CN111202732A

CN111202732A - Caulilexin C在制备预防或治疗甲型流感的药物中的应用

Info

Publication number: CN111202732A
Application number: CN202010100318.2A
Authority: CN
Inventors: 李菁; 潘锡平; 钟南山
Original assignee: Guangzhou Anjie Pharmaceutical Co ltd; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2020-02-18
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2020-05-29
Anticipated expiration: 2040-02-18
Also published as: CN111202732B

Abstract

本发明提供了Caulilexin C在制备用于预防或治疗甲型流感的药物中的新用途。本发明还提供一种用于预防或治疗甲型流感的药物，该药物的活性成分包括Caulilexin C。本发明的Caulilexin C及含有Caulilexin C的药物能够有效预防或治疗甲型流感，能够明显抑制甲型流感病毒H1N1诱导的宿主细胞凋亡损伤并呈剂量依赖关系。

Description

Caulilexin C在制备预防或治疗甲型流感的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种吲哚类化合物的新活性，更具体地，涉及Caulilexin C在制备预防或治疗甲型流感药物中的新用途。

背景技术

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病，具有高度传染性。全球每年流感发病率在成人中约为5％-10％，在儿童中约为20％-30％，在高危人群如婴幼儿、老年人或慢性病患者中易造成住院和死亡。全世界每年流感造成约300万至500万例严重疾病和约25万至50万例死亡，严重威胁人类的生命健康，并造成巨大经济损失。人流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感对人类威胁最大，H1N1是最主要的季节性甲型流感病毒。预防及控制流感传播的最有效方法是接种疫苗，但是由于流感病毒的抗原变异能力强，疫苗的生产仅针对已流行流感亚型毒株，对于抗原漂移和变异产生的新型流感病毒感染不产生机体的保护作用。因此，流感疫苗预防流感具有一定的滞后性，保护率也有限。目前用于流感治疗的化学药物主要有两类：金刚烷胺类(金刚烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)，通常需在疾病早期(症状出现后48小时内)给药，且由于作用靶点单一已出现耐药，极大影响了疗效，另外，临床上也陆续发现它们有一些比较严重的不良反应。因此，临床亟需研发新的抗流感药物。

Caulilexin C(1-甲氧基-3-吲哚乙腈，Cas号：30536-48-2)是一种已知的植物抗毒素，存在于一些十字花科植物如花椰菜、卷心菜、板蓝根中，具有抗真菌活性，亦可通过人工合成方法获得(中草药，2006,37(9):1306～1309；Phytochemistry,2006,67:1503～1509)。然而，现有技术中尚未报道关于Caulilexin C在抗流感或抗病毒方面的作用。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效预防和/或治疗流感(特别是甲型流感)的技术方案。

为了实现以上发明目的，本发明提供了Caulilexin C在制备预防和/或治疗甲型流感药物中的应用。

优选地，本发明所述的甲型流感是指由甲型流感病毒引起的流行性感冒，包括但不限于由甲型流感病毒H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8等引起的流行性感冒。

所述Caulilexin C化学名为1-甲氧基-3-吲哚乙腈，具有如下结构式：

该用于预防和/或治疗甲型流感的药物除了Caulilexin C之外，还可进一步含有药学上可接受的载体和/或辅料。该药物被制成药学上可接受的剂型。

为进一步提高药效，优选地，本发明所述的Caulilexin C还可以是其可药用盐形式。

本发明还提供了一种用于预防或治疗甲型流感的药物，该药物的活性成分包括Caulilexin C或其可药用盐。Caulilexin C或其可药用盐可以单独或与其他药用许可的物质组合。

该药物可进一步包括药学上可接受的载体或辅料，并且根据需要可制备成药学上可接受的剂型，剂型例如为片剂、硬胶囊、软胶囊、颗粒剂、滴丸等各种口服剂型。所需的药学上可接受的载体或辅料，具体如药学上常用的稀释剂和吸收剂，例如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；药学上常用的湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；药学上常用的崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。关于药学上可接受的载体或辅料不再一一例举，本领域普通技术人员可根据所掌握的公知常识进行具体选择。

与现有药物比较，利用Caulilexin C制备抗流感新型药物具备以下突出优势：

(1)Caulilexin C与现有抗流感药物的结构类型完全不同，其作用靶点和机制独具特色，可有效应对现有药物存在的耐药性问题；

(2)Caulilexin C存在于十字花科的一些可食用蔬菜中，是药食同源植物成分，经人类长期食用业已证明，该成分对人体安全性良好，无明显毒副作用；

(3)Caulilexin C是植物单体成分，结构明确，化学性质稳定，相对于板蓝根系列传统中药制剂，该成分制剂更易于控制质量，有效性和安全性更有保障，剂量更小，服用也更方便；

(4)Caulilexin C结构简单，无手性碳，可通过人工合成方法实现低成本批量制备，满足制剂大生产需要。此外，本品还可以单独或与其它药用许可的物质组合，方便地制成片剂、硬胶囊、软胶囊、颗粒剂、滴丸等各种口服剂型。

附图说明

图1是Caulilexin C的质谱图。

图2是Caulilexin C的核磁共振氢谱图。

图3是Caulilexin C的核磁共振碳谱图。

图4是Caulilexin C的HPLC(高效液相色谱)图谱。

图5示出了Caulilexin C对MDCK细胞的毒性。

图6表明了Caulilexin C对流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)的抑制作用(CPE法)。

图7表明了Caulilexin C对流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)的抑制作用(空斑法)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。若未特别说明，实施例中所用仪器或试剂均为本领域常规试剂或仪器，是可通过市场购买获得的常规产品。若未特别说明，文中涉及的具体实验操作均为本领域普通技术人员根据其掌握的公知常识或常规技术手段所能理解或知晓的，对此不再一一赘述。

实施例1：Caulilexin C的分离纯化和结构鉴定

取板蓝根50kg,切段，用10倍量85％乙醇回流提取(3×1.5h)，回收溶剂，得浸膏6.1kg，再加3倍量水混悬,用醋酸乙酯萃取三次，回收溶剂后得到醋酸乙酯部分(525g)。取醋酸乙酯部分用硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇(100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、60∶40、0∶100)梯度洗脱，得11个组分，其中Fr.2(86g)继续用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮(100∶0、90∶10、80∶20、60∶40、0∶100)梯度洗脱后得10个组分，取其中的Fr.2-3再上硅胶柱分离，用氯仿洗脱，得单体化合物(1.6g)，外观呈黄色油状。

如图1至图3所示，该化合物经波谱鉴定，结果如下：

ESI-TOF-MS m/z:187.0891[M+H]⁺(计算值C₁₁H₁₁N₂O,187.0866)。¹H-NMR(CD₃OD,400MHz)δppm:7.60(1H,d,J＝8.0Hz,H-8),7.44(2H,m,H-2,5),7.27(1H,t,J＝7.6Hz,H-7),7.14(1H,t,J＝7.6Hz,H-6),4.07(3H,s,2-OCH₃),3.93(2H,s,H-10)。¹³C-NMR(CD₃OD,100MHz)δppm:133.79(C-9),1124.08(C-7),123.94(C-4),123.15(C-5),121.27(C-6),119.58(C-11),119.50(C-2),109.46(C-8),102.10(C-3),66.47(OCH₃),14.03(C-10)。以上数据与文献报道一致[中国中药杂志.2018,43(10)∶2091-2096],鉴定为Caulilexin C。

实施例2：Caulilexin C片剂的制备

取Caulilexin C 80g，加入药用淀粉300g、糊精30g、微晶纤维素50g、羧甲基纤维素钠5g，混合，制粒，再加入10g硬脂酸镁，混匀，压制成1000片，即得。每片含CaulilexinC80mg。

实施例3：细胞病变抑制法(CPE)试验Caulilexin C对流感病毒的抑制作用

1、材料：细胞和病毒

MDCK细胞购自中国科学院上海细胞库；流感病毒A/PR/8/34(H1N1)购自ATCC，以Reed-Muench法测定其半数感染量(TCID₅₀/100μL)作为病毒滴度。

2、试剂：

DMSO购自Sigma公司；DMEM/DF12(1：1)培养基购自Gibco公司；PBS购自Gibco公司；羧酸奥司他韦购自Med Chem Express LLC；MTT购自Genebase；病毒培养液(含终浓度1.5μg/mL的TPCK胰酶)：100mL DMEM/DF12(1：1)培养液+150μL的1mg/mLTPCK胰酶，即配即用；Caulilexin C从板蓝根中分离得到，HPLC纯度为98％(图4)，用DMSO溶解配成母液，置4℃冰箱保存。

3、药物毒性实验(MTT法)

按每孔约2.5×10⁴MDCK细胞接种到96孔板，24h后待细胞长成单层，弃去培养液，加入倍比稀释的药物(1200μg/mL-9.4μg/mL)100μL/孔，空白对照和正常细胞对照孔加入100μL/孔DMEM/F12，37℃，5％CO₂继续培养36-48小时，每孔加MTT溶液(0.5mg/mL)，置37℃、5％CO₂温箱中继续孵育4小时。吸弃培养上清液，每孔加100μL二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，计算细胞存活率，并用Reed-Muench法计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(TC₅₀)。

4、Caulilexin C对流感病毒的抑制作用

将96孔板单层MDCK细胞用PBS洗1次，加入100个TCID₅₀病毒液，100μL/孔，37℃孵育2小时；弃去病毒孵育液，药物干预组加入用含终浓度1.5μg/mL的TPCK胰酶的病毒培养液倍比梯度稀释的Caulilexin C(128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml)，37℃培养48小时后观察结果；同时设立羧酸奥司他韦(0.0625μg/ml)对照组、病毒对照组和正常细胞对照组。

细胞出现病变程度按以下6级标准记录：-为细胞生长正常，无病变出现；±为细胞病变少于整个单层细胞的10％；+为细胞病变约占整个单层细胞的25％；++为细胞病变约占整个单层细胞的50％；+++为细胞病变约占整个单层细胞的75％：++++为细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。Reed-Muench法计算半数有效抑制浓度(IC₅₀)，并以选择指数SI表示(SI＝TC₅₀/IC₅₀)，SI>2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI<1表示无效。

5、试验结果

利用MTT法测得Caulilexin C的TC₅₀为208.9μg/mL。体外抗病毒活性如图5所示，受试药物能有效抑制流感病毒A/PR/8/34(H1N1)引起的细胞病变，并有明显剂量依赖性，IC₅₀为18.2μg/mL；SI＝11.47。

如图6所示，随着Caulilexin C的浓度逐渐增加，流感病毒受到抑制，细胞出现病变的程度逐渐减轻。

实施例4：空斑减少法试验Caulilexin C对流感病毒的抑制作用

将MDCK细胞按1×10⁶接种于6孔板中，置37℃、5％CO₂培养48小时，待细胞长至单层，移去培养基，用PBS洗涤细胞2次；采用MOI＝0.0001的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染细胞，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2小时；吸掉孵育的病毒液，加入含不同浓度药物(Caulilexin C)(16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL)的琼脂糖(含0.2％TPCK)营养覆盖物3mL/孔，同时设立病毒对照组和正常细胞对照组。将细胞板置37℃、5％CO₂培养箱中孵育48小时。使用4％多聚甲醛固定1小时，再用结晶紫溶液室温染色，吸去染液后计算空斑数。

结果如图7所示，Caulilexin C能明显抑制病毒对MDCK细胞的损伤，并有明显量效关系。

上述试验表明，Caulilexin C可以方便地从板蓝根药材中分离得到；本品在MDCK细胞模型上对H1N1甲型流感病毒具有明显的抑制活性，可减少MDCK细胞的凋亡，并呈剂量依赖性，提示Caulilexin C作为一种新型的抗流感小分子结构，具高效低毒特征，有望应用于制备新型抗流感药物。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.Caulilexin C在制备预防或治疗甲型流感的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Caulilexin C具有如下结构式：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有药学上可接受的载体和/或辅料。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物被制成药学上可接受的剂型。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Caulilexin C包括其可药用盐。

6.一种用于治疗或预防甲型流感的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括Caulilexin C或其可药用盐。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。