CN113679726A - 丹参提取物和醌类化合物在抗冠状病毒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丹参提取物和醌类化合物在抗冠状病毒中的应用。选自丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、β‑拉帕醌、左旋紫草素、2‑甲氧基‑1,4‑萘醌、CPI‑169、S3I‑201和白花丹素中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型在制备抗冠状病毒剂、在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物、和/或在制备抑制木瓜样蛋白酶的抑制剂中的应用。这些化合物能够很好地抑制冠状病毒中的木瓜样蛋白酶的活性，并且抑制冠状病毒在细胞中的复制能力进而抑制冠状病毒的活性，使用这些化合物来治疗冠状病毒引起的疾病时，毒副作用低，口服给药易实施。

Description

丹参提取物和醌类化合物在抗冠状病毒中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及丹参提取物和醌类化合物在抗冠状病毒中的应用，特别是涉及选自丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、β-拉帕醌、左旋紫草素、2-甲氧基-1,4-萘醌、CPI-169、S3I-201和白花丹素中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型在制备抗冠状病毒剂、在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物、和/或在制备抑制木瓜样蛋白酶的抑制剂中的应用。
背景技术
冠状病毒是一类与人畜密切相关的病毒。冠状病毒HCoV-229E和HCoV-OC43会引起普通感冒1。2002至2003年期间由SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸系统综合征(SARS，severe acute respiratory syndrome)在全球引起巨大的风波。2004年鉴定出的HCoVNL63同样能引起类似感冒的呼吸道疾病1。2012中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)出现。最近在全球范围流行的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)会引发新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，临床表现为发烧、干咳和呼吸困难，重症会造成死亡4。冠状病毒对于畜牧业同样影响巨大：猪流行性腹泻病毒(PEDV)、肠胃炎病毒(TGEV)和猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV，也叫德尔塔病毒)，可引起猪的严重肠炎、腹泻、呕吐和脱水，给养猪业带来巨大的损失5。猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)可引起的猫科动物的致死性疾病。禽传染性支气管炎病毒(IBV)感染禽类，是一种分布广泛的家禽疾病，对家禽业造成了巨大的经济影响。
冠状病毒的基因组为单股正义RNA，长度约28kb，主要编码病毒包装所需的结构蛋白以及与复制转录相关的非结构蛋白。开发治疗冠状病毒相关疾病的药物和疫苗主要针对上述两类蛋白。病毒基因组的三分之二的基因主要编码非结构蛋白，用于参与病毒的复制过程。在成熟的非结构蛋白产生之前，冠状病毒编码了两种复制酶多肽pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab通过两种由病毒自身编码的蛋白酶，即主蛋白酶(main protease)和木瓜样蛋白酶(papain-like protease)，将其切割成16个非结构蛋白(nsp1-16)，只有当这些功能亚基被蛋白酶正确切割成独立的蛋白单元，进而组装成复制转录复合物后，病毒才能完成正常的转录、复制功能。
木瓜样蛋白酶位于非结构蛋白nsp3(non-structural protein 3)中，在剪切过程中负责切割复制酶多肽N端的3个酶切位点，从而释放出nsp1、nsp2以及nsp36,7,8。由于木瓜样蛋白酶具有蛋白水解、去泛素化、拮抗宿主IFN等重要功能，在病毒的转录复制过程中发挥关键的调节作用，因此成为一个重要的冠状病毒药物靶点。因此寻找针对木瓜样蛋白酶催化位点专一性强、安全性高的抑制剂对于药物开发必不可少。针对木瓜样蛋白酶的抑制剂，特别是靶向其底物结合口袋的小分子化合物有可能成为治疗冠状病毒的潜在药物。
目前，临床一线治疗冠状病毒引起的感染，使用的多为广谱抗病毒药，如抗HIV药物洛匹那韦/利托那韦(克力芝)、阿比多尔、抗埃博拉病毒药物瑞德西韦等。但只需要或多或少都存在各种副作用甚至导致部分受试者心动过缓等，因此均不是治疗冠状病毒的最佳选择。因此，依据现有证据和经验判断，冠状病毒的治疗有其特殊性，仍需要开发能够有效治疗和/或预防冠状病毒所引起的疾病的药物。
丹参酮Ⅰ(Tanshinone I，分子式：C18H12O3，CAS号：568-73-0)是一种从中草药丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)中提取出来的化学分子，其分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000021
丹参酮Ⅰ具有抗炎症的作用，并且可以通过调节粘附分子对乳腺癌的转移起到调节或者抑制的作用(Nizamutdinova,Irina Tsoy,et al."Tanshinone I suppressesgrowth and invasion of human breast cancer cells,MDA-MB-231,throughregulation of adhesion molecules."Carcinogenesis 29.10(2008):1885-1892)。CN102552236A中公开了丹参酮Ⅰ用于治疗小胶质细胞介导的疾病的用途，CN102988370A中还公开了丹参酮I在制备治疗银屑病药物中的应用。
β-拉帕醌(Beta-lapachone，分子式：C15H14O3；CAS号：4707-32-8)是一种邻萘醌，其分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000022
研究表明，Beta-lapachone可以引起细胞色素C的释放，从而引起细胞的凋亡以及坏死。其对多种癌症细胞培养物的致死剂量均在微摩尔级别(对于AD2780s,HT-29,DLD,G480以及MCF-7细胞杀伤作用的IC50值分别为2μM,5μM,5μM,4μM以及2μM)，表明其具有潜在的对癌症细胞生长的抑制能力。并且一些在动物体内的抗肿瘤实验中，Beta-lapachone也得到了阳性的结果。另外Beta-lapachone还可以抑制细胞DNA损伤的修复，从而使肿瘤细胞对X射线、烷基化试剂等更加敏感(Li,You-Zhi,et al."Release of mitochondrialcytochrome C in both apoptosis and necrosis induced byβ-lapachone in humancarcinoma cells."Molecular Medicine 5.4(1999):232-239.)(Pardee,Arthur B.,Y.Li,and Chiang J.Li."Cancer therapy withβ-lapachone."Current cancer drugtargets 2.3(2002):227-242)。
DNA拓扑异构酶I是目前已发现的Beta-lapachone的药物靶点，Beta-lapachone可以抑制DNA拓扑异构酶I解开DNA超螺旋的活性。并且这种抑制作用是特异性的，研究证明对于DNA拓扑异构酶II，Beta-lapachone不具有抑制活性(Li CJ,Averboukh L,PardeeAB.beta-Lapachone,a novel DNA topoisomerase I inhibitor with a mode of actiondifferent from camptothecin.J Biol Chem.1993Oct 25；268(30):22463-8.)。US20050187288A1中公开了β-拉帕酮或其衍生物或类似物或其药学上可接受的盐在受试者中治疗癌症或癌前状态或预防癌症的方法。
丹参酮IIA磺酸钠(Tanshinone IIA-sulfonic sodium，分子式：C19H17NaO6S，CAS号：69659-80-9)是丹参酮IIA的一种水溶性衍生物，丹参酮IIA是一种从中草药丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)中提取出来的化学分子，丹参酮IIA磺酸钠的分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000031
丹参酮IIA磺酸钠具有多种药理学功能，包括抗氧化、抗炎症以及抗凋亡，并已经被CFDA(China State Food and Drug Administration)批准用于心血管疾病的治疗。另外，在最近几十年中，有许多研究与临床试验也表明丹参酮IIA磺酸钠在脑部疾病、肺部疾病、癌症、败血症的治疗中具有一定的潜力(Zhou,Zhong-Yan,et al."Sodium tanshinoneIIA sulfonate:A review of pharmacological activity and pharmacokinetics."Biomedicine&Pharmacotherapy 118(2019):109362)。JP5247469B2中公开了使用丹参酮IIA磺酸钠可以有效预防或减少哺乳动物中内毒素休克的生理作用。CN101120940A中公开了丹参酮IIA磺酸钠作为血脑屏障保护剂在脑部疾病中的应用。
隐丹参酮(Cryptotanshinone，分子式：C19H20O3，CAS号：35825-57-1)是一种从中草药丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)中分离出的醌类二萜，其分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000041
研究表明，隐丹参酮的药物靶点是STAT3，可以有效抑制STAT3。隐丹参酮可以通过JAK2非依赖性机制快速抑制STAT3 705位Tyr的磷酸化。隐丹参酮通过与单体STAT3结合从而阻断STAT3二聚化，最终抑制STAT3的转录调节活性(Shin,Dae-Seop,et al."Cryptotanshinone inhibits constitutive signal transducer and activator oftranscription 3function through blocking the dimerization in DU145 prostatecancer cells."Cancer research69.1(2009):193-202)。另外，还有研究报道了隐丹参酮可以通过抑制环加氧酶II的活性来起到抗炎症的作用(Jin,Dao-Zhong,et al."Cryptotanshinone inhibits cyclooxygenase-2enzyme activity but not itsexpression."European journal of pharmacology 549.1-3(2006):166-172)。CN106798737A还公开了隐丹参酮在用于防治肺纤维化的作用。JP2004517939A中还公开了隐丹参酮用于预防和治疗早期阿尔茨海默氏病的作用。
二氢丹参酮Ⅰ(Dihydrotanshinone I，分子式：C18H14O3，CAS号：87205-99-0)是一种从中草药丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)中提取出来的天然化合物，其分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000042
二氢丹参酮Ⅰ对多种肿瘤细胞具有细胞毒性。有研究显示，二氢丹参酮Ⅰ可以通过提高钙离子浓度来激活NOX5，进一步，NOX5可以诱导产生ROS(活性氧)，最终通过ROS/Stat3信号通路，二氢丹参酮Ⅰ可以抑制乳腺癌干细胞的生长。(Kim,Su-Lim,et al."Dihydrotanshinone-induced NOX5 activation inhibits breast cancer stem cellthrough the ROS/Stat3 signaling pathway."Oxidative medicine and cellularlongevity 2019(2019).)
另外，二氢丹参酮Ⅰ可以对脐静脉内皮细胞产生很强的细胞毒性(IC50值约为1.28μg/ml)，说明二氢丹参酮Ⅰ具有潜在的抗血管生成能力(Bian,W；Chen,F；Bai,L；Zhang,P；Qin,W(2008)."Dihydrotanshinone I inhibits angiogenesis both in vitro and invivo".Acta Biochimica et Biophysica Sinica.40(1):1–6)。CN108379273A中公开了二氢丹参酮I在治疗多药耐药性肿瘤药物中的应用，CN110613708A中还公开了二氢丹参酮Ⅰ在制备P53激动剂和信号传导及转录激活因子3抑制剂中的应用。
左旋紫草素(Alkannin，分子式：C16H16O5，CAS:517-88-4)是一种天然的红色萘醌色素，其分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000051
左旋紫草素具有抗菌、抗肿瘤和抗炎作用；纯化的紫草素制剂广泛用于医药、化妆品和某些食品的生产；紫草素还可进入用于治疗烧伤的抗炎软膏和乳膏组合物。通过TLR2或NF-κB介导的途径抑制MGC-803细胞的活力、粘附、侵袭和迁移能力(Takano-Ohmuro H,Yoshida L S,Yuda Y,et al.Shikonin inhibits IgE-mediated histamine release byhuman basophils and Syk kinase activity[J].Inflammation Research,2008,57(10):484-488.)(Liu J P,Liu D,Gu J F,et al.Shikonin inhibits the cell viability,adhesion,invasion and migration of the human gastric cancer cell line MGC-803via the Toll-like receptor 2/nuclear factor-kappa B pathway[J].Journal ofPharmacy&Pharmacology,2015,67(8):1143-1155)，其以PI3Kα为靶点。CN104771384B中公开了使用紫草素用于制备抗病毒例如抗单纯疱疹病毒和水疱性口炎病毒等的药物。
CPI-169(抗肿瘤药物，Synonyms:CPI 169R-enantiomer，分子式：C27H36N4O5S，CAS：1802175-07-0)是一种新颖的、有效的EZH2抑制剂，能够抑制EZH2 WT，EZH2 Y641N和EZH1的活性，IC50值分别为0.24nM，0.51nM和6.1nM，其分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000061
CPI-169抑制PRC2的催化活性，IC50<1nM，降低H3K27me3的细胞水平，EC50为70nM，并触发多种细胞系的细胞周期停滞和凋亡(Vidya Balasubramanian,et al.CPI-169,anovel and potent EZH2 inhibitor,synergizes with CHOP in vivoand achievescomplete regression in lymphoma xenograft models.Cancer Res October 1,201474；1697)。
在KARPAS-422细胞中，CPI-169与ABT-199结合使用时，对细胞活力具有剂量依赖性抑制作用，并产生协同抗增殖活性。在25个NHL细胞系中，有16个中的CPI-169也抑制细胞生长，GI50<5μM(Bradley WD,et al.EZH2 inhibitor efficacy in non-Hodgkin'slymphoma does not require suppression of H3K27 monomethylation.ChemBiol.2014Nov20；21(11):1463-75)。US20190134025A1中还公开了CPI-169等药物在患有癌细胞过度表达精氨酸甲基转移酶CARM1的癌症的人类受试者中治疗癌症的应用。
S3I-201(抗肿瘤药物，Synonyms:NSC 74859，分子式：C16H15NO7S，CAS:501919-59-1)是选择性的Stat3抑制剂，IC50为86μM，其分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000062
NSC 74859(S3I-201)相对于Stat1优先抑制Stat3 DNA结合活性(IC50值，Stat3·Stat3，86±33μM；Stat1·Stat3，160±43μM；Stat1·Stat1，>300μM)和抑制Stat5的IC50为166±17μM)。NSC 74859显着减少了活细胞数量，并抑制了转化的小鼠成纤维细胞NIH3T3/v-Src和乳腺癌细胞系(MDA-MB-231，MDA-MB-435和MDA-MB-468)的生长。NSC 74859以30-100μM的浓度诱导代表性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435和NIH 3T3/v-Src显着凋亡，两者均具有组成型活性Stat3。乳腺癌MDA-MB-435细胞系对30μMNSC74859更为敏感。相比之下，人类乳腺癌MDA-MB-453细胞和正常的小鼠成纤维细胞(NIH 3T3)不含异常的Stat3活性，对100μM或更小的NSC 74859不敏感。在300μM或更高的浓度下，NSC 74859会引起与Stat3激活状态无关的一般性非特异性细胞毒性(Siddiquee K,et al.Selective chemical probeinhibitor of Stat3,identified through structure-based virtual screening,induces antitumor activity.Proc Natl Acad Sci U S A.2007May1；104(18):7391-6.)。Huh-7细胞不表达β2SP或TBGFR2，并且对STAT3抑制敏感，对NSC 74859的IC50为100μM，而与CD133+的状态无关。NSC 74859的IC50对于Huh-7和SNU-398细胞为150μM，对于SNU-475细胞为15μM，对于SNU-182细胞为200μM。NSC 74859抑制乳腺癌MDA-MB-435，MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞系，IC50接近100μM(Lin L,et al.The STAT3 inhibitor NSC 74859iseffective in hepatocellular cancers with disrupted TGF-βsignaling.Oncogene.2009Feb 19；28(7):961-72.)。US20140296270A1中也提及了S3I-201(每2-3天5mg/kg)能够抑制其中乳腺癌细胞系的生长等。
2-甲氧基-1,4-萘醌(2-Methoxy-1,4-naphthoquinone，分子式：C11H8O3,CAS:2348-82-5)是一种凤仙花叶提取物，其分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000071
2-甲氧基-1,4-萘醌以浓度依赖的方式特异性抑制了Raji细胞中PKCβI，PKCδ和PKCζ的表达。2-甲氧基-1,4-萘醌(MNQ)表现出抗真菌，抗菌活性并对K562，HL-60，Raji，MCF-7，H-23，IMR-32，LA-174-T，HSC-2和SK-MEL-28表现出强大的杀灭作用。MNQ能够触发K562细胞内在的凋亡途径，并在p53野生型细胞系中引起p53依赖的细胞周期停滞。MNQ在2.9μM的IC50抑制TCF/β-catenin(TOP)转录活性，同时降低FOP(突变的TCF结合位点)转染细胞的转录活性。MNQ对MDA-MB-231细胞具有抗转移作用。MNQ对PKCβI和ζ抑制具有显着的选择性。MNQ适度抑制PKCδ，其中MNQ在10μM的浓度下抑制一半的PKCδ表达。MNQ不抑制PKCβII(Wong Teck Yew,et al.Journal of Applied Pharmaceutical Science)。MNQ能够抑制高度转移的MDA-MB-231癌细胞的侵袭和迁移特性(Liew K,et al.Toxicol InVitro.2014,28(3):335-9.)。TW201726169A中公开了2,3-二甲氧基-1,4-萘醌作为ROS产生剂在制备药物组合物中的应用。
白花丹素(Plumbagin，分子式C11H8O3.,，CAS：481-42-5)是一种醌组分，已被证明具有抗癌，抗动脉粥样硬化和抗菌作用，其分子式如下所示：
Figure BDA0003046109360000081
体外实验中发现，Plumbagin通过诱导癌细胞经历G2/M期阻滞和凋亡而表现出有效的细胞生长抑制作用。细胞周期的阻断与p21水平的升高和Cdc2，Cdc25C和cyclinB1的减少有关。Plumbagin处理还发现可以增强失活的磷酸化Cdc2和Cdc25C的水平。阻断p53活性可部分减少铅蛋白诱导的细胞凋亡和G2/M阻滞，表明它可能是通过p53依赖性和独立途径起作用的。体内实验中，为了确定铅蛋白是否抑制体内肿瘤的生长，注射了A549细胞变成裸鼠在以2mg/kg/day的铅白蛋白治疗的小鼠中，肿瘤生长抑制最为明显，与用赋形剂治疗的小鼠相比，在其中观察到肿瘤大小减少了约80％。通过监测体重判断，在用李白素治疗的小鼠中未观察到毒性迹象(Hsu YL,Cho CY,Kuo PL,Huang YT,Lin CC.Plumbagin(5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone)induces apoptosis and cell cycle arrestin A549 cells through p53 accumulation via c-Jun NH2-terminal kinase-mediatedphosphorylation at serine 15in vitro and in vivo.J Pharmacol ExpTher.2006Aug；318(2):484-94.Chemical Properties)。US20140271923A1还公开了将白花丹素等化合物用于患有各种聚集性慢性疾病的患者的应用。
现有技术中尚无以上药物可用于治疗冠状病毒引起的相关疾病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中尚无有效治疗和/或预防冠状病毒所引起的疾病的药物的缺陷，提供了选自丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、β-拉帕醌、左旋紫草素、2-甲氧基-1,4-萘醌、CPI-169、S3I-201和白花丹素中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型、及包含其的药物组合物、套装药盒在抗冠状病毒和/或在抑制木瓜样蛋白酶中的应用，所述抗冠状病毒可以是使用本发明所述的这些化合物作为抗冠状病毒剂(例如可将其用来预防和/或治疗未表现出疾病状态的携带冠状病毒的患者)，也可以是使用所述的这些化合物来治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病。本发明的这些化合物可以很好地抑制冠状病毒中的木瓜样蛋白酶的活性，并且可以很好的抑制冠状病毒在细胞中的复制能力进而抑制冠状病毒的活性，可用于治疗和/或预防冠状病毒引起的相关疾病，或将其制备成抗冠状病毒剂，填补了现有技术缺乏治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病等不足。使用本发明所述的化合物来治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病时，毒副作用低，口服给药易实施。还可对该化合物进行进一步研究、改造以进行应用。
本发明人经过大量实验，意外发现丹参提取物的某些化合物、醌类(如萘醌类)的某些化合物、某些EZH2抑制剂、某些STAT3抑制剂等化合物可显著抑制木瓜样蛋白酶(特别是冠状病毒的木瓜样蛋白酶)的活性，可将其用于治疗冠状病毒引起的相关疾病中。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了选自丹参酮Ⅰ(CAS号：568-73-0)、丹参酮IIA、隐丹参酮(CAS号：35825-57-1)、二氢丹参酮Ⅰ(CAS号：87205-99-0)、β-拉帕醌(CAS号：4707-32-8)、左旋紫草素(CAS号：517-88-4)、2-甲氧基-1,4-萘醌(CAS号：2348-82-5)、CPI-169(CAS号：1802175-07-0)、S3I-201(CAS号：501919-59-1)和白花丹素(CAS：481-42-5)中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型在制备抗冠状病毒剂中的应用、在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物中的应用、和/或在制备抑制木瓜样蛋白酶的抑制剂中的应用。
较佳地，所述药学上可接受的盐为磺酸盐和/或钠盐。
较佳地，所述丹参酮IIA的药学上可接受的盐为丹参酮IIA磺酸钠(CAS号：69659-80-9)。
较佳地，所述木瓜样蛋白酶为冠状病毒的木瓜样蛋白酶。
较佳地，所述的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型抑制所述木瓜样蛋白酶(特别是冠状病毒的木瓜样蛋白酶，例如抑制该酶的活性)。
较佳地，所述的疾病为哺乳动物或者禽类疾病，所述的哺乳动物优选为人、猪和/或猫。
本发明所述的冠状病毒，其定义为本领域熟知，在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)。冠状病毒是具有囊膜(envelope)、基因组为单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。
本发明的目的是提供冠状病毒感染引起的疾病的潜在治疗方案。本发明所述的冠状病毒较佳地属于正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，更佳地属于α冠状病毒属(Alpha冠状病毒属)、β冠状病毒属(Beta冠状病毒属)、γ冠状病毒属(Gamma冠状病毒属)和/或δ冠状病毒属(Delta冠状病毒属)。
较佳地，所述的冠状病毒选自引起上呼吸道感染的冠状病毒、引起急性呼吸综合征的病毒例如SARS相关冠状病毒、和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)中的一种或多种。所述引起上呼吸道感染的冠状病毒优选为人冠状病毒229E、人冠状病毒HKU1、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63和/或小鼠肝炎病毒A59。所述SARS相关冠状病毒优选为SARS-CoV或SARS-CoV-2。
本发明中，所述的这些化合物除可用于治疗SARS-CoV-2(Beta冠状病毒属)引起的疾病以外，还应可治疗其他冠状病毒SARS-CoV(Beta冠状病毒属)和MERS-CoV等引起的重大传染病，亦可作为普通感冒药，治疗HCoV-HKU1(Human coronavirus HKU1；Beta冠状病毒属)、HCoV-NL63(Human coronavirus NL63；Alpha冠状病毒属)、HCoV-OC43(Humancoronavirus OC43)以及HCoV-229E(Human coronavirus 22E；Alpha冠状病毒属)等冠状病毒引起的疾病；还可作为兽药，治疗猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus,TGEV；Alpha冠状病毒属)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV；Alpha冠状病毒属)、猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV；Delta冠状病毒属)、猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectiousperitonitis virus,FIPV；Alpha冠状病毒属)、禽传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus,IBV；Gamma冠状病毒属)等动物疾病。
本发明中，所述SARS相关冠状病毒即为引起严重急性呼吸综合征(SARS)的冠状病毒。所述由SARS相关冠状病毒引起的疾病是因病毒感染引起的症状或疾病，这个疾病早期主要反映在呼吸道疾病上，临床上表现为发热、乏力、干咳、咳嗽、呼吸加速或急性呼吸窘迫综合征、气促等，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛等症状。影像学表现为肺部不同程度改变如多发斑点和磨玻璃样阴影，病毒主要传播方式为近距离飞沫传播或接触患者呼吸道分泌物。此外还可能有消化道症状例如腹泻、婴儿和新生儿急性肠胃炎，极少数情况下引起神经系统综合征。再后期可能产生许多并发症包括难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍、呼吸衰竭、爆发性心肌炎至心力衰竭、肝肾衰竭等多脏器衰竭和脓毒症休克等。重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍及多器官功能衰竭。上述疾病均寄望可使用本发明的PARP抑制剂进行治疗。此外，还有一部分病毒携带者未出现上述症状，也可以使用本发明所述的PARP抑制剂，来抑制病毒复制和传播等从而避免该病毒携带者患病或传播病毒产生新的病例。在某一方案中，所述β冠状病毒属的病毒为引起急性呼吸综合征的病毒例如SARS相关冠状病毒；较佳地，所述SARS相关冠状病毒为SARS-CoV(严重急性呼吸综合征冠状病毒)和/或SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒-2)。
在本发明某一较佳实施方案中，所述的冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)。
在本发明某一较佳实施方案中，所述的冠状病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)。
本发明中，所述的抑制冠状病毒的木瓜样蛋白酶的抑制剂可以是以抑制冠状病毒的抑制剂的形式存在，例如常规的用于抗冠状病毒的药物。
为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种药物组合物在制备抗冠状病毒剂、在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物、和/或在制备抑制木瓜样蛋白酶的抑制剂中的应用，所述药物组合物包括选自丹参酮Ⅰ(CAS号：568-73-0)、丹参酮IIA、隐丹参酮(CAS号：35825-57-1)、二氢丹参酮Ⅰ(CAS号：87205-99-0)、β-拉帕醌(CAS号：4707-32-8)、左旋紫草素(CAS号：517-88-4)、2-甲氧基-1,4-萘醌(CAS号：2348-82-5)、CPI-169(CAS号：1802175-07-0)、S3I-201(CAS号：501919-59-1)和白花丹素(CAS：481-42-5)中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型。
较佳地，所述药学上可接受的盐为磺酸盐和/或钠盐。
较佳地，所述丹参酮IIA的药学上可接受的盐为丹参酮IIA磺酸钠(CAS号：69659-80-9)。
较佳地，所述木瓜样蛋白酶为冠状病毒的木瓜样蛋白酶。
较佳地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体，例如药学上可接受的药用辅料。其中，所述的药物组合物通常是以选自丹参酮Ⅰ(CAS号：568-73-0)、丹参酮IIA、隐丹参酮(CAS号：35825-57-1)、二氢丹参酮Ⅰ(CAS号：87205-99-0)、β-拉帕醌(CAS号：4707-32-8)、左旋紫草素(CAS号：517-88-4)、2-甲氧基-1,4-萘醌(CAS号：2348-82-5)、CPI-169(CAS号：1802175-07-0)、S3I-201(CAS号：501919-59-1)和白花丹素(CAS：481-42-5)中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型作为所述药物组合物的唯一活性成分，也可以是还存在其他活性成分，其他活性成分可以是治疗和/或预防与冠状病毒相关的疾病的活性成分，也可以是治疗和/或预防其他病毒引起的疾病的活性成分。
较佳地，所述冠状病毒如本发明第一方面所述。具体可以为：
所述的冠状病毒可以是属于正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)的冠状病毒。所述正冠状病毒亚科的病毒优选为属于α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和/或δ冠状病毒属的病毒。
所述的冠状病毒可以是选自引起上呼吸道感染的冠状病毒、引起急性呼吸综合征的病毒例如SARS相关冠状病毒、和中东呼吸综合征冠状病毒中的一种或多种；所述的引起上呼吸道感染的冠状病毒优选为人冠状病毒229E、人冠状病毒HKU1、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63和/或小鼠肝炎病毒A59；所述SARS相关冠状病毒优选为SARS-CoV或SARS-CoV-2；
所述冠状病毒还可以为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒和/或禽传染性支气管炎病毒。
为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种套装药盒在制备抗冠状病毒剂、在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物、和/或在制备抑制木瓜样蛋白酶的抑制剂中的应用，所述套装药盒包括选自丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、β-拉帕醌、左旋紫草素、2-甲氧基-1,4-萘醌、CPI-169、S3I-201和白花丹素中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型。
较佳地，所述药学上可接受的盐为磺酸盐和/或钠盐。
较佳地，所述丹参酮IIA的药学上可接受的盐为丹参酮IIA磺酸钠。
较佳地，所述木瓜样蛋白酶为冠状病毒的木瓜样蛋白酶。
较佳地，所述套装药盒优选还包括治疗和/或预防与冠状病毒相关的疾病的药物、和/或治疗和/或预防其他病毒引起的疾病的药物。
较佳地，所述冠状病毒如本发明第一方面所述。具体可以为：
所述的冠状病毒可以是属于正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)的冠状病毒。所述正冠状病毒亚科的病毒优选为属于α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和/或δ冠状病毒属的病毒。
所述的冠状病毒可以是选自引起上呼吸道感染的冠状病毒、引起急性呼吸综合征的病毒例如SARS相关冠状病毒、和中东呼吸综合征冠状病毒中的一种或多种；所述的引起上呼吸道感染的冠状病毒优选为人冠状病毒229E、人冠状病毒HKU1、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63和/或小鼠肝炎病毒A59；所述SARS相关冠状病毒优选为SARS-CoV或SARS-CoV-2；
所述冠状病毒还可以为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒和/或禽传染性支气管炎病毒。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种选自丹参酮Ⅰ(CAS号：568-73-0)、丹参酮IIA、隐丹参酮(CAS号：35825-57-1)、二氢丹参酮Ⅰ(CAS号：87205-99-0)、β-拉帕醌(CAS号：4707-32-8)、左旋紫草素(CAS号：517-88-4)、2-甲氧基-1,4-萘醌(CAS号：2348-82-5)、CPI-169(CAS号：1802175-07-0)、S3I-201(CAS号：501919-59-1)和白花丹素(CAS：481-42-5)中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型用于抗冠状病毒剂，或者用于治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病，或者用于制备抗冠状病毒剂或在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物，或者用于抑制木瓜样蛋白酶(例如冠状病毒的木瓜样蛋白酶，例如抑制木瓜样蛋白酶的活性)，或者用于制备抑制木瓜样蛋白酶(例如冠状病毒的木瓜样蛋白酶，例如抑制木瓜样蛋白酶的活性)的抑制剂。
较佳地，选自丹参酮Ⅰ(CAS号：568-73-0)、丹参酮IIA、隐丹参酮(CAS号：35825-57-1)、二氢丹参酮Ⅰ(CAS号：87205-99-0)、β-拉帕醌(CAS号：4707-32-8)、左旋紫草素(CAS号：517-88-4)、2-甲氧基-1,4-萘醌(CAS号：2348-82-5)、CPI-169(CAS号：1802175-07-0)、S3I-201(CAS号：501919-59-1)和白花丹素(CAS：481-42-5)种的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型如本发明第一方面或第二方面所述。
较佳地，所述的冠状病毒如本发明第一方面或第二方面所述。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了选自丹参酮Ⅰ(CAS号：568-73-0)、丹参酮IIA、隐丹参酮(CAS号：35825-57-1)、二氢丹参酮Ⅰ(CAS号：87205-99-0)、β-拉帕醌(CAS号：4707-32-8)、左旋紫草素(CAS号：517-88-4)、2-甲氧基-1,4-萘醌(CAS号：2348-82-5)、CPI-169(CAS号：1802175-07-0)、S3I-201(CAS号：501919-59-1)和白花丹素(CAS：481-42-5)种的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型，在抗冠状病毒、或者在治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病、或者在用于抑制木瓜样蛋白酶(例如冠状病毒的木瓜样蛋白酶，例如抑制木瓜样蛋白酶的活性)中的应用。
较佳地，所述的冠状病毒如本发明第一方面或第二方面所述。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种抗冠状病毒的方法，或者一种治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的方法，或者一种用于抑制木瓜样蛋白酶(例如冠状病毒的木瓜样蛋白酶，例如抑制木瓜样蛋白酶的活性)的方法，其包括施用选自丹参酮Ⅰ(CAS号：568-73-0)、丹参酮IIA、隐丹参酮(CAS号：35825-57-1)、二氢丹参酮Ⅰ(CAS号：87205-99-0)、β-拉帕醌(CAS号：4707-32-8)、左旋紫草素(CAS号：517-88-4)、2-甲氧基-1,4-萘醌(CAS号：2348-82-5)、CPI-169(CAS号：1802175-07-0)、S3I-201(CAS号：501919-59-1)和白花丹素(CAS：481-42-5)种的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型的步骤。
较佳地，所述的冠状病毒如本发明第一方面或第二方面所述。
本发明还提供了一种套装药盒在制备抗冠状病毒剂、在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物、和/或在制备抑制木瓜样蛋白酶(例如冠状病毒的木瓜样蛋白酶)的抑制剂中的应用，所述套装药盒包括选自丹参酮Ⅰ(CAS号：568-73-0)、丹参酮IIA、隐丹参酮(CAS号：35825-57-1)、二氢丹参酮Ⅰ(CAS号：87205-99-0)、β-拉帕醌(CAS号：4707-32-8)、左旋紫草素(CAS号：517-88-4)、2-甲氧基-1,4-萘醌(CAS号：2348-82-5)、CPI-169(CAS号：1802175-07-0)、S3I-201(CAS号：501919-59-1)和白花丹素(CAS：481-42-5)中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型。
较佳地，所述套装药盒优选还包括治疗和/或预防与冠状病毒相关的疾病的药物、和/或治疗和/或预防其他病毒引起的疾病的药物。
较佳地，所述的冠状病毒如本发明第一方面或第二方面所述。
本发明中涉及的以本发明多种化合物作为活性成份的药物组合物，均可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的重量含量通常为0.1-99.0％。
所述的药学可接受的载体可为本领域常规的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和/或上述的抗体药物偶联物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明化合物或含其的药物组合物可以制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
"药物组合物"指将本发明中的化合物中的一个或多个或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药与别的化学成分，例如药学上可接受的载体，混合。药物组合物的目的是促进给药给动物的过程。
前述的药物组合物中，除了包括药学上可接受的载体外，还可以包括在药(剂)学上常用的辅剂，例如:抗细菌剂、抗真菌剂、抗微生物剂、保质剂、调色剂、增溶剂、增稠剂、表面活性剂、络合剂、蛋白质、氨基酸、脂肪、糖类、维生素、矿物质、微量元素、甜味剂、色素、香精或它们的结合等。
"药学上可接受的载体"指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的药物组合物中的非活性成分，例如但不限于:碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、甘露醇等)、淀粉、环糊精、硬脂酸镇、纤维素、碳酸镇、丙烯酸聚合物或甲基丙烯酸聚合物、凝胶、水、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、EZ麻油或氢化EZ麻油或多乙氧基氢化EZ麻油、芝麻油、玉米油、花生油等。
术语“治疗”指治疗性疗法。涉及具体病症时，治疗指：(1)缓解疾病或者病症的一种或多种生物学表现，(2)干扰(a)导致或引起病症的生物级联中的一个或多个点或(b)病症的一种或多种生物学表现，(3)改善与病症相关的一种或多种症状、影响或副作用，或者与病症或其治疗相关的一种或多种症状、影响或副作用，或(4)减缓病症或者病症的一种或多种生物学表现发展。
本发明化合物或含其的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
术语“药学上可接受的”是指盐、溶剂、辅料等一般无毒、安全，并且适合于患者使用。所述的“患者”优选哺乳动物，更优选为人类。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与相对无毒的、药学上可接受的酸或碱制备得到的盐。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括但不限于：锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、镁盐、锌盐、铋盐、铵盐、二乙醇胺盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。所述的药学上可接受的酸包括无机酸，所述无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、磷酸、亚磷酸、硫酸等。所述的药学上可接受的酸包括有机酸，所述有机酸包括但不限于：乙酸、丙酸、草酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、异烟酸、酸式柠檬酸、油酸、单宁酸、泛酸、酒石酸氢、抗坏血酸、龙胆酸、富马酸、葡糖酸、糖酸、甲酸、乙磺酸、双羟萘酸(即4,4’-亚甲基-双(3-羟基-2-萘甲酸))、氨基酸(例如谷氨酸、精氨酸)等。当本发明的化合物中含有相对酸性和相对碱性的官能团时，可以被转换成碱加成盐或酸加成盐。具体可参见Berge et al.,"PharmaceuticalSalts",Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977)、或、Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(P.Heinrich Stahl andCamille G.Wermuth,ed.,Wiley-VCH,2002)。
术语“溶剂合物”是指本发明化合物与化学计量或非化学计量的溶剂结合形成的物质。溶剂合物中的溶剂分子可以有序或非有序排列的形式存在。所述的溶剂包括但不限于：水、甲醇、乙醇等。
术语“药学上可接受的盐的溶剂合物”中的“药学上可接受的盐”和“溶剂合物”如上所述，是指本发明化合物与1、与相对无毒的、药学上可接受的酸或碱制备得到的2、与化学计量或非化学计量的溶剂结合形成的物质。所述的“药学上可接受的盐的溶剂合物”包括但不限于本发明化合物的盐酸一水合物。
术语“化合物”、“药学上可接受的盐”、“溶剂合物”和“药学上可接受的盐的溶剂合物”可以以晶型或无定型的形式存在。术语“晶型”是指其中的离子或分子是按照一种确定的方式在三维空间作严格周期性排列，并具有间隔一定距离周期重复出现规律；因上述周期性排列的不同，可存在多种晶型，也即多晶型现象。术语“无定型”是指其中的离子或分子呈现杂乱无章的分布状态，即离子、分子间不具有周期性排列规律。
术语“一种或多种”中的“多种”可以是指2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或者更多种。
本发明中，所述“包括、包含或含有”可以是指除了包括后面所列举的成分，还存在其他成分；也可以是指“由……组成”，即只包括后面所列举的成分而不存在其他成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的这些化合物可以很好地抑制冠状病毒中的木瓜样蛋白酶的活性，并且可以很好的抑制冠状病毒在细胞中的复制能力进而抑制冠状病毒的活性，且细胞毒性较低，可用于治疗和/或预防冠状病毒引起的相关疾病，或将其制备成抗冠状病毒剂，填补了现有技术缺乏治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病等不足。使用本发明所述的化合物来治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病时，毒副作用低，口服给药易实施。还可对该化合物进行进一步研究、改造以进行应用。
附图说明
图1：丹参酮Ⅰ对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图2：Beta-Lapachone对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图3：丹参酮IIA磺酸钠对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图4：隐丹参酮对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图5：二氢丹参酮Ⅰ对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图6：左旋紫草素对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图7：CPI-169对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图8：S3I-201对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图9：2-甲氧基-1,4-萘并醌(凤仙花叶提取物)对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图10：白花丹素对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制活性；1：DMSO(阴性对照)，2：化合物分子；3：阳性对照(GRL-0617)。
图11：丹参酮Ⅰ对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶有很强的抑制活性(IC50＝2.21μM)。
图12：丹参酮Ⅰ可以抑制细胞中SARS-CoV-2的复制(EC50＝2.26μM)，且具较低的细胞毒性(CC50>300μM)。
图13：隐丹参酮对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶有很强的抑制活性(IC50＝5.63μM)。
图14：隐丹参酮可以抑制细胞中SARS-CoV-2的复制(EC50＝0.7μM)，且具有较低的细胞毒性(CC50>300μM)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
化合物来源
丹参酮Ⅰ(CAS号：568-73-0)、丹参酮IIA磺酸钠(CAS号：69659-80-9)均购于Approved Drug Library(Target Mol)，
Beta-lapachone(β-拉帕醌，CAS号：4707-32-8)购于Clinic Compound Library(Target Mol)，
隐丹参酮(CAS号：35825-57-1)、二氢丹参酮Ⅰ(CAS号：87205-99-0)、左旋紫草素(CAS:517-88-4)、2-甲氧基-1,4-萘醌(凤仙花叶提取物，CAS:2348-82-5)、白花丹素(CAS：481-42-5)均购于Natural Product Library(Selleck)，
CPI-169(CAS：1802175-07-0)、S3I-201(CAS:501919-59-1)均购于Selleck。
所用阳性对照为GRL-0617抑制剂(购于光远生物)，已知其能够有效抑制冠状病毒木瓜样蛋白酶(具体参见Ratia,K.et al.A noncovalent class of papain-likeprotease/deubiquitinase inhibitors blocks SARS virus replication.Proceedingsof the National Academy of Sciences 105,16119-16124(2008))，其结构式如下所示：
Figure BDA0003046109360000181
实施例1通多体外酶活实验发现丹参酮Ⅰ等10个化合物可显著抑制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的木瓜样蛋白酶活性
体外酶活实验条件具体为：
酶活实验荧光底物：Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC(来源于吉尔生化)，此荧光底物的激发波长和发射波长分别为340nm和460nm。
实验步骤中所用的酶活反应buffer为50mM HEPES,pH 7.5,0.1mg/ml BSA,2mMDTT；酶活反应温度：30℃。
具体实验步骤为：反应起始通过添加木瓜样蛋白酶，木瓜样蛋白酶的终浓度为0.2μM，将50μM的抑制剂(10种小分子化合物：丹参酮I、丹参酮IIA磺酸、β-拉帕醌、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、左旋紫草素、2-甲氧基-1,4-萘醌、白花丹素、CPI-169、S3I-201)溶液与酶活实验荧光底物(Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC，浓度为20μM)加入在60μl反应体系(50mMHEPES,pH＝7.5,0.1mg/ml BSA)中，室温孵育10min，用发射光340nm和激发光460nm来检测荧光底物的反应初始速率，通过与不加药物的对照组初始速率比较，获得抑制率曲线。实验做了3次生物学重复(具体步骤参考Lee,H.,et al.(2019)."Identification and designof novel small molecule inhibitors against MERS-CoV papain-like protease viahigh-throughput screening and molecular modeling."Bioorganic&medicinalchemistry 27(10):1981-1989；Jin,Z.,Du,X.,Xu,Y.et al.Structure of Mpro fromSARS-CoV-2and discovery of its inhibitors.Nature,doi:10.1038/s41586-020-2223-y(2020))。
所得结果如图1-图10所示，图中显示了丹参酮Ⅰ等10个化合物的酶活实验曲线。实验表明丹参酮Ⅰ等10个化合物可显著抑制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的木瓜样蛋白酶活性，明显区别于阴性对照，这10个化合物均对冠状病毒木瓜样蛋白酶有明显抑制活性。
实施例2
通多体外酶活实验发现丹参酮I和隐丹参酮可显著抑制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的木瓜样蛋白酶活性(图11和13)。
体外酶活实验步骤为：200nM终浓度的SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶(参考Zhao Y,DuX,Duan Y,et al.High-throughput screening identifies established drugs asSARS-CoV-2PLpro inhibitors[J].Protein&Cell,2021:1-12.)，不同浓度梯度的抑制剂溶液与20μM的荧光底物(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC)加入在60μl反应体系(50mM HEPES,pH＝7.5,0.1mg ml-1BSA)中，室温孵育10min，用发射光340nm和激发光460nm来检测荧光底物的反应初始速率，通过与不加药物的对照组初始速率比较，获得抑制率曲线。实验做了3次生物学重复。
所得结果如图11和图13所示，丹参酮Ⅰ和隐丹参酮对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶有很强的抑制活性，IC50分别为2.21μM和5.63μM。
实施例3
通过体外细胞病毒实验，发现丹参酮I和隐丹参酮可显著抑制SARS-CoV-2在细胞中的复制能力，且细胞毒性较低。EC50值分别为2.26μM和0.7μM。CC50值均大于300μM。具体结果见图12和图14。
体外细胞病毒实验的详细实验方法如下：
(1)在噬斑法抗病毒试验中，用不同浓度的抑制剂预处理在24孔培养皿中铺好的Vero E6细胞(购于ATCC)1小时后，加入临床分离的病毒株SARS-CoV-2(nCoV-2019BetaCoV/WIV04/2019)(MOI＝0.05)(参考Zhao Y,Du X,Duan Y,et al.High-throughput screeningidentifies established drugs as SARS-CoV-2PLpro inhibitors[J].Protein&Cell,2021:1-12.)，感染1小时。然后，移除病毒-药物混合液，用DMEM培养基清洗两次后，细胞重新加入新的含预处理对应浓度药物和0.9％琼脂糖的培养基。继续培养4天后，细胞被4％的聚甲醛固定30分钟后，用结晶紫染色，观察并计数。所有病毒试验均在生物安全3级实验室完成，并有3次生物学重复。
(2)在细胞活性实验中，Vero E6细胞培养在96孔板中。1天后，将不同浓度的抑制剂加入DMEM培养基中继续1天，然后用CCK8测定法测量存活细胞的相对数量，得出细胞活性数据。所有实验均有3次生物学重复。
体外酶活实验和体外细胞病毒实验的详细实验方法可参见Jin,Z.,Du,X.,Xu,Y.et al.Structure of Mpro from SARS-CoV-2and discovery of itsinhibitors.Nature,doi:10.1038/s41586-020-2223-y(2020).。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。
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Claims (10)

1.选自丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、β-拉帕醌、左旋紫草素、2-甲氧基-1,4-萘醌、CPI-169、S3I-201和白花丹素中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型在制备抗冠状病毒剂、在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物、和/或在制备抑制木瓜样蛋白酶的抑制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药学上可接受的盐为磺酸盐和/或钠盐；
较佳地，所述丹参酮IIA的药学上可接受的盐为丹参酮IIA磺酸钠。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的木瓜样蛋白酶为冠状病毒的木瓜样蛋白酶。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型抑制木瓜样蛋白酶，优选抑制冠状病毒的木瓜样蛋白酶。
5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述的疾病为哺乳动物或者禽类疾病，所述的哺乳动物优选为人、猪和/或猫。
6.如权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述的冠状病毒属于正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)；优选属于α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和/或δ冠状病毒属。
7.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述的冠状病毒选自引起上呼吸道感染的冠状病毒、引起急性呼吸综合征的病毒例如SARS相关冠状病毒、和中东呼吸综合征冠状病毒中的一种或多种；
较佳地，所述引起上呼吸道感染的冠状病毒为人冠状病毒229E、人冠状病毒HKU1、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63和/或小鼠肝炎病毒A59；和/或，所述SARS相关冠状病毒为SARS-CoV或SARS-CoV-2。
8.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒和/或禽传染性支气管炎病毒。
9.一种药物组合物在制备抗冠状病毒剂、在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物、和/或在制备抑制木瓜样蛋白酶的抑制剂中的应用，所述药物组合物包括选自丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、β-拉帕醌、左旋紫草素、2-甲氧基-1,4-萘醌、CPI-169、S3I-201和白花丹素中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型；
较佳地：
所述药学上可接受的盐为磺酸盐和/或钠盐；
和/或，所述丹参酮IIA的药学上可接受的盐为丹参酮IIA磺酸钠；
和/或，所述木瓜样蛋白酶为冠状病毒的木瓜样蛋白酶；
和/或，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体，例如药学上可接受的药用辅料；
和/或，所述的冠状病毒属于正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)；优选属于α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和/或δ冠状病毒属；
和/或，所述的冠状病毒选自引起上呼吸道感染的冠状病毒、引起急性呼吸综合征的病毒例如SARS相关冠状病毒、和中东呼吸综合征冠状病毒中的一种或多种；所述的引起上呼吸道感染的冠状病毒优选为人冠状病毒229E、人冠状病毒HKU1、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63和/或小鼠肝炎病毒A59；所述SARS相关冠状病毒优选为SARS-CoV或SARS-CoV-2；
和/或，所述冠状病毒为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒和/或禽传染性支气管炎病毒。
10.一种套装药盒在制备抗冠状病毒剂、在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物、和/或在制备抑制木瓜样蛋白酶的抑制剂中的应用，所述套装药盒包括选自丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、β-拉帕醌、左旋紫草素、2-甲氧基-1,4-萘醌、CPI-169、S3I-201和白花丹素中的一种或多种的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型；
较佳地：
所述药学上可接受的盐为磺酸盐和/或钠盐；
和/或，所述丹参酮IIA的药学上可接受的盐为丹参酮IIA磺酸钠；
和/或，所述木瓜样蛋白酶为冠状病毒的木瓜样蛋白酶；
和/或，所述的冠状病毒属于正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)；优选属于α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和/或δ冠状病毒属；
和/或，所述的冠状病毒选自引起上呼吸道感染的冠状病毒、引起急性呼吸综合征的病毒例如SARS相关冠状病毒、和中东呼吸综合征冠状病毒中的一种或多种；所述的引起上呼吸道感染的冠状病毒优选为人冠状病毒229E、人冠状病毒HKU1、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63和/或小鼠肝炎病毒A59；所述SARS相关冠状病毒优选为SARS-CoV或SARS-CoV-2；
和/或，所述冠状病毒为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒和/或禽传染性支气管炎病毒。
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