, No. 3, 2003, 157-161), производные глюкуроновой кислоты и комбретастатина A-1 (Regio- and Stereospecific Synthesis of Mono-β-d-Glucuronic Acid Derivatives of Combretastatin A-1.Rajendra P. Tanpure, Tracy E. Strecker, David J. Chaplin, Bronwyn G. Siim, Mary Lynn Trawick и Kevin G. Pinney.J. Nat. Prod., 2010, 73 (6), pp 1093-1101); производные глюкуроновой кислоты и ресвератрола (WANG LAIXI; Heredia, A.; Song, HJ; ZHANG ZHAOJUN; YU BIAO; Davis, C.; Redfield, R. Resveratrol glucuronides Characterization, synthesis, and anti-HIV activity. J. Pharm. Sci. 2004, 93(10), 2448-2457); производные глюкуроновой кислоты и куркумина (K.S.Psrvathy, M.Sc. University of Mysore. 2009) и др. В связи с изложенным, изучаются способы получения трех глюкуронидов филлигенина и проводятся соответствующие фармакологические исследования.
Раскрытие изобретения
Цель данного изобретения - получить источник новых противовирусных лекарственных средств - производных филлигенина и глюкуроновой кислоты, способы получения производных филлигенина и глюкуроновой кислоты, и применение этих производных филлигенина и глюкуроновой кислоты в качестве противовирусного агента. Производные филлигенина и глюкуроновой кислоты, описываемые в данном изобретении, обладают противовирусным действием, и их можно использовать при получении лекарственных или иных медицинских продуктов, предназначенных для лечения и предотвращения инфекций вирусами гриппа. Способы получения производных глюкуроновой кислоты и филлигенина отличаются технологической простотой и удобством осуществления, а также пригодны для промышленного производства в больших масштабах.
Для достижения указанной цели данного изобретения предлагаются, с одной стороны, производное глюкуроновой кислоты и филлигенина общей молекулярной формулы (I):
(I)
где R1=H, R2=CnH2n+1, R3=CnH2n+1 или R1=CnH2n+1, R2=CnH2n+1, R3=H или R1-R2=-CH2-, R3=CnH2n+1; n=1-30,
причем n в группе-заместителе равно 1.
С другой стороны, в данном изобретении описывается способ получения производного глюкуроновой кислоты и филлигенина. Этот способ включает последовательно следующие этапы:
1) смешивание листьев форсайтии с экстрагирующим растворителем, представляющим собой воду, нагревание, отваривание (кипячение) и экстракцию 2-3 раза, сбор и объединение порций раствора после экстракции, в результате чего получается водный экстракт форсайтии;
2) разделение водного экстракта форсайтии при помощи колонки с макропористой смолой, сбор и объединение порций элюата, в результате чего получается выделенный на колонке со смолой элюат из форсайтии;
3) высушивание полученного на колонке со смолой элюата из форсайтии, проведение хроматографии на колонке с силикагелем, фракционный сбор элюата и высушивание элюата, в результате чего получается желаемый продукт.
На этапе 1) нагревание и экстракцию предпочтительно осуществляют два раза.
В частном случае, при каждой процедуре отваривания (кипячения) и экстракции массовое соотношение листьев форсайтии и экстрагирующего растворителя, представляющего собой воду, составляет 1:(6-10), предпочтительно 1:(8-10).
Более конкретно, при первом отваривании (кипячении) массовое соотношение листьев форсайтии и экстрагирующего растворителя, представляющего собой воду, составляет 1:(9-10), при втором отваривании (кипячении) массовое соотношение листьев форсайтии и экстрагирующего растворителя (воды) составляет 1:8.
В частном варианте, способ получения дополнительно включает следующие этапы: концентрирование водного экстракта форсайтии, полученного на этапе 1); получение концентрированного раствора из форсайтии и осуществление разделения на колонке с макропористой смолой.
Говоря более конкретно, отношение объема концентрированного раствора из форсайтии, полученного путем концентрирования, к массе листьев форсайтии составляет (1-5):1, предпочтительно (2-2,5):1, причем процедура проведения колоночной хроматографии с использованием макропористой смолы на этапе 2) последовательно включает следующие подэтапы: инжектирование водного экстракта форсайтии в колонку с макропористой смолой и элюирование водой в качестве элюирующего растворителя; элюирование раствором этилового спирта с массовой концентрацией 3-50% в качестве элюирующего растворителя; и, наконец, элюирование абсолютным этиловым спиртом в качестве элюирующего растворителя; в результате получается элюат из форсайтии после пропускания через макропористую смолу.
В частном варианте, при процедуре колоночной хроматографии с использованием макропористой смолы отношение массы листьев форсайтии, взятых для приготовления водного экстракта, к объему макропористой смолы составляет 1:(0,8-2,5), предпочтительно 1:1,
Более конкретно, при разделении на колонке с макропористой смолой отношение диаметра колонки к высоте столба смолы в ней составляет 1:(5-10), предпочтительно 1:(5-7), более предпочтительно 1:(5,5-5,9), причем на этапе 2) в качестве макропористой смолы берут один из следующих продуктов: X-5, AB-8, NK-2, NKA-2, NK-9, D3520, D101 и WLD; предпочтительно используется X-5 или AB-8.
В частном варианте при элюировании с использованием воды в качестве элюирующего растворителя отношение используемого количества воды к объему колонки с макропористой смолой составляет (2-4):1, предпочтительно 4:1; при элюировании с использованием раствора этилового спирта с массовой концентрацией 3-50% в качестве элюирующего растворителя отношение используемого количества раствора этилового спирта с массовой концентрацией 3-50% к объему колонки с макропористой смолой составляет (2-8):1, предпочтительно (4-8):1, более предпочтительно 8:1; при элюировании с использованием абсолютного этилового спирта в качестве элюирующего растворителя отношение используемого количества абсолютного этилового спирта к объему колонки с макропористой смолой составляет (2-8):1, предпочтительно (4-8):1, более предпочтительно 8:1,
при этом проведение колоночной хроматографии с использованием силикагеля на этапе 3) последовательно включает следующие подэтапы:
A) концентрирование элюата из форсайтии, полученного в результате пропускания через колонку со смолой, и высушивание полученного концентрата, в результате чего получается неочищенный продукт из форсайтии;
B) растворение неочищенного продукта из форсайтии в воде, нанесение полученного раствора на колонку с силикагелем, проведение колоночной хроматографии с использованием силикагеля, фракционный сбор элюата и его высушивание, в результате чего получается желаемый продукт.
В частном варианте, на этапе В) колонку с силикагелем выбирают из колонок для хроматографии с обращенной фазой, причем наполнение обращенно-фазовой колонки выбирают из силикагеля С18 для обращенно-фазовой хроматографии; размер частиц в колонке с силикагелем составляет 5-10 мкм.
В частном варианте, внутренний диаметр колонки с силикагелем для обращенно-фазовой хроматографии составляет 10-100 мм, а длина 100-300 мм, предпочтительно внутренний диаметр колонки составляет 22,2 мм, длина - 250 мм, причем для проведения колоночной хроматографии с использованием силикагеля выбирают колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В частном варианте, в качестве подвижной фазы при колоночной хроматографии с использованием силикагеля выбирают смешанный раствор - метиловый спирт (А) с водой (В), которые берут в объемном соотношении метиловый спирт (А) : вода (В) от 8:2 до 10:1.
В частном варианте, при проведении колоночной хроматографии с использованием силикагеля температура колонки составляет 20-35оС, а скорость потока 4-30 мл/мин.
В частном варианте, при проведении колоночной хроматографии с использованием силикагеля элюирование образцов подвижной фазой изократическое или градиентное, причем градиент элюирования составляет [0 мин (30% A) → 25 мин (50% A) → 50 мин (50% A)]; скорость потока составляет 4,0 мл/мин; температура колонки составляет 20°C; детекцию осуществляют на длине волны 273 нм.
В частном варианте, при проведении колоночной хроматографии с использованием силикагеля соблюдались следующие условия: наполняющим материалом служил силикагель С18 для обращенно-фазовой хроматографии; диаметр столба наполняющего материала 22,2 мм, высота 250 нм, размер частиц 10 мкм; в качестве подвижной фазы служила смесь метилового спирта (А) с водой (B); градиентное элюирование 0-25 мин при концентрации метилового спирта 30%-50%; градиентное элюирование 25-50 мин при концентрации метилового спирта 50%-50%; скорость потока 4,0 мл/мин; температура колонки 20°C; детекция в ультрафиолетовом диапазоне на длине волны 273 нм.
Производные филлигенина и глюкуроновой кислоты, полученные способом по данному изобретению, являются соединениями I, II и III. Их структура определена и подтверждена следующими аналитическими данными:
Соединение I: 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид
Масс-спектрометрия с ионизацией распылением в электрическом поле (ESI-MS): m/z - 533,1658 [M-H]-; молекулярная масса - 534; химическая формула - C26H30O12.
Ядерный магнитный резонанс (1H-ЯМР) (400 MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):12,0(1H; s; COOH); 7,119- 7,099(1H; d; J=8,0Hz; Ar-H); 6,530-6,943(2H; d; J=4,0Hz; Ar-H); 6,872(3H; s; Ar-H); 5,39(2H; s; J=4,8Hz); 5,23(1H; d; J=4,8Hz); 5,1(1H; d; J=4,8Hz); 4,800(1H; d; J=4,8Hz); 4,374-4,388(1H; d; J=9,6Hz); 4,105-4,085(1H; d; J=8,0Hz); 4,005-3,982(1H; d; J=9,2Hz); 3,75(8H; d; J=8,4Hz); 3,422(1H; t; J=8,7Hz); 3,08(1H; t; J=8,1Hz); 2,85(1H; d; J=7,2Hz).
Ядерный магнитный резонанс (13С-ЯМР) (100MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):172,75(C-17); 149,51(C-9); 148,95(C-34); 148,09(C-33); 145,74(C-8); 136,26(C-11); 131,67(C-30); 118,55(C-12); 118,05(C-31); 115,72(C-13); 112,03(C-32); 111,07(C-10); 109,92(C-35); 100,21(C-2); 87,11(C-26); 81,74(C-22); 76,26(C-6); 75,70(C-3); 73,41(C-5); 71,91(C-4); 70,81(C-28); 69,46(C-24); 56,15(C-21); 55,99(C-38); 54,47(C-29); 49,79(C-25).
Соединение II: 9-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид
ESI-MS: m/z - 533,1641 [M-H]-; молекулярная масса - 534; химическая формула - C26H30O12.
1H-ЯМР (400 MHz, d6-ДМСО): δ(ppm):12,0(1H; s; COOH); 7,119-7,099(1H; d; J=8,0Hz; Ar-H); 6,530-6,943(2H; d; J=4,0Hz; Ar-H); 6,872(3H; s; Ar-H); 5,39(2H; s; J=4,8Hz); 5,23(1H; d; J=4,8Hz); 5,1(1H; d; J=4,8Hz); 4,800(1H; d; J=4,8Hz); 4,374-4,388(1H; d; J=9,6Hz); 4,105-4,085(1H; d; J=8,0Hz); 4,005-3,982(1H; d; J=9,2Hz); 3,75(8H; d; J=8,4Hz); 3,422(1H; t; J=8,7Hz); 3,08(1H; t; J=8,1Hz); 2,85(1H; d; J=7,2Hz).
13С-ЯМР (100MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):173,72(C-17); 149,51(C-33); 148,95(C-34); 148,09(C-9); 144,74(C-8); 136,26(C-11); 131,67(C-30); 121,45(C-12); 119,72(C-31); 118,05(C-13); 115,07(C-10); 113,03(C-32); 109,92(C-35); 100,21(C-2); 87,11(C-26); 81,74(C-22); 76,26(C-6); 75,70(C-3); 73,41(C-5); 71,91(C-4); 70,81(C-28); 69,46(C-24); 56,15(C-21); 55,99(C-38); 54,47(C-29); 50,16(C-25).
Соединение III: 33,34-метилендиоксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид
ESI-MS: m/z - 531,4933 [M-H]-, молекулярная масса - 532; химическая формула - C26H28O12.
1Н-ЯМР (400 MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):12,0(1H; s; COOH); 7,119-7,099(1H; d; J=8,0Hz; Ar-H); 6,530-6,943(2H; d; J=4,0Hz; Ar-H); 6,872(3H; s; Ar-H); 6,12(2H; s); 5,39(2H; s; J=4,8Hz); 5,23(1H; d; J=4,8Hz); 5,1(1H; d; J=4,8Hz); 4,800(1H; d; J=4,8Hz); 4,374-4,388(1H; d; J=9,6Hz); 4,105-4,085(1H; d; J=8,0Hz); 4,005-3,982(1H; d; J=9,2Hz); 3,75(8H; d; J=8,4Hz); 3,422(1H; t; J=8,7Hz); 3,08(1H; t; J=8,1Hz); 2,85(1H; d; J=7,2Hz);
13С-ЯМР (100MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):169,75(C-17); 149,51(C-9); 148,95(C-34); 148,09(C-33); 145,74(C-8); 136,26(C-11); 131,67(C-30); 118,55(C-12); 118,05(C-13); 115,72(C-31); 112,03(C-32); 111,07(C-10); 109,92(C-35); 101,21(C-2); 100,29(C-38); 87,11(C-26); 81,74(C-22); 76,26(C-6); 75,70(C-3); 73,41(C-16); 71,91(C-4); 70,81(C-28); 69,46(C-24); 56,15(C-21); 54,47(C-29); 49,79(C-25).
В способе по изобретению большинство загрязнений удаляются путем очистки на колонке с макропористой смолой, которую можно использовать повторно, что снижает стоимость производства, и срок службы полупрепаративной хроматографической колонки на следующем этапе продлевается. Сама процедура несложная в исполнении, эффективность экстракции высока, загрязнение небольшое, так что получаемый продукт отличается высокой степенью чистоты и его получение легко может быть осуществлено в промышленных условиях.
В другом аспекте данного изобретения описывается противовирусное применение производных филлигенина и глюкуроновой кислоты.
В другом аспекте данного изобретения описывается назначение производных филлигенина и глюкуроновой кислоты, а именно их применение при получении лекарственных средств для предотвращения и/или лечения инфекций вирусами гриппа.
В данном изобретении описывается композиция лекарственного или иного медицинского продукта, обладающая противовирусным эффектом и содержащая производное филлигенина и глюкуроновой кислоты.
В частности, предлагаемая фармацевтическая композиция содержит производные филлигенина и глюкуроновой кислоты по данному изобретению, а также фармацевтически приемлемые эксципиенты.
Способ получения глюкуронидов филлигенина и их предназначенность для лекарственных средств, применяемых при предотвращении и лечении инфекций вирусами гриппа, не ограничиваются описанными в настоящем документе соединениями. Глюкурониды филлигенина также включают производные, полученные путем синтеза, ферментации и другими методами с использованием описанных в настоящем документе соединений в качестве исходных.
В данном изобретении фармацевтически приемлемые эксципиенты означают нетоксичные твердые, полужидкие или жидкие наполнители, разбавители, носители/несущие среды, агенты, влияющие на рН, агенты, влияющие на ионную силу, материалы для получения препаратов с замедленным высвобождением активных ингредиентов, покрывающие агенты или иные эксципиенты, используемые при изготовлении лекарственных препаратов. Носители/несущие среды выбирают в зависимости от лекарственной формы, используемой для введения в организм пациента. Известные специалистам в данной области техники эксципиенты могут входить в состав препаратов для инъекций, порошков, полученных путем лиофилизации (для инъекций), распыляемых/разбрызгиваемых препаратов (спреев), растворов и суспензий для перорального применения, таблеток, капсул, таблеток с кишечно-растворимой оболочкой, пилюль, порошков, гранул, препаратов с замедленным или задержанным высвобождением и др. В первом аспекте данного изобретения 4-деметилированный глюкуронид филлигенина предпочтительно вводят путем инъекций или через пищеварительный тракт. Соответственно, фармацевтическая композиция по данному изобретению предпочтительно представлена формами для инъекций или для введения через пищеварительный тракт, то есть эксципиенты по данному изобретению предпочтительно должны быть пригодны для включения в препараты, вводимые путем инъекций иди через пищеварительный тракт, причем по данному изобретению термин «введение через пищеварительный тракт» относится к способам введения лекарственных препаратов через пищеварительный тракт пациента, включая пероральное введение, интрагастральное введение, введение с помощью клизмы и др., предпочтительно пероральное введение. Например, известные специалистам в данной области техники эксципиенты по данному изобретению могут входить в состав растворов и суспензий для перорального применения, таблеток, капсул, таблеток с кишечно-растворимой оболочкой, пилюль, порошков, гранул, препаратов с замедленным или задержанным высвобождением и др., причем термин «препараты, вводимые путем инъекций» в настоящем документе относится в основном к растворам для инъекций и к порошкам для приготовления растворов, вводимых путем инъекций.
Новые соединения по данному изобретению, а именно производные филлигенина и глюкуроновой кислоты, обладают противовирусным действием и могут быть включены в состав противовирусных, жаропонижающих, болеутоляющих и противовоспалительных лекарственных или иных медицинских продуктов. В способе получения производных филлигенина и глюкуроновой кислоты по изобретению нетрудно регулировать рабочие условия и контролировать качество продукта; этот способ отличается высоким выходом, низкой энергоемкостью, он экологически безопасен и пригоден для крупномасштабного промышленного производства.
Осуществление изобретения
Далее данное изобретение описывается на примере его конкретных воплощений. Однако эти воплощения представлены в настоящем документе только в иллюстративных целях и их не следует считать ограничивающими объем изобретения.
Воплощение 1
1. Тепловая обработка для получения отвара
1-1) Листья форсайтии измельчают и пропускают через сито 20 меш, в результате чего получается порошок, к которому прибавляют воду из расчета 10 кг воды на 1 кг листьев. Порошок из листьев с водой перемешивают до однородности и нагревают, и проводят первую обработку для получения отвара, в рамках которой смесь лиственного порошка и воды в соотношении 1:10 нагревают и кипятят, отваривают и экстрагируют в течение 2 часов. Полученный отвар фильтруют, в результате чего получается первый раствор - продукт экстракции и первый остаток после экстракции.
1-2) В первый остаток после экстракции прибавляют 8 кг воды, нагревают и кипятят. При этой второй обработке для получения отвара соотношение добавленной воды и листьев форсайтии составляет 8:1, продолжительность отваривания и экстракции составляет 1 час. Полученный отвар фильтруют, в результате чего получается второй раствор - продукт экстракции и второй остаток после экстракции (его отбрасывают).
1-3) Объединяют первый и второй растворы, полученные в результате экстракции; этот объединенный раствор - водный экстракт форсайтии;
1-4) Проводят вакуумное концентрирование водного экстракта форсайтии с помощью роторного вакуумного испарителя, в результате чего извлекают растворитель и получают 2л концентрированного раствора форсайтии для последующего использования; отношение массы листьев форсайтии к объему полученного концентрированного раствора составляет 1:2.
2. Хроматография на колонке с макропористой смолой
2-1) В хроматографическую колонку с макропористой смолой наносят концентрированный раствор - экстракт листьев форсайтии и проводят разделение. При этом макропористую смолу выбирают из продуктов типа AB-8; объем макропористой смолы в колонке составляет 1л, диаметр колонки 60 мм, высота - 500 мм, высота столба смолы в колонке 354 мм); отношение объема смолы в колонке к сухой массе листьев форсайтии 1:1 (например, если сухая масса листьев форсайтии составляла 1 кг, то объем макропористой смолы в хроматографической колонке 1 л; если сухая масса лекарственного сырья была 1 г, то объем смолы 1 мл). Через колонку пропускают четырехкратный (по отношению к объему смолы в колонке) объем воды (4 л); после того, как концентрированный раствор - экстракт форсайтии, нанесенный на колонку, полностью уйдет в смолу, элюат удаляют. Затем проводят элюирование 8-кратным объемом раствора этилового спирта с массовой концентрацией 3% (то есть 8 л); элюат удаляют. Затем проводят элюирование 8-кратным объемом абсолютного этилового спирта (то есть 8 л) и собирают элюат.
2-2) Проводят вакуумное концентрирование элюата, полученного на этапе 2-1), с помощью роторного вакуумного испарителя. Концентрат высушивают, получая в результате 62 г неочищенного продукта из форсайтии.
3. Хроматография на колонке с силикагелем
3-1) Отвешивают 0,5 г неочищенного продукта из форсайтии, прибавляют соответствующее количество воды (2,5 мл), перемешивают и растворяют для последующего использования.
3-2) Проводят хроматографическую обработку неочищенного продукта из форсайтии путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), используя полупрепаративный жидкостной хроматограф Shimadzu с контроллером SCL-10AVP, насосом LC-8A и спектрофотометрическим детектором SPD-20A, для разделения и очистки неочищенного продукта из форсайтии. Растворенный в воде неочищенный продукт из форсайтии вводят в хроматограф и проводят градиентное элюирование смесью метиловый спирт-вода; при этом размеры хроматографической колонки 22,5х250 мм, наполнитель - силикагель С18 для обращенно-фазовой хроматографии, размер частиц 10 нм, количество введенного материала 500 мг, подвижная фаза - смесь метилового спирта с водой. Условия градиентного элюирования: 0-25 мин, концентрация метилового спирта 30%-50%; 25-50 мин, концентрация метилового спирта 50%-50%; скорость потока 4 мл/мин; температура колонки 20°C. Детекцию проводят в ультрафиолетовой области спектра на длине волны 273 нм. Собирают фракции с временем удерживания 25,5-27,5 мин, 30,5-32,5 мин и 35,5-37,5мин.
3-3) Проводят вакуумное концентрирование и высушивание трех собранных фракций, получая в результате соединение I (70,5 мг), соединение II (53,2 мг) и соединение III (46,6 мг).
Состав полученных образцов соединений I, II и III определяли путем HPLC при следующих условиях детекции: насос хроматографической системы модели Waters 515, детектор 2487, колонка Kromasil RP-C18; подвижная фаза - ацетонитрил/0,1%-ный раствор фосфорной кислоты в соотношении 13:87, длина волны 230 нм, скорость потока 1,0 мл/мин.
По данным HPLC чистота полученного соединения I составляет 99,6%, соединения II - 98,1% и соединения III - 98,3%.
Соединение I представляет собой твердое вещество белого цвета с температурой плавления 111°С, растворимое в воде и этиловом спирте. При тонкослойной хроматографии (элюирование раствором хлороформ/метиловый спирт 3:1, Rf = 0,25) с визуализацией реагентом 10%H2SO4-этиловый спирт соединение I на пластине выглядит пурпурно-красным.
ESI-MS: m/z - 533,1658 [M-H]-, молекулярная масса - 534.
1Н-ЯМР (400 MHz, d6-ДМСО): δ(ppm):12,0(1H; s; COOH); 7,119- 7,099(1H; d; J=8,0Hz; Ar-H); 6,530-6,943(2H; d; J=4,0Hz; Ar-H); 6,872(3H; s; Ar-H); 5,39(2H; s; J=4,8Hz); 5,23(1H; d; J=4,8Hz); 5,1(1H; d; J=4,8Hz); 4,800(1H; d; J=4,8Hz); 4,374-4,388(1H; d; J=9,6Hz); 4,105-4,085(1H; d; J=8,0Hz); 4,005-3,982(1H; d; J=9,2Hz); 3,75(8H; d; J=8,4Hz); 3,422(1H; t; J=8,7Hz); 3,08(1H; t; J=8,1Hz); 2,85(1H; d; J=7,2Hz).
13С-ЯМР (100MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):172,75(C-17); 149,51(C-9); 148,95(C-34); 148,09(C-33); 145,74(C-8); 136,26(C-11); 131,67(C-30); 118,55(C-12); 118,05(C-31); 115,72(C-13); 112,03(C-32); 111,07(C-10); 109,92(C-35); 100,21(C-2); 87,11(C-26); 81,74(C-22); 76,26(C-6); 75,70(C-3); 73,41(C-5); 71,91(C-4); 70,81(C-28); 69,46(C-24); 56,15(C-21); 55,99(C-38); 54,47(C-29); 49,79(C-25).
На основании данных ESI-MS, 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР соединение I решено назвать «33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид». Структурная формула соединения I имеет следующий вид:
Соединение II представляет собой твердое вещество белого цвета с температурой плавления 113°С, растворимое в воде и этиловом спирте. При тонкослойной хроматографии (элюирование раствором хлороформ/метиловый спирт 3:1, Rf = 0,32) с визуализацией реагентом 10%H2SO4-этиловый спирт соединение II на пластине выглядит пурпурно-красным.
ESI-MS: m/z - 533,1641 [M-H]-, молекулярная масса - 534.
1Н-ЯМР (400 MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):12,0(1H; s; COOH); 7,119-7,099(1H; d; J=8,0Hz; Ar-H); 6,530-6,943(2H; d; J=4,0Hz; Ar-H); 6,872(3H; s; Ar-H); 5,39(2H; s; J=4,8Hz); 5,23(1H; d; J=4,8Hz); 5,1(1H; d; J=4,8Hz); 4,800(1H; d; J=4,8Hz); 4,374-4,388(1H; d; J=9,6Hz); 4,105-4,085(1H; d; J=8,0Hz); 4,005-3,982(1H; d; J=9,2Hz); 3,75(8H; d; J=8,4Hz); 3,422(1H; t; J=8,7Hz); 3,08(1H; t; J=8,1Hz); 2,85(1H; d; J=7,2Hz).
13С-ЯМР (100MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):173,72(C-17); 149,51(C-33); 148,95(C-34); 148,09(C-9); 144,74(C-8); 136,26(C-11); 131,67(C-30); 121,45(C-12); 119,72(C-31); 118,05(C-13); 115,07(C-10); 113,03(C-32); 109,92(C-35); 100,21(C-2); 87,11(C-26); 81,74(C-22); 76,26(C-6); 75,70(C-3); 73,41(C-5); 71,91(C-4); 70,81(C-28); 69,46(C-24); 56,15(C-21); 55,99(C-38); 54,47(C-29); 50,16(C-25).
На основании данных ESI-MS, 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР соединение II решено назвать «9-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид». Структурная формула соединения II имеет следующий вид:
Соединение III представляет собой твердое вещество белого цвета с температурой плавления 119°С, растворимое в воде и этиловом спирте. При тонкослойной хроматографии (элюирование раствором хлороформ/метиловый спирт 3:1, Rf = 0,36) с визуализацией реагентом 10%H2SO4-этиловый спирт соединение III на пластине выглядит пурпурно-красным.
ESI-MS: m/z - 531,4933 [M-H]-, молекулярная масса - 532.
1Н-ЯМР (400 MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):12,0(1H; s; COOH); 7,119-7,099(1H; d; J=8,0Hz; Ar-H); 6,530-6,943(2H; d; J=4,0Hz; Ar-H); 6,872(3H; s; Ar-H); 6,12(2H; s); 5,39(2H; s; J=4,8Hz); 5,23(1H; d; J=4,8Hz); 5,1(1H; d; J=4,8Hz); 4,800(1H; d; J=4,8Hz); 4,374-4,388(1H; d; J=9,6Hz); 4,105-4,085(1H; d; J=8,0Hz); 4,005-3,982(1H; d; J=9,2Hz); 3,75(8H; d; J=8,4Hz); 3,422(1H; t; J=8,7Hz); 3,08(1H; t; J=8,1Hz); 2,85(1H; d; J=7,2Hz).
13С-ЯМР (100MHz; d6-ДМСО): δ(ppm):169,75(C-17); 149,51(C-9); 148,95(C-34); 148,09(C-33); 145,74(C-8); 136,26(C-11); 131,67(C-30); 118,55(C-12); 118,05(C-13); 115,72(C-31); 112,03(C-32); 111,07(C-10); 109,92(C-35); 101,21(C-2); 100,29(C-38); 87,11(C-26); 81,74(C-22); 76,26(C-6); 75,70(C-3); 73,41(C-16); 71,91(C-4); 70,81(C-28); 69,46(C-24); 56,15(C-21); 54,47(C-29); 49,79(C-25).
На основании данных ESI-MS, 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР соединение III решено назвать «33,34-метилендиоксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид». Структурная формула соединения III имеет следующий вид:
Воплощение 2
1. Тепловая обработка для получения отвара
1-1) Листья форсайтии измельчают и пропускают через сито 20 меш, в результате чего получается порошок, к которому прибавляют воду из расчета 9 кг воды на 1 кг листьев. Порошок из листьев с водой перемешивают до однородности и нагревают, и проводят первую обработку для получения отвара, в рамках которой смесь лиственного порошка и воды (массовое отношение вода:листья = 9:1) нагревают и кипятят, отваривают и экстрагируют в течение 2,5 часов. Полученный отвар фильтруют, в результате чего получается первый раствор - продукт экстракции и первый остаток после экстракции.
1-2) В первый остаток после экстракции прибавляют 8 кг воды, нагревают и кипятят. При этой второй обработке для получения отвара соотношение добавленной воды и листьев форсайтии составляет 8:1, а продолжительность отваривания и экстракции - 1 час. Полученный отвар фильтруют, в результате чего получается второй раствор - продукт экстракции и второй остаток после экстракции (его отбрасывают).
1-3) Объединяют первый и второй растворы, полученные в результате экстракции; этот объединенный раствор представляет собой водный экстракт форсайтии.
1-4) Проводят вакуумное концентрирование водного экстракта форсайтии с помощью роторного вакуумного испарителя, в результате чего извлекают растворитель и получают 2,5 л концентрированного раствора для последующего использования; Отношение массы листьев форсайтии к объему полученного концентрированного раствора составляет 1:2,5.
2. Хроматография на колонке с макропористой смолой
2-1) В хроматографическую колонку с макропористой смолой наносят концентрированный экстракт листьев форсайтии и проводят разделение. Для этого макропористую смолу выбирают из продуктов типа Х-5; объем макропористой смолы в колонке составляет 1 л, диаметр колонки 60 мм, высота - 500 мм, высота столба смолы в колонке 354 мм); отношение объема смолы в колонке к сухой массе листьев форсайтии 1:1 (например, если сухая масса листьев форсайтии составляла 1 кг, то объем макропористой смолы в хроматографической колонке 1 л; если сухая масса лекарственного сырья была 1 г, то объем смолы 1 мл). Через колонку пропускают восьмикратный (по отношению к объему смолы) объем деионизованной воды (т.е. 8 л); после того, как концентрированный экстракт форсайтии, нанесенный на колонку, полностью уйдет в смолу, элюат удаляют. Затем проводят элюирование 4-кратным объемом 3%-ного (масса/масса) раствора этилового спирта (то есть 4 л); элюат удаляют. Затем проводят элюирование 8-кратным объемом абсолютного этилового спирта (то есть 8 л) и собирают элюат.
2-2) Проводят вакуумное концентрирование элюата, полученного на этапе 2-1), с помощью роторного вакуумного испарителя. Концентрат высушивают, получая в результате 58 г неочищенного продукта из форсайтии.
3. Хроматография на колонке с силикагелем
3-1) Отвешивают 0,8 г неочищенного продукта из форсайтии, прибавляют соответствующее количество воды (1,6 мл), перемешивают и растворяют продукт для последующего использования.
3-2) Проводят хроматографическую обработку неочищенного продукта из форсайтии путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), используя полупрепаративный жидкостной хроматограф Shimadzu с контроллером SCL-10AVP, насосом LC-8A и спектрофотометрическим детектором SPD-20A, разделение и очистку неочищенного продукта из форсайтии. Растворенный в воде неочищенный продукт из форсайтии вводят в хроматограф и проводят градиентное элюирование смесью метиловый спирт-вода; при этом размеры хроматографической колонки 22,5х250 мм, наполнитель - силикагель С18 для обращенно-фазовой хроматографии, размер частиц 10 нм, количество введенного материала 800 мг, подвижная фаза - смесь метилового спирта с водой. Условия градиентного элюирования: 0-25 мин, концентрация метилового спирта 30%-50%; 25-50 мин, концентрация метилового спирта 50%-50%; скорость потока 4 мл/мин; температура колонки 20°C. Детекцию проводят в ультрафиолетовой области спектра на длине волны 273 нм. Собирают фракции с временем удерживания 25,5-27,5 мин, 30,5-32,5 мин и 35,5-37,5мин.
3-3) Проводят вакуумное концентрирование и высушивание трех собранных фракций, получая в результате соединение А (104,2 мг), соединение В (74,3 мг) и соединение С (58,1 мг).
Состав полученных образцов соединений А, В и С определяли путем HPLC при следующих условиях детекции: насос хроматографической системы модели Waters 515, детектор 2487, колонка Kromasil RP-C18; подвижная фаза - ацетонитрил/0,1-ный раствор фосфорной кислоты в соотношении 13:87, длина волны 230 нм, скорость потока 1,0 мл/мин.
По данным HPLC чистота полученного соединения А составляет 99,3%, соединения В - 98,4% и соединения С - 98,5%.
Физико-химические свойства, результаты анализа методами масс-спектрометрии и ядерного магнитного резонанса соединений A, B и C, полученных в воплощении 2, такие же, как соединений I, II и III, полученных в воплощении 1.
Испытание продуктов 1. Определение противовирусного эффекта in vitro
1.1 Материалы
(1) Лекарственные средства
I. Испытываемые агенты
Глюкурониды филлигенина (то есть соединения I, II и III, полученные в воплощении 1 данного изобретения.
II. Агенты положительного контроля
Рибавирин для инъекций - бесцветная прозрачная жидкость; производство Henan Runhong Pharmaceutical Co., Ltd., серийный номер продукта 1206261, номер официального утверждения препарата Государственным управлением по контролю качества медикаментов и продуктов питания Китая (SFDA) H19993553, концентрация 100 мг/мл. Используется в качестве положительного контроля.
Оселтамивира фосфат - предоставлен Государственными институтами по контролю качества медикаментов и продуктов питания Китая (National Institutes for Food and Drug Control), серийный номер продукта 101096-200901, 100 мг/шт. Используется в качестве положительного контроля.
Филлигенин - белый порошок; производство Dalian Fusheng Natural Drug Development Co., Ltd.; чистота 99,2% (по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии с детекцией 1) по поглощению в ультрафиолетовой области и 2) с помощью испарительного нефелометрического детектора с применением метода нормализации площадей).
Каждый из указанных агентов растворяли в очищенной воде, фильтровали и расфасовывали для последующего использования при температуре 4°C в качестве детектируемых агентов в данном испытании.
(2) Линии клеток
Линия Vero (почечные клетки африканской зеленой мартышки); коллекция Школы фундаментальной медицины Цзилиньского университета (Китай)
(3) Штаммы вирусов
I. Штаммы вирусов гриппа, парагриппа и респираторно-синцитиальных вирусов (RSV), предоставленные Институтом вирусологии Китайской академии профилактической медицины. II. Штаммы вирусов Коксаки B3 (CVB3), предоставленные Уханьским институтом вирусологии Китайской академии наук. III. Штаммы вирусов Коксаки A16 (CoxA16), штаммы энтеровирусов EV71, предоставленные Сендайской государственной больницей (Япония). IV. аденовирус (AdV), предоставленный Институтом педиатрии Первой больницы Медицинского колледжа им. Нормана Бетьюна Цзилиньского университета (ранее - бывший Медицинский университет им. Нормана Бетьюна). V. вирус простого герпеса типа I (HSV-1), предоставленный Государственными институтами по контролю качества медикаментов и продуктов питания Китая.
(4) Основное оборудование и реагенты
Боксы биологической безопасности BHC-1300ⅡA/B3, AIRTECH; CO2-инкубаторы MCO-18AIC, SANYO; инвертационные микроскопы CKX41, OLYMPUS; весы аналитические электронные AR1140/C, ОHAUS; культуральные среды DMEM, HyClone; эмбриональная телячья сыворотка HyClone; трипсин производства Gibco; тиазоловый синий (MTT) производства Sigma; диметилсульфоксид (ДМСО) производства Tianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd.
1.2. Методика анализа
(1) Подготовка клеток
Проводили субкультивирование клеток Vero в течение 1-2 суток, чтобы они образовали пласт и имели четкие границы; проводили обработку трипсином под контролем с помощью микроскопа (при большой глубине изображаемого пространства и высокой оптической силе); когда на поверхности клеток возникают ямки, как от укола иглой, гидролизующий раствор полностью отсасывают; клетки смывают несколькими миллилитрами культуральной среды, подсчитывают, разводят до концентрации 5×107 клеток в 1 л средой DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, вносят в лунки 96-луночного культурального планшета и оставляют расти, чтобы образовался один клеточный слой.
(2) Определение токсичности испытываемых агентов
Тест на цитотоксичность. Испытываемый агент растворяли в поддерживающей культуральной среде (среда DMEM, содержащая 2% эмбриональной телячьей сыворотки) в концентрациях, указанных в таблице 1-1, и определяли цитотоксичность полученных образцов
Таблица 1-1. Концентрации (г/л) испытываемых агентов при определении цитотоксичности
| Градиент концентра- ции Агент |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Соединение I | 5 | 2,5 | 1,25 | 0,625 | 0,3125 | 0,15625 | 0,078125 | 0,039063 |
| Coединение II | 5 | 2,5 | 1,25 | 0,625 | 0,3125 | 0,15625 | 0,078125 | 0,039063 |
| Coединение III | 5 | 2,5 | 1,25 | 0,625 | 0,3125 | 0,15625 | 0,078125 | 0,039063 |
| Рибавирин | 5 | 2,5 | 1,25 | 0,625 | 0,3125 | 0,15625 | 0,078125 | 0,039063 |
| Оселтамивира фосфат | 2 | 1 | 0,5 | 0,25 | 0,125 | 0,0625 | 0,03125 | 0,015625 |
| Филлигенин | 5 | 2,5 | 1,25 | 0,625 | 0,3125 | 0,15625 | 0,078125 | 0,039063 |
Каждый из испытываемых агентов в той или иной концентрации из указанных в таблице 1-1 наносили на слой клеток Vero так, чтобы в каждую лунку попало 0,2 мл испытываемого образца (данной концентрации) и каждый образец был нанесен в 6 лунок; кроме того, в шести лунках был «нормальный» контроль (без испытываемых агентов) и в шести лунках - «пустая» проба (культуральная среда). Культивировали в инкубаторе в атмосфере, содержавшей 5% CO2, при температуре 37°C. Каждый день с помощью инвертационного микроскопа оценивали цитопатический эффект (в экспериментах in vitro имеющиеся в клетках вирусы гибнут в процессе культивирования и пересева; наблюдаемые под микроскопом в течение некоторого времени округление клеток, их отслаивание клеток от стенок емкости и гибель называются цитопатическим эффектом (CPE). Цитопатический эффект - проявление дегенерации клеток в культуре, зараженной вирусом; этот феномен можно использовать для оценки количества вирусных частиц). Величину СРЕ регистрировали. Через 72 часа прибавляли в лунки планшета краситель тиазоловый синий (3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2-H-тетразолия бромид; МТТ) в количестве по 20 мкл (концентрация 5 мг/мл) и инкубировали непрерывно в течение 4 часов. Затем отсасывали из лунок культуральную среду, прибавляли в них по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), перемешивали, покачивая планшет, в течение 5 минут, после чего измеряли оптическую плотность (OD) на длине волны 492 нм. Определяли жизнеспособность клеток, используя статистическую модель пробит-регрессии, с помощью программы SPSS 18,0; рассчитывали максимальную переносимую концентрацию (TC0) и концентрацию, при которой гибнет половина клеток (TC50).
(3) Определение дозы инфекционного агента, при которой поражается 50% клеточной культуры (TCID
50
- 50%-ная тканевая цитопатическая доза) для различных вирусов.
Готовили серию 10-кратных разведений взятых для анализа вирусов, а именно 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 и 10-6, и последовательно наносили полученные разведения вирусов на монослойную культуру клеток Vero в лунках 96-луночного планшета в количестве 100 мкл на лунку; каждое разведение каждого вируса вносили в 6 лунок. Так же, но без вирусов, обрабатывали контрольные клетки. Инкубировали в атмосфере, содержащей 5% CO2 при температуре 37°C в течение 2 часов. После этого удаляли раствор вируса, прибавляли в каждую лунку по 100 мкл поддерживающей среды и культивировали в атмосфере, содержащей 5% CO2 при температуре 37°C. Начиная с третьих суток, отслеживали цитопатический эффект с помощью микроскопа; на 7-8-е сутки производили оценку CPE и отмечали наибольшее разведение, при котором в 50% лунок с инфицированными клетками имели место явные признаки гибели клеток (конечная точка); рассчитывали титр вируса, применяя метод Карбера, по следующей формуле:
LogTCID50=XM+ 
d-d 
, где
TCID50 - доза инфекционного агента, при которой поражается 50% клеточной культуры (50%-ная тканевая цитопатическая доза);
XM - логарифм наибольшего разведения вируса
d - логарифм коэффициента разведения;
Σpi - сумма долей (в процентах) пораженных клеток при разных степенях разведения;
(4) Влияние испытываемых агентов на обусловленный вирусами цитопатический эффект
Из лунок планшета с выращенной монослойной культурой клеток отсасывали культуральную среду и вносили тот или иной вирус в количестве, соответствующем 100TCID50. Держали планшет в инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% CO2, при температуре 37°C в течение 2 часов, после чего прибавляли раствор испытываемого агента в определенной концентрации (в области максимальной переносимой концентрации) по 200 мкл в лунку, отводя на каждую концентрацию по 6 лунок. В качестве положительного контроля вместо соединений по данному изобретению брали рибавирин (препарат для инъекций) и оселтамивира фосфат; параллельно делали «нормальный» контроль (лунки без вирусов и без испытываемых агентов) и контроль «на вирус» (в лунки вносили вирус, но не добавляли испытываемых агентов). Наблюдали, как влияют испытываемые противовирусные агенты на обусловленный вирусами цитопатический эффект. Измеряли оптическую плотность (OD) на длине волны 492 нм, применяя колориметрический метод с использованием МТТ. Рассчитывали эффективность противовирусного действия (ER%) испытываемых агентов и по этим данным сравнивали различные противовирусные агенты методом дисперсионного анализа (ANOVA), используя программу SPSS 18,0.
ER%=(OD среднее значение для группы лунок, обработанных данным агентом - OD среднее значение для группы лунок с контролем «на вирус»)/( OD среднее значение для лунок с «нормальным» контролем - OD среднее значение для группы лунок с контролем «на вирус»)) ×100%
1.3 Результаты
(1)TCID50 для различных вирусов
| Вирус парагриппа | LogTCID50=-2+0,5- |
| Вирус гриппа | LogTCID50=-2+0,5- |
| CVB3 | LogTCID50=-2+0,5- |
| HSV-1 | LogTCID50=-2+0,5- |
| AdV | LogTCID50=-2+0,5- |
| RSV | LogTCID50=-2+0,5- |
| CoxA16 | LogTCID50=-2+0,5- |
| EV71 | LogTCID50=-2+0,5- |
(2) Результаты определения токсичности испытываемых агентов
1) Цитотоксичность испытываемых агентов
Значения максимальной переносимой концентрации (TC0) и концентрации, при которой гибнет половина клеток (TC50), для различных агентов в опытах с клетками Vero представлены в таблице 1-2.
Таблица 1-2. Результаты определения цитотоксичности (г/л)
| Агент Концентр. |
Соединение I | Соединение II | Соединение III | Рибавирин | Оселтамивира фосфат | Филлигенин |
| Максимальная переносимая концентрация | 0,106 | 0,103 | 0,0906 | 0,063 | 0,27 | 0,012 |
| Концентрация, при которой гибнет половина клеток | 0,482 | 0,412 | 0,435 | 1,382 | 0,834 | 0,293 |
2) Результаты изучения защиты испытываемыми агентами от обусловленного вирусами цитопатического эффекта
Данные по эффективности защиты испытываемыми агентами от различных вирусов и результаты однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) см. таблицу 1-3.
Taблица 1-3. Данные по эффективности противовирусной защиты (ER%) испытываемыми агентами
| Агент Вирус |
Coединение I |
Coединение II |
Coединение III |
Рибавирин | Оселтамивира фосфат | Филлигенин |
| Вирус гриппа | 95,81** | 92,74** | 91,35** | 56,44** | 82,19** | 88,17** |
| Вирус парагриппа | 96,24** | 90,13** | 92,22** | 95,13** | 92,11** | 94,06** |
| CoxA16 | 100,00** | 99,25** | 100,00** | 0,72 | 2,94 | 97,03** |
| RSV | 83,21** | 81,14** | 86,18** | 52,15* | 39,22 | 81,41** |
| HSV-I | 91,23** | 93,35** | 96,06** | 64,65** | 63,24** | 85,36** |
| ADV | 21,26* | 20,46* | 22,17* | 0,47 | 12,12 | 14,25* |
| EV71 | 52,15 | 54,32 | 51,64 | 4,03** | 48,65 | 32,27 |
| CVB3 | 10,16 | 11,18 | 9,63 | 12,14 | 1,53 | 2,29 |
Примечание: при сравнении с контролем «на вирус» *P <0,05, **P <0,01; при сравнении с филлигенином #P <0,05, ##P <0,01.
Результаты, представленные в таблице 1-3, показывают, что 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид (соединение I), 9-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид (соединение II) и 33,34-метилендиоксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид (соединение III) характеризуются степенью подавления цитопатического эффекта и эффективностью защиты от вируса гриппа, вируса парагриппа, вируса простого герпеса (HSV-I) и энтеровируса EV71, превышающими 90% и явно отличающимися от контроля «на вирус», причем эти данные статистически значимы; 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид, 9- гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид и
33,34-метилендиоксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид обладают лечебным эффектом в отношении многих вирусов, превышающим таковой филлигенина, рибаверина и оселтамивира фосфата.
Испытание продуктов 2. Определение противовирусного эффекта in vivo
2.1 Материалы
(1) Лабораторные животные
Мыши линии Куньмин (Kunming) с массой тела 18-22 г, половина особей самцы, половина - самки; предоставлены Центром лабораторных животных Даляньского медицинского университета (Китай); номер сертификата качества SCXK (13)2012-0003.
(2) Препараты
1) Соединение I, полученное в воплощении 1 данного изобретения (33- гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид).
2) Рибавирин для инъекций - бесцветная прозрачная жидкость; производство Henan Runhong Pharmaceutical Co., Ltd., серийный номер продукта 1206261, номер официального утверждения препарата Государственным управлением по контролю качества медикаментов и продуктов питания Китая (SFDA) H19993553, концентрация 100 мг/мл. Используется в качестве положительного контроля.
3) Оселтамивира фосфат - предоставлен Государственными институтами по контролю качества медикаментов и продуктов питания Китая (National Institutes for Food and Drug Control), серийный номер продукта 101096-200901, 100 мг/шт. Используется в качестве положительного контроля.
4) Филлигенин - белый порошок; производство Dalian Fusheng Natural Drug Development Co., Ltd.; чистота 99,2% (по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии с детекцией 1) по поглощению в ультрафиолетовой области и 2) с помощью испарительного нефелометрического детектора с применением метода нормализации площадей).
Каждый из указанных агентов растворяли в очищенной воде, фильтровали и расфасовывали для последующего использования при температуре 4°C в качестве детектируемых агентов в данном испытании.
(2) Оборудование для детекции и реагенты
| Название | Модель | Производитель |
| Система для количественной полимеразной цепной реакции | 7300 | ABI |
| Система для полимеразной цепной реакции | ES-60J | Shenyang Longteng Electronic Weighing Instrument Co., Ltd. |
| Весы аналитические электронные | FA1004 | Shenyang Longteng Co., Ltd. |
| CO2-инкубатор | HG303-5 | Nanjing Experimental Instrument Plant |
| Лабораторный ламинар | SW-CJ-IF | Suzhou Antai Technology Co., Ltd. |
| Инвертационный микроскоп | CKX41 | Olympus Instrument |
| Низкотемпературный морозильник (-80°C) | TECАN-5082 | Австралия |
| Шейкер-водяная баня | HZS-H | Harbin Donglian Co., Ltd. |
| Система для ELISA | TECAN A-5082 | Австралия |
| Cпектрофотометр | 7550 type | Япония |
2.2 Методика анализа
(1) Определение полулетальной дозы вирусов гриппа и парагриппа для мышей
Готовили 10-кратные разведения вирусов гриппа и парагриппа в буферном растворе для лизиса клеток, получая растворы с концентрацией вирионов 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 и 10-5. В опыт брали 120 мышей линии Куньмин (Kunming), из них 60 особей заражали вирусом гриппа и 60 особей - вирусом парагриппа. Для этого животных разделили случайным образом на 6 групп и каждой мыши под анестезией этиловым эфиром ввели ингаляционным путем интраназально раствор одного или другого вируса той или иной степени разведения в количестве 0,03 мл; параллельно делали контрольную обработку: вместо суспензии вирусных частиц брали физиологический раствор («пустой» контроль). Подопытных мышей наблюдали ежедневно в течение 14 суток после заражения, отмечая случаи смерти и количество выживших особей; при этом в расчет не включали животных, которые умерли от неспецифических причин в первые 24 часа после заражения. Для каждого раствора вирусных частиц рассчитывали полулетальную дозу (LD50) по методу Карбера, используя формулу LogLD50=XM+ 
d-d 
[где LD50 - полулетальная доза, XM - логарифм наибольшего испытанного разведения вируса, d - логарифм коэффициента разведения, Σpi - сумма долей (в процентах) погибших особей к общему числу зараженных особей при различных разведениях вируса].
(2) Изучение эффекта 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронида при пневмонии, вызванной инфекцией вирусом гриппа и вирусом парагриппа
1) Лабораторные животные и экспериментальные группы
Для двух испытаний были взяты 960 мышей линии Куньмин в возрасте 4 недель. Для каждого из этих двух испытаний брали 480 особей и разделяли их случайным образом на 48 групп по 10 животных в каждой. В первом испытании определяли влияние 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронида на легочный показатель и на степень его снижения у мышей, зараженных вирусом гриппа; каждый опыт повторяли три раза, при этом всякий раз брали 80 особей. Во втором испытании определяли влияние 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронида на титр вируса в суспензии легочной ткани по реакции агглютинации; каждый опыт повторяли три раза и всякий раз брали 80 особей.
2) Метод заражения
В химический стакан на 200-300 мл помещали тампон из гигроскопической ваты, наливали такое количество этилового эфира, которое достаточно для смачивания тампона, переворачивали стакан вверх дном и сажали под него мышь. Когда животное после некоторого периода возбуждения явно ослабевало, его переворачивали на спину и в носовую полость вводили ингаляционным путем раствор вируса (гриппа или парагриппа) в количестве по 0,03 мл в каждую ноздрю; параллельно делали контрольную обработку, для которой брали вместо суспензии вирусных частиц физиологический раствор («нормальный» контроль).
3) Метод введения и дозировка испытываемых агентов
Подопытным животным перед вирусным заражением 1 раз в сутки на протяжении 5 суток (последний раз - за сутки до заражения) вводили интрагастрально 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид; в качестве положительного контроля так же вводили рибавирин и оселтамивира фосфат. Концентрацию 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронида для введения брали высокую (10,0 мг на 1 кг массы тела), среднюю (5,0 мг/кг) и низкую (2,5 мг/кг); рибавирина - 58,5 мг/кг; оселтамивира фосфата - 19,5 мг/кг; филлигенина - 13,0 мг/кг. Контрольным животным (контроль «на вирус») вводили таким же образом и в таком же количестве физиологический раствор.
4) Наблюдаемые показатели
I. Определение легочного показателя
Подопытным мышам на пятые сутки после введения испытываемых агентов не давали есть и пить в течение 8 часов, после чего взвешивали, извлекали глаза, выпускали кровь и умерщвляли. Вскрывали грудную клетку, извлекали легкие целиком, промывали два раза физиологическим раствором, обсушивали поверхность органа фильтровальной бумагой, взвешивали легкие на электронных весах и рассчитывали легочный показатель и степень его снижения по следующим формулам:
Легочный показатель = (масса легких/масса тела) х 100%;
Степень снижения легочного показателя = (среднее значение легочного показателя у особей с выраженной инфекцией - среднее значение легочного показателя у особей, получавших испытываемый агент)/ среднее значение легочного показателя у особей с выраженной инфекцией х 100%
II. Определение титра вируса в суспензии легочной ткани по реакции гемагглютинации
На пятые сутки после описанной выше обработки у мышей различных групп извлекали легкие, измельчали в гомогенизаторе при низкой температуре, разбавляли гомогенизат легочной ткани физиологическим раствором до состояния суспензии концентрацией 10% и центрифугировали ее. Из полученного супернатанта готовили серию двукратных разведений, которые вносили по 0,2 мл в лунки титровального планшета, прибавляли в каждую лунку 0,2 мл 1%-ной суспензии куриных эритроцитов, перемешивали до однородности и оставляли при комнатной температуре на 30 минут, после чего наблюдали гемагглютинацию и определяли титр, приняв за конечную точку время агглютинации эритроцитов (++) и за титр - степень разведения суспензии,
2.3. Результаты и их анализ
(1) Результаты определения полулетальной дозы вирусов гриппа и парагриппа у мышей
Мышам линии Куньмин вводили ингаляционным путем в носовую полость по 30 мкл разведений вируса гриппа и вируса парагриппа различных концентраций. На третьи сутки после заражения в трех группах подопытных животных (концентрация вируса 10-1, 10-2 и 10-3) наблюдались следующие симптомы заболевания (в той или иной степени выраженности): пиломоторный рефлекс (шерсть «дыбом»), дрожь, пониженный аппетит и др.; на пятые сутки мыши шатались при ходьбе; на шестые сутки в группе особей, получивших разведение с наибольшей концентрацией вируса, начались случаи смерти, а в других группах животные стали умирать начиная с седьмого дня после заражения, Наблюдение вели 14 суток, после чего подсчитали, сколько мышей погибло в каждой группе; результаты представлены в таблицах 1-4 и 1-5, Для вируса гриппа полулетальная доза (LD50) составила разведение 10-2,9, для вируса парагриппа - 10-2,5.
Таблица 1-4. Результаты определения полулетальной дозы вируса гриппа
| Группы (разведение вируса гриппа) |
Умерли | Выжили | Суммарная смертность |
| 10-1 | 9 | 1 | 90% |
| 10-2 | 7 | 3 | 70% |
| 10-3 | 4 | 6 | 40% |
| 10-4 | 3 | 7 | 30% |
| 10-5 | 1 | 9 | 10% |
| Контроль (обработка без вирусов) |
0 | 10 | 0% |
LD50 рассчитывали по методу Карбера. Для вируса гриппа расчет следующий:
LogLD
50
=XM+
d-d
=-1+0,5-(80%+60%+40%+20%+0%+0%)=-2,9
Taблица 1-5. Результаты определения полулетальной дозы вируса парагриппа
| Группы (разведение вируса парагриппа) | Умерли | Выжили | Суммарная смертность |
| 10-1 | 8 | 2 | 80% |
| 10-2 | 6 | 4 | 60% |
| 10-3 | 4 | 6 | 40% |
| 10-4 | 2 | 8 | 20% |
| 10-5 | 0 | 10 | 0% |
| Контроль (обработка без вирусов) |
0 | 10 | 0% |
LD50 рассчитывали по методу Карбера. Для вируса парагриппа расчет следующий:
LogLD50=XM+ d-d =-1+0,5-(90%+70%+40%+30%+10%+0%)=-2,5
(2) Результаты влияния 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронида на развитие пневмонии, обусловленной инфекцией вируса гриппа и парагриппа,
I. Определение легочного показателя
После заражения мышей вирусами гриппа и парагриппа определяли средний легочный показатель, и это продемонстрировало, что по сравнению с группами особей, в которых этим инфекциям давали развиваться беспрепятственно, у животных, получавших 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид в суточной дозе 2,25-10,0 мг на 1 кг массы тела, легочный показатель был явно ниже; лечебный эффект в группах мышей с инфекцией гриппа или парагриппа, получавших 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид в высокой дозе, превышал таковой в группе особей, получавших филлигенин (P<0,05). Полученные результаты представлены в таблицах 1-6 и 1-7.
Taблица 1-6. Влияние соединения I на легочный показатель и на степень его снижения у мышей, зараженных вирусом гриппа (n=3)
| Группа (агент) | Доза агента (мг/кг/сут) |
Легочный показатель (  |
Снижение легочного показателя (%) | P |
| «Нормальный» контроль | 0 | 1,273±0,101 | -- | |
| Контроль «на вирус» |
0 | 1,475±0,026 | -- | |
| Рибавирин | 58,5 | 1,279±0,056 | 13,84 | *<0,05 |
| Оселтамивира фосфат | 19,5 | 1,176±0,045 | 19,76 | *<0,01 |
| Филлигенин | 13,0 | 1,208±0,025 | 11,67 | *<0,05 |
| Coединение I | 10,0 (высокая) | 1,145±0,037 | 22,82 | **<0,01; #<0,05 |
| 5,0 (средняя) | 1,187±0,028 | 20,03 | **<0,01; #<0,05 | |
| 2,25(низкая) | 1,225±0,034 | 17,85 | *<0,05; >0,05 |
При сравнении с контролем «на вирус» *P<0,05, **P0,01; при сравнении с группой мышей, получавших филлигенин, #P<0,05, ##P <0,01,
Taблица 1-7. Влияние соединения I на легочный показатель и на степень его снижения у мышей, зараженных вирусом парагриппа (n=3)
| Группа (агент) | Доза агента (мг/кг/сут) |
Легочный показатель ( |
Снижение легочного показателя (%) | P |
| «Нормальный» контроль | 0 | 1,303±0,037 | -- | |
| Контроль «на вирус» |
0 | 1,585±0,056 | -- | |
| Рибавирин | 58,5 | 1,337±0,056 | 15,68 | *<0,01 |
| Оселтамивира фосфат | 19,5 | 1,241±0,046 | 21,83 | *<0,01 |
| Филлигенин | 13,0 | 1,349±0,046 | 14,56 | *<0,01 |
| Coединение I | 13,0 (высокая) | 1,239±0,037 | 22,26 | *<0,01; #<0,05 |
| 6,5 (средняя) | 1,277±0,054 | 19,73 | *<0,01; #<0,05 | |
| 3,25(низкая) | 1,318±0,028 | 16,94 | *<0,05; >0,05 |
При сравнении с контролем «на вирус» *P<0,05, **P0,01; при сравнении с группой мышей, получавших филлигенин, #P<0,05, ##P <0,01.
II. Определение титра вируса в суспензии легочной ткани по реакции гемагглютинации
В группах мышей, у которых развивались инфекции вирусами гриппа и парагриппа, титр вируса в легочной ткани по реакции гемагглютинации (InX) после заражения составлял 31,64 и 32,06 соответственно. После того, как животным на протяжении 5 суток давали 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид в различных концентрациях, титр вируса в легочной ткани по реакции гемагглютинации несколько снижался; по сравнению с группой особей, в которой вирусная инфекция развивалась беспрепятственно, разница явная (P<0,01). Титры вируса гриппа и вируса парагриппа в группах мышей, получавших 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид в средней и высокой дозах явно ниже, чем в группе животных, у которых инфекция развивалась беспрепятственно, причем степень снижения титра явно выше, чем в группе мышей, получавших филлигенин (P<0,05; p<0,01). Эти результаты представлены в таблицах 1-8 и 1-9.
Taблица 1-8. Влияние соединения I на титр вируса в суспензии легочной ткани по реакции гемагглютинации у мышей, зараженных вирусом гриппа (n=3)
| Группа (агент) | Доза агента (мг/кг/сут) |
Титр (InX) | Степень снижения (%) | P |
| «Нормальный» контроль | 0 | 0 | ||
| Контроль «на вирус» |
0 | 32,06±1,095 | ||
| Рибавирин | 58,5 | 21,87±1,050 | 32,35 | **<0,01 |
| Оселтамивира фосфат | 19,5 | 20,47±1,104 | 32,26 | **<0,01 |
| Филлигенин | 13,0 | 21,15±1,024 | 29,15 | **<0,01 |
| Coединение I | 10,0 (высокая) | 19,24±0,513 | 40,28 | **<0,01; ##<0,01 |
| 5,0 (средняя) | 20,37±0,285 | 36,32 | **<0,01; #<0,05 | |
| 2,25(низкая) | 22,16±1,270 | 31,26 | **<0,01; >0,05 |
При сравнении с контролем «на вирус» *P<0,05, **P<0,01; при сравнении с группой мышей, получавших филлигенин, #P<0,05, ##P <0,01.
Taблица 1-9. Влияние соединения I на титр вируса в суспензии легочной ткани по реакции гемагглютинации у мышей, зараженных вирусом парагриппа (n=3)
| Группа (агент) | Доза агента (мг/кг/сут) |
Титр (InX) | Степень снижения (%) | P |
| «Нормальный» контроль | 0 | 0 | ||
| Контроль «на вирус» |
0 | 33,17±1,190 | ||
| Рибавирин | 58,5 | 24,32±1,123 | 23,25 | *<0,01 |
| Оселтамивира фосфат | 19,5 | 23,24±1,242 | 31,14 | *<0,01 |
| Филлигенин | 13,0 | 23,63±1,156 | 27,75 | *<0,01 |
| Coединение I | 10,0 (высокая) | 19,68±0,638 | 38,36 | *<0,01; #<0,01 |
| 5,0 (средняя) | 20,47±0,583 | 36,32 | *<0,01; #<0,05 | |
| 2,25(низкая) | 2,62±0,553 | 33,61 | *<0,01 |
При сравнении с контролем «на вирус» *P<0,05, **P<0,01; при сравнении с группой мышей, получавших филлигенин, #P<0,05, ##P <0,01.
2.4 Заключение
Результаты экспериментов in vivo, показали, что 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид явно подавляет вирусы гриппа и парагриппа и развитие вирусной пневмонии у мышей, вызванной введением вирусов в дозировке от 2,25 мг на 1 кг массы тела в сутки до 10 мг/кг/сут. При этом наблюдается выраженный эффект снижения легочного показателя и титров этих вирусов по реакции гемагглютинации, а также ослабления патологических изменений в легких по сравнению с контролем - мышами, у которых указанные инфекции развивались беспрепятственно. Лечебный эффект в группах мышей, получавших 33-гидроксифиллигенин-8-O-β-D-глюкуронид в средней и высокой дозах, явно превышал таковой филлигенина (*P<0,05 или **P<0,01), и в меньшей степени - рибавирина и оселтамивира фосфата.
Соединения II и III так же, как соединение I, обладали выраженным подавляющим эффектом в отношении вирусов гриппа и парагриппа и вызываемой ими пневмонии у мышей, снижая легочный показатель и титр вируса (по реакции гемагглютинации), а также ослабляя патологические изменения в легких; при сравнении с контролем - мышами, у которых вирусная инфекция развивалась без воздействия указанными соединениями, разница очевидна.
Claims (18)
1. Производное филлигенина и глюкуроновой кислоты, характеризующееся молекулярной структурой общей формулы (I)
где R1=CnH2n+1, R2=CnH2n+1, R3=H или R1-R2=-CH2-, R3=CnH2n+1; n=1-30.
2. Производное по п. 1, в котором n равно 1.
3. Способ получения производного филлигенина и глюкуроновой кислоты, характеризующийся тем, что он включает последовательно следующие стадии:
1) смешивание листьев форсайтии с экстрагирующим растворителем, представляющим собой воду, 2-3-кратное нагревание с кипячением и экстракцией, сбор и объединение экстрагирующих растворов, в результате чего получают водный экстракт форсайтии;
2) разделение водного экстракта форсайтии на колонке с макропористой смолой и элюирование водой в качестве элюирующего растворителя; элюирование раствором этилового спирта с массовой концентрацией 3-50% в качестве элюирующего растворителя и, наконец, элюирование абсолютным этиловым спиртом в качестве элюирующего растворителя; сбор абсолютного этилового спирта, использованного в качестве элюирующего растворителя, в результате чего получают элюат из форсайтии на колонке с макропористой смолой; причем макропористая смола выбрана из следующих продуктов: X-5, AB-8, NK-2, NKA-2, NK-9, D3520, D101 и WLD;
3) проведение хроматографии элюата из форсайтии, полученного на колонке с макропористой смолой, на колонке с силикагелем, фракционный сбор элюата и его высушивание, в результате чего получают целевой продукт;
где производное филлигенина и глюкуроновой кислоты характеризуется молекулярной структурой общей формулы (I)
где R1=CnH2n+1, R2=CnH2n+1, R3=H или R1-R2=-CH2-, R3=CnH2n+1; n=1.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что на этапе 1) при каждом нагревании с кипячением массовое соотношение листьев форсайтии и экстрагирующего растворителя, представляющего собой воду, составляет 1:(6-10).
5. Способ по п. 3 или 4, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этапы концентрирования водного экстракта форсайтии на этапе 1), получения концентрированного раствора из форсайтии и проведения разделения на колонке с макропористой смолой.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что отношение объема концентрированного раствора из форсайтии, полученного путем концентрирования, к массе листьев форсайтии составляет (1-5):1.
7. Способ по п. 3 или 4, отличающийся тем, что на этапе 3) наполнителем колонки для хроматографии с использованием силикагеля служит силикагель C18 для хроматографии на обращенной фазе; хроматографическая колонка имеет следующие параметры: внутренний диаметр 10-100 нм, длина 10-300 мм; размер частиц наполнителя 5-10 мкм; элюирование изократическое или градиентное.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что при хроматографии на колонке с силикагелем подвижной фазой является смешанный раствор – метиловый спирт с водой, в котором объемное отношение метилового спирта и воды составляет 8:2-10:1.
9. Противовирусное средство, содержащее производное филлигенина и глюкуроновой кислоты по п. 1 в качестве активного ингредиента.
10. Применение производного филлигенина и глюкуроновой кислоты по п. 1 в приготовлении лекарственных средств для предотвращения и/или лечения инфекции вирусами гриппа.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510164294.6 | 2015-04-08 | ||
| CN201510164294 | 2015-04-08 | ||
| PCT/CN2016/078688 WO2016161951A1 (zh) | 2015-04-08 | 2016-04-07 | 一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物，制备方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2684100C1 true RU2684100C1 (ru) | 2019-04-04 |
Family
ID=54160567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017138476A RU2684100C1 (ru) | 2015-04-08 | 2016-04-07 | Производное филлигенина и глюкуроновой кислоты, способ его получения и его применение |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10407455B2 (ru) |
| EP (1) | EP3281945B1 (ru) |
| JP (1) | JP6505250B2 (ru) |
| KR (1) | KR102104234B1 (ru) |
| CN (1) | CN104945452B (ru) |
| AU (1) | AU2016245659B2 (ru) |
| CA (1) | CA2982200C (ru) |
| RU (1) | RU2684100C1 (ru) |
| WO (1) | WO2016161951A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104945452B (zh) * | 2015-04-08 | 2017-12-05 | 富力 | 一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的制备方法及其应用 |
| CN105796861B (zh) * | 2015-04-23 | 2020-02-11 | 富力 | 连翘苷衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物在制备提高免疫功能的药物中的应用 |
| CN106063788B (zh) * | 2015-04-23 | 2020-02-11 | 富力 | 连翘苷、连翘苷衍生物、连翘苷与连翘脂素组合物在制备缓解或/和治疗呕吐药物中的应用 |
| CN114213473B (zh) * | 2021-10-19 | 2023-04-25 | 辽宁中医药大学 | 马齿苋中三种生物碱类化合物及其提取分离方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520745C2 (ru) * | 2009-06-30 | 2014-06-27 | Хэбэй Илин Медсин Рисёч Инститьют Ко., Лтд. | Лекарственная композиция для лечения бронхита и способ ее получения |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101618075A (zh) * | 2008-07-03 | 2010-01-06 | 河南大学 | 中药连翘降血糖有效部位及其提取方法和应用 |
| AU2014100709A4 (en) * | 2014-01-03 | 2014-07-24 | Macau University Of Science And Technology | In Vitro Anti-influenza Virus Activities of a New Lignan Glycoside from the Latex of Calotropis gigantea |
| CN106188176B (zh) * | 2014-12-26 | 2018-12-21 | 富力 | 连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物、制备方法及其应用 |
| CN104945452B (zh) * | 2015-04-08 | 2017-12-05 | 富力 | 一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的制备方法及其应用 |
-
2015
- 2015-06-11 CN CN201510319303.4A patent/CN104945452B/zh active Active
-
2016
- 2016-04-07 JP JP2017553114A patent/JP6505250B2/ja active Active
- 2016-04-07 EP EP16776126.1A patent/EP3281945B1/en active Active
- 2016-04-07 KR KR1020177032383A patent/KR102104234B1/ko active IP Right Grant
- 2016-04-07 CA CA2982200A patent/CA2982200C/en active Active
- 2016-04-07 AU AU2016245659A patent/AU2016245659B2/en not_active Ceased
- 2016-04-07 WO PCT/CN2016/078688 patent/WO2016161951A1/zh active Application Filing
- 2016-04-07 RU RU2017138476A patent/RU2684100C1/ru active
- 2016-04-07 US US15/565,249 patent/US10407455B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520745C2 (ru) * | 2009-06-30 | 2014-06-27 | Хэбэй Илин Медсин Рисёч Инститьют Ко., Лтд. | Лекарственная композиция для лечения бронхита и способ ее получения |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Duan Linjian et al. Chinese General Practice, 2012, vol. 15, N6, с. 2082-2084. * |
| Soler A. et al. Food Chemistry, 2010, 119, N2, 703-714. FAN Hongyu et al. Liaoning chemical industry, 2014, vol. 43, N3, с. 241-243. * |
| Soler A. et al. Food Chemistry, 2010, 119, N2, 703-714. FAN Hongyu et al. Liaoning chemical industry, 2014, vol. 43, N3, с. 241-243. Duan Linjian et al. Chinese General Practice, 2012, vol. 15, N6, с. 2082-2084. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2016245659A1 (en) | 2017-11-23 |
| EP3281945A4 (en) | 2019-01-23 |
| CN104945452B (zh) | 2017-12-05 |
| EP3281945B1 (en) | 2022-08-17 |
| KR102104234B1 (ko) | 2020-04-24 |
| AU2016245659B2 (en) | 2019-02-21 |
| JP6505250B2 (ja) | 2019-04-24 |
| CN104945452A (zh) | 2015-09-30 |
| EP3281945A1 (en) | 2018-02-14 |
| CA2982200A1 (en) | 2016-10-13 |
| US10407455B2 (en) | 2019-09-10 |
| CA2982200C (en) | 2019-08-20 |
| US20180057523A1 (en) | 2018-03-01 |
| WO2016161951A1 (zh) | 2016-10-13 |
| JP2018512429A (ja) | 2018-05-17 |
| KR20170140260A (ko) | 2017-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yarmolinsky et al. | Potent antiviral flavone glycosides from Ficus benjamina leaves | |
| Li et al. | Antiviral activity and mode of action of caffeoylquinic acids from Schefflera heptaphylla (L.) Frodin | |
| RU2684100C1 (ru) | Производное филлигенина и глюкуроновой кислоты, способ его получения и его применение | |
| KR101317318B1 (ko) | 신종인플루엔자, 조류인플루엔자, 일반 및 독감감기, ｓａｒｓ 바이러스 억제 효능을 갖는 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 | |
| WO2017133468A1 (zh) | 白头翁皂苷类化合物作为ev71病毒抑制剂的用途 | |
| Liu et al. | An in vivo and in vitro assessment of the anti-inflammatory, antinociceptive, and immunomodulatory activities of Clematis terniflora DC. extract, participation of aurantiamide acetate | |
| CN101279964A (zh) | 愈创木烷型倍半萜、其制备方法及其医药用途 | |
| US9963461B2 (en) | Phillygenin ibuprofen ester, preparation method therefor, and application thereof | |
| CN114558020B (zh) | 一种天然抗病毒液及其制备方法和应用 | |
| CN113440563B (zh) | 一种复方鱼腥草喷雾剂及其制备方法和应用 | |
| De Natale et al. | Phenanthrene dimers: promising source of biologically active molecules | |
| CN107737201B (zh) | 三叶青提取物抗病毒作用应用 | |
| TW200826954A (en) | Herbal extract with anti-influenza virus activity and preparation of same | |
| CN114948936B (zh) | 一种天然抗病毒雾化液及其制备方法和应用 | |
| WO2016101733A1 (zh) | 连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物、制备方法及其应用 | |
| Jabareen et al. | Effect of extracts of passiflora edulis leaves on herpes viruses infection | |
| CN105218495B (zh) | 一种丹参水溶性成分新化合物、制备方法及其应用 | |
| CN1261143C (zh) | 抗流感病毒的药物有效部位及活性成分的分离制备方法 | |
| CN103113196B (zh) | 一种连钱草酚及其制备方法和应用 | |
| KR20180052258A (ko) | 감태 추출물 또는 이로부터 분리한 플로로탄닌계 화합물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| CN111202732A (zh) | Caulilexin C在制备预防或治疗甲型流感的药物中的应用 | |
| CN105331653B (zh) | 一种制备抗病毒药物连翘脂素的方法 | |
| KR100459088B1 (ko) | 간세포 보호활성을 나타내는 비자나무의 수피로부터분리한 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 및 이를유효성분으로 함유하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용조성물 | |
| Kawazu et al. | Isolation of the cytotoxic constituent deoxypodophyllotoxin from the leaves of Juniperus chinensis | |
| CN113789224A (zh) | 金毛耳草挥发油的制备及其应用 |