CN113262224A - 奈非那韦在制备防治新冠肺炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及奈非那韦在制备防治新冠肺炎(2019冠状病毒病，COVID‑19)药物中的应用。具体而言，本发明涉及奈非那韦及其药物组合物作为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS‑CoV‑2或2019新型冠状病毒,2019‑nCoV)抑制剂在制备治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒感染引起的呼吸道感染、肺炎等相关疾病的药物中的用途。

Description

奈非那韦在制备防治新冠肺炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地涉及奈非那韦在制备防治新冠肺炎药物中的应用。
背景技术
在急性传染病中，绝大部分都是病毒性传染病，病毒性传染病的发病率高，死亡率也很高。由于检测和诊断手段有限，导致新病毒引发的新疫情爆发往往具有突发性、随机性和不可预测性等特点，一旦爆发，如无有效的防治手段，极易造成大规模流行，严重威胁人民健康生命安全。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2或2019新型冠状病毒, 2019-nCoV)感染可引起新冠肺炎(2019冠状病毒病，COVID-19)。2019-nCoV病毒传播途径未完全掌握，已知能通过飞沫和接触传播，且存在人传人、医务人员感染，一定社区传播风险，且病毒存在变异的可能。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异的预防和治疗方法。
2019-nCoV冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，为具有包膜的单链正义RNA 病毒。和其他已知冠状病毒类似，2019-nCoV冠状病毒也经过吸附、穿入、脱壳、生物合成、子代病毒的组装与释放等几个过程完成子代病毒的增殖。2019-nCoV冠状病毒感染宿主细胞起始于病毒包膜表面的刺突糖蛋白与宿主细胞表面的受体结合，随后发生膜融合，病毒进入宿主细胞，在细胞溶酶体等细胞器作用下，释放出病毒的遗传物质单链正义RNA，在宿主细胞的线粒体、核糖体等蛋白质合成元件以及必须的原料等作用下，翻译产生多聚蛋白，之后，2019-nCoV冠状病毒的两大必需半胱氨酸蛋白酶：木瓜样蛋白酶(papain-likeprotease,PLpro)和3C样蛋白酶 (3C-like protease,3CLpro)在特定位点切割加工多聚蛋白前体，产生多个对病毒生命周期非常重要的非结构蛋白。在这些非结构蛋白的作用下，病毒RNA复制出子代病毒核酸物质，并大量翻译出所需的结构蛋白，完成子代病毒的组装和释放。 2019-nCoV冠状病毒感染细胞的生命周期的任何环节或关键酶均可以作为抗病毒药物的研究靶点，如水解切割多聚蛋白前体的半胱氨酸蛋白酶PLpro和3CLpro，负责完成子代病毒遗传物质复制的RNA聚合酶等。
3CL蛋白酶(3chymotrypsin-like protease,3CLpro)，又称主蛋白酶(Mpro)，是冠状病毒RNA翻译出多聚蛋白pp1a和pp1ab后水解产生多个非结构蛋白过程中的关键蛋白酶，对病毒的复制和感染至关重要，抑制3CL蛋白酶的催化功能可有效抑制病毒多聚蛋白前体的切割，阻断病毒复制，抑制子代病毒生成。3CLpro属于半胱氨酸蛋白酶，是催化单正链RNA病毒前体蛋白水解的关键蛋白酶，对2019-nCoV 等冠状病毒的复制活性具有重要的作用。因此，3CLpro是目前公认的研发抗冠状病毒药物的理想靶点。
目前，针对2019-nCoV冠状病毒导致的严重肺炎疾病尚无特效的疫苗和抗病毒药物。这些感染性疾病严重影响了人们的生命健康，研发效果好的抗病毒药物迫在眉睫。针对2019-nCoV冠状病毒3CLpro开发出低毒高效的抗病毒药物，以满足国内外2019-nCoV冠状病毒感染患者的临床需求，具有重大的社会意义。
综上所述，本领域迫切需要开发针对2019-nCoV冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂用于治疗新型冠状病毒感染引起的肺炎。
发明内容
本发明的目的是提供一种可有效抑制冠状病毒3CL蛋白酶的活性成分及其在抑制冠状病毒方面的新用途。
具体地，本发明提供了奈非那韦及其组合物在抗冠状病毒尤其是新型冠状病毒(2019-nCoV)中的用途。
在本发明第一方面，提供了一种活性成分或含所述活性成分的制剂的用途(或制药用途)，所述的活性成分为奈非那韦或其药学上可接受的盐；
其中，所述的活性成分或含所述活性成分的制剂被用于制备(a)抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)3CL蛋白酶的抑制剂；和/或(b)治疗和/或预防、缓解由 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述的药物还含有选自下组的一种或多种额外活性成分：
(Y1)RNA复制酶抑制剂(如Remdesivir(瑞德西韦或GS-5734))；
(Y2)洛匹那韦(Lopinavir)；
(Y3)利托那韦(Ritonavir)；
(Y4)法匹拉韦；
(Y5)氯喹(Chloroquine,Sigma-C6628)或其药学上可接受的盐(如磷酸氯喹)。
在另一优选例中，所述由2019新型冠状病毒感染引起的相关疾病选自下组：呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
在另一优选例中，所述的活性成分选自下组：奈非那韦、奈非那韦甲磺酸盐。
在另一优选例中，所述的药物还包括选自下组的额外组分：抗逆传录病毒的药物或增强免疫力的药物。
在另一优选例中，所述的组合物或药物包括：口服制剂和非口服制剂。
在另一优选例中，所述的制剂包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂、含片、或滴丸。
在另一优选例中，所述的药物用于降低易感对象的鼻拭子和肛拭子中的 SARS-CoV-2病毒载量。
在另一优选例中，所述的易感对象包括人和非人灵长动物(如猕猴)。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(a)第一活性成分，所述的第一活性成分选自下组：奈非那韦、或其药学上可接受的盐；或其组合；
以及(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为用于抑制2019新型冠状病毒 (2019-nCoV)3CL蛋白酶的药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有：
(a1)第一活性成分，所述的第一活性成分选自下组：奈非那韦、或其药学上可接受的盐；或其组合；
(a2)第二活性成分，所述的第二活性成分选自下组：(Y1)RNA复制酶抑制剂(如Remdesivir(瑞德西韦或GS-5734))；(Y2)洛匹那韦(Lopinavir)；(Y3)利托那韦(Ritonavir)；(Y4)法匹拉韦；(Y5)氯喹(Chloroquine,Sigma-C6628)或其药学上可接受的盐(如磷酸氯喹)、(Y6)上述Y1～Y5的任意组合；
以及(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物的剂型为口服给药或非口服给药剂型。
在另一优选例中，所述的口服给药剂型是片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，或乳剂或糖浆剂。
在另一优选例中，所述的非口服给药剂型是注射剂、针剂、气雾剂、喷雾剂、滴眼液、或滴耳液。
在另一优选例中，所述药物中第一活性成分(单一化合物或多种化合物之和) 的浓度为0.01-100mg/ml，较佳地为0.1-20mg/ml(液态剂型)。
在另一优选例中，所述药物中第一活性成分(单一化合物或多种化合物之和) 的浓度为0.01-1000mg/g，较佳地为0.1-50mg/g(固体剂型)。
在本发明的第三方面，提供了本发明第二方面中所述的药物组合物的用途，它被用于制备(a)抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)3CL蛋白酶的抑制剂；和/ 或(b)治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述由2019新型冠状病毒感染引起的相关疾病选自下组：呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
在本发明的第四方面，提供了一种抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)3CL 蛋白酶的方法，包括步骤：将第一活性成分或含所述第一活性成分的制剂与2019 新型冠状病毒(2019-nCoV)的3CL蛋白酶接触，从而抑制所述3CL蛋白酶的活性；
其中，所述的第一活性成分为奈非那韦或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的抑制方法是体外方法并且是非治疗性的和非诊断性的方法。
在另一优选例中，所述的抑制方法是体内方法并且是治疗性的方法。
在另一优选例中，所述的方法是非治疗性和非诊断性的。
在另一优选例中，所述的方法是体外的。
在另一优选例中，所述的2019-nCoV的3CL蛋白酶是重组的或2019-nCoV表达的3CL蛋白酶。
在另一优选例中，所述的第一活性成分选自下组：奈非那韦、奈非那韦甲磺酸盐。
在本发明的第五方面，提供了一种治疗、预防、和/或缓解由2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的相关疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的第一活性成分或含第一活性成分的制剂，其中所述的第一活性成分为奈非那韦或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述方法还包括：给需要的对象施用安全有效量的第二活性成分，其中
所述的第二活性成分选自下组：(Y1)RNA复制酶抑制剂(如Remdesivir(瑞德西韦或GS-5734))；(Y2)洛匹那韦(Lopinavir)；(Y3)利托那韦(Ritonavir)；(Y4) 法匹拉韦；(Y5)氯喹(Chloroquine,Sigma-C6628)或其药学上可接受的盐(如磷酸氯喹)、(Y6)上述Y1～Y5的任意组合；
在另一优选例中，所述的对象为哺乳动物，较佳地为灵长目哺乳动物，更佳地为人。
在另一优选例中，所述的第一活性成分选自下组：奈非那韦、或奈非那韦甲磺酸盐。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了奈非那韦针对2019-CoV Mpro的对接模式。图中，(a)白色表面为 2019-nCoV Mpro的结合口袋。青色为奈非那韦，灰白色为TG-0205221(蛋白质晶体结构(PDB ID：2GX4)中的一种SARS-CoV Mpro蛋白酶抑制剂)；(b)TG-0205221 (灰白色)和奈非那韦(青色)的叠合；(c)TG-0205221和SARS Mpro(PDB ID:2GX4) 的结合模式；(d)奈非那韦和2019-nCoVMpro的对接模式。黄色虚线显示了关键的作用距离
Figure BDA0002942877960000051
图2显示了甲磺酸奈非那韦(Nelfinavir Mesylate)在体外抗2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的实验结果。结果表明，3-30μM甲磺酸奈非那韦，在体外有显著的抗病毒作用。
图3显示了甲磺酸奈非那韦(Nelfinavir Mesylate)在细胞水平对 2019-nCoV的抗病毒剂量-效应曲线。结果表明，IC50＝3.06μM，IC90＝6μM。
图4显示了甲磺酸奈非那韦(Nelfinavir Mesylate)给药组可以显著降低猴子的体温(相当于改善临床症状)；对体重无影响。
图5显示了甲磺酸奈非那韦(Nelfinavir Mesylate)给药组可以显著降低鼻拭子(图5a)和肛拭子(图5c)的病毒载量；但不能显著降低咽拭子(图5b)的病毒载量。可以显著降低肺和肾脏的病毒载量(图5d)。
图6显示了甲磺酸奈非那韦(Nelfinavir Mesylate)给药组可改善全身主要器官的病理组织损伤。
图7显示了甲磺酸奈非那韦(Nelfinavir Mesylate)给药组的血药浓度。第0、1、3、7天为最高血药浓度(平均值为0.55μM)，第5天为最低血药浓度(为0.26 μM)。作为对比，在临床给药剂量1250mg BID情况下，人的最高血药浓度为 7.04μM，最低血药浓度(Ctrough,Morning)为3.87μM(VIRACEPT FDA Package Insert Reference ID:3986049)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发了一类可有效抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)等冠状病毒的3CL蛋白酶的活性成分。实验表明，本发明的活性成分(奈非那韦或其药学上可接受的盐)可高效地抑制2019 新型冠状病毒(2019-nCoV)等冠状病毒的3CL蛋白酶的活性，并抑制2019-nCoV冠状病毒的复制和活力。在猕猴新冠肺炎模型中,本发明的活性成分可出乎意料地显著降低鼻拭子和肛拭子的SARS-CoV-2病毒载量；可显著降低肺和肾脏的 SARS-CoV-2病毒载量并可改善全身主要器官的病理组织损伤。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明揭示了奈非那韦及其组合物在抗冠状病毒的用途，尤其是在抗2019-nCoV病毒治疗中的用途。奈非那韦及其组合物对冠状病毒复制必不可少且高度保守的3CL水解酶具有优良的抑制作用，在猕猴新冠肺炎模型中显示良好的效果，具有良好的临床应用前景。
术语
如本文所用，“本发明的活性化合物”、“本发明的抑制3CL蛋白酶的活性化合物”可互换使用，指具有优异的3CL蛋白酶抑制活性的化合物，尤其是奈非那韦或其药学上可接受的盐、或其组合。
如本文所用，“本发明的制剂”指含有本发明活性化合物的制剂。
如本文所用，术语“包括”或其变换形式如“包含”或“包括有”等等，被理解为包括所述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
如本文所用，术语“新型冠状病毒”、“2019-nCoV”或“SARS-CoV-2”可互换使用，该2019新型冠状病毒是已知感染人的第7种冠状病毒，并且造成新冠肺炎(COVID-19)，是威胁全球人类健康的严重传染性疾病之一。
冠状病毒和3CL蛋白酶
冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四属。
目前已知的感染人的冠状病毒中，HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和2019-nCoV均为β属冠状病毒。
该类病毒的基因组是一条单股正链RNA，是基因组最大的RNA病毒之一，编码包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制的初始阶段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白 (Polyprotein)，随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如RNA聚合酶和解旋酶)和结构蛋白(如刺突蛋白)及辅助蛋白。
3CL蛋白酶(3Chymotrypsin-like protease,3CLpro)是冠状病毒中负责切割前体蛋白的主蛋白酶(所以又称为Mpro)，对病毒的复制不可或缺。
3CLpro属于半胱氨酸水解酶，在各类冠状病毒中高度保守，与小RNA病毒中的3C蛋白酶也比较相似，而人体中却没有与其相似的蛋白酶，因而是研发广谱抗单正链RNA病毒药物的理想靶点。
本发明的活性化合物和活性成分
在本发明中，提供了一种可有效抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)等冠状病毒复制的活性成分。该活性成分选自下组：奈非那韦、或其药学上可接受的盐、或其晶体、或其溶剂化物。
奈非那韦(Nelfinavir)的结构式为：
Figure BDA0002942877960000081
该化合物的分子式为C32H45N3O4S，白色粉末状，分子量为567.78，CAS编号为159989-64-7。通用名为奈非那韦，是一种口服可生物利用的人类免疫缺陷病毒HIV-1蛋白酶抑制剂(Ki＝2nM)，是继沙奎那韦、利托那韦和英地那韦后，第四个FDA批准用于治疗艾滋病的药物。
一种优选的奈非那韦的药学上可接受的盐为其甲磺酸盐(即奈非那韦甲磺酸盐)：
Figure BDA0002942877960000082
该甲磺酸盐的分子式为C33H49N3O7S2，白色粉末状，分子量为663.89，CAS编号为159989-65-8。该化合物的通用名为甲磺酸奈非那韦(Nelfinavir mesilate)。
试验表明，本发明的活性成分可有效地抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV) 的3CL蛋白酶，从而抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的复制，进而预防、治疗和/或缓解2019-nCoV相关疾病。
如本文所用，“本发明的活性化合物”、“本发明的抑制3CL蛋白酶的活性化合物”可互换使用，指具有优异的3CL蛋白酶抑制活性的化合物，包括奈非那韦、或其药学上可接受的盐、或其晶体、或其溶剂化物。
应理解，本发明的活性成分包括本发明的抑制3CL蛋白酶的活性化合物、或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体或外消旋体、或其前药。应理解，本发明的活性成分还包括本发明的活性化合物的晶型、无定形化合物、以及氘代化合物等形式。
所述“药学上可接受的盐”为本发明的活性化合物与无机酸或有机酸反应形成常规的无毒盐。例如，常规的无毒盐可通过本发明的活性化合物与无机酸或有机酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸等，所述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者本发明的活性化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者本发明的活性化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸或磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸或乙磺酸形成的对应的有机酸盐。
此外，本发明的活性成分还特别适合与其他抗病毒的药物联用。代表性的其他的抗病毒药物包括(但并不限于)：逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、辅助受体拮抗剂、逆转录病毒整合酶抑制剂、病毒吸附抑制剂、特异性病毒转录抑制剂、抗体、或其组合。
本发明的活性成分可抑制2019-nCoV等新型冠状病毒的感染活性。因此，当在治疗上施用或给予本发明的的活性成分时，可抑制3CL蛋白酶活性，从而抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的感染，进而达到抗病毒作用。
药物组合物和应用
本发明还提供了以本发明的抑制3CL蛋白酶的活性化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其提取物、或其药材中的一种或多种的混合物为有效成分在制备治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒感染引起的呼吸道感染、肺炎等相关疾病的药物中的用途。
本发明所提供的药物组合物优选含有重量比为0.001-99wt％的活性成份，优选的比例是本发明的活性化合物作为活性成分占总重量的0.1wt％～90wt％或1wt％～50wt％，其余部分为药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。
需要的时候，在本发明药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。
本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制剂配方的单位计量中通常包含0.05-400mg本发明的活性化合物，优选地，制剂配方的单位计量中包含1mg-500mg本发明的活性化合物。
本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最优选日剂量为 0.01-400mg/kg体重，一次性服用，或0.01-200mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
本发明的药物或抑制剂可通过各种不同方式施用，例如可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹导入机体。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明活性化合物可高效地抑制2019-nCoV 3CL蛋白酶，IC50值为约3μM， IC90值为约6μM。
(b)本发明活性化合物的毒副作用低，成药性好。奈非那韦是抗艾滋病老药，安全性高，对于13岁及以上的成人和青少年，推荐剂量为每天两次1250mg或每天三次750mg。2-13岁儿童的建议剂量为每天3次25-35mg/kg或每天两次45至55 mg/kg。这提示着其在抗新冠肺炎领域有很好的药用前景。
(c)200mg/kg Nelfinavir在猕猴新冠肺炎模型中预防给药后，在血药浓度仅为临床给药浓度十分之一的情况下，可显著降低猴子的体温；显著降低鼻拭子和肛拭子的病毒载量；可以显著降低肺和肾脏的病毒载量；可改善全身主要器官的病理组织损伤。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：奈非那韦针对2019-nCoV Mpro蛋白酶的计算模拟
以2GX4为模板，利用SWISS-MODEL模建2019-nCoV Mpro蛋白酶的蛋白酶的三维结构，将奈非那韦对接进去，对接打分为-9.18kcal/mol，与2GX4中的配体TG-0205221和靶标蛋白结合作用模式的三维相似性为70.2％。
结果如图1所示。该结果说明奈非那韦在计算模拟上可以与2019-nCoV Mpro蛋白酶有很好的结合，并且有较高可信度的结合模式。
将对接复合物利用Amber16进行5纳秒的分子动力学模拟，然后利用 MM/GBSA和SIE方法计算结合自由能，得到的能量分别为-24.69±0.52 kcal/mol和-9.42±0.04kcal/mol，具体结果列于表1和表2。
MM/GBSA方法计算得到的奈非那韦和2019-nCoV Mpro的结合自由能及其组成示于表1。
表1.MM/GBSA方法计算得到的结合自由能及其组成*
Figure BDA0002942877960000111
*:统计结果来自于0.5-5纳秒的分子动力学轨迹.从中均衡提取500帧用于MM/GBSA计算，50帧用于熵计算。
SIE方法计算得到的奈非那韦和2019-nCoV Mpro的结合自由能组成示于表 2。
表2.SIE方法计算得到的结合自由能及其组成*
Figure BDA0002942877960000112
Figure BDA0002942877960000121
*:结合自由能计算公式:ΔGbind＝0.1048*(EC+Evdw+ΔGR bind+Ecavity)-2.89. Ecavity＝γΔMSA.统计结果来自于0.5-5纳秒的分子动力学轨迹.从中均衡提取500 帧用于SIE计算。
实施例2：奈非那韦针对2019-nCoV Mpro蛋白酶的实验测试
在本实施例中，测定化合物对2019-nCoV Mpro蛋白酶(SARS-CoV-2 3CLpro) 的抑制活性，方法为：利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transferFRET)技术测定针对3CL蛋白酶的抑制剂的酶水平抑制活性。整个酶促反应体系的体积为120μL，蛋白酶的终浓度为30nM，底物终浓度为 20μM。反应体系的缓冲液包括50mM TrispH7.3、1mM EDTA。在96孔板中加入2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的3CL蛋白酶和不同浓度的测试化合物， 30℃孵育10min，加入底物并迅速放入酶标仪中读数。激发光和发射光分别为 320nm和405nm。测试时间为10min，每隔30s读一次荧光值，拟合出反应速率，并与对照组(DMSO)比较，计算抑制率。
2019-nCoV蛋白酶活性抑制实验结果示于表3。
表3.不同浓度Nelfinavir对2019-nCoV Mpro蛋白酶的抑制率
说明 300μM 200μM
Nelfinavir原型 70.8％ 65.8％
Nelfinavir甲磺酸盐 75.1％ 62.5％
*：两次测试结果的平均。
结果表明，奈非那韦或其盐是2019-nCoV Mpro蛋白酶的抑制剂。
实施例3：奈非那韦在细胞水平对2019-nCoV的抑制实验
以非洲绿猴肾细胞Vero为模型，在24孔培养板中，用2019新型冠状病毒株100TCID50感染细胞3小时后，吸弃含病毒的培养液，并用PBS洗细胞2 次，然后加入含不同浓度药物的培养基，继续培养48小时。然后吸取细胞培养上清液，磁珠法抽提病毒核酸，并采用新冠病毒荧光定量PCR试剂盒分析奈非那韦处理组细胞培养液中病毒的含量。
结果如图2、图3和表4所示。
表4.甲磺酸奈非那韦的体外抗病毒实验结果(细胞实验)
Figure BDA0002942877960000131
如图2和表3所示，随着随着奈非那韦的浓度增加，病毒数量相应减少，从而导致扩增获得可检测的荧光所需的Ct值也相应增加。
如图3所示，奈非那韦在细胞水平可以显著抑制2019-nCoV，其IC50为 3.06μM，其IC90为约6.0μM。
此外，在独立进行的细胞毒性实验(采用非洲绿猴肾细胞Vero)中，当培养体系中加入100μM甲磺酸奈非那韦时，观察到约60％的细胞死亡；在30μM甲磺酸奈非那韦时，观测到不到10％的细胞死亡，这表明，CC50值为约为70μM。
实施例4奈非那韦猕猴药效实验
4.1伦理声明和实验动物
所有动物实验均经中国科学院昆明动物研究所动物伦理委员批准(批准证明编号为：IACUC20016)。实验动物的选择和实验操作均遵循实验动物伦理委员会的指导意见和原则，保证实验动物福利。6只猕猴均来源于中国科学院昆明动物研究所实验动物中心，饲养在相近且独立的灵长类动物饲养笼内，且便于动物间交流。动物房间温湿度恒定，循环光照(亮12小时/黑12小时)；每天 24小时监控实验动物；在实验过程中每天饲喂2次，主食为灵长类动物专用颗粒饲料，青饲料喂为苹果，自由饮水。国家昆明高等级生物安全灵长类动物实验中心经中国合格评定国家认可委员会认可，并根据中国科学院昆明动物研究所生物安全委员批准的标准操作规程进行相关操作。
4.2研究设计
实验使用6只青年健康猕猴(雄性，年龄3-6岁)，攻毒途径为组合方式，滴鼻(0.4mL/鼻孔)和气管内(1.2mL，纤维支气管镜)，总病毒滴度为 1×107TCID50mL，使用无菌0.9％生理盐水稀释。实验动物经大腿肌肉注射舒泰 50麻醉，然后按顺序检测体温、体重；顺序采集鼻拭子、咽拭子、肛拭子和外周静脉血样本，静脉血采用肝素抗凝，检测和样本采集时间分别为攻毒前第0 天与攻毒后1、3、5、7天。在攻毒后第8天进行安乐死，并采集心脏、肝脏、脾脏、左肺下叶、肾脏、胃、空肠、结肠、膀胱、胸腺和肱二头肌组织。
实验动物分组为甲磺酸奈非那韦给药组(3只)和对照组(3只)，给药量以体重为参考，剂量为200mg/kg，对照组给予0.5％CMC-Na混悬液，5mL/kg。给药时间为早10:00，晚20:00，时间间隔10小时。给药次数为2次/天。给药方式为经鼻胃管胃部给药，每次给药前预先给予苹果麦片粥25ml/只，然后给予药物，最后给予苹果麦片粥5mL/只。给药组在攻毒前给药3次，连续给药周期为攻毒前第1天和第0天，攻毒后第1～7天；对照组在攻毒后6小时给药，连续给药周期为攻毒前第0天1次，攻毒后第1～7天。
4.3病毒株和细胞
实验采用病毒为新型冠状病毒107株 (http://nmdc.cn/resource/ncov/genome/detail/NMDCN0000HUI)，由中国广东省疾病预防控制中心提供，病毒株经Vero-E6细胞株扩培，半数组织培养感染剂量测定方法为Reed-Muench法。
4.4样本检测
采用试剂盒(Roche德国)提取拭子总RNA，组织样本RNA采用TRIzol试剂法提取(Thermo USA)。病毒RNA检测采用探针一步法实时定量PCR试剂盒检测 (TOYOBO，Japan)。每个检测样本稀释参照中国计量科学研究院标准，最后计算每一个样本的拷贝数。
4.5组织病理
感染猕猴组织样本采用4％多聚甲醛固定7天后，经石蜡包埋，切片(切片4 微米)等程序后进行HE染色。
4.6血药浓度
采用液质联用法测定猴血浆样品中奈非那韦的浓度，样品前处理1：3无水乙醇沉淀，外标法定量。
液相条件
HPLC：1290Infinity II，Agilent
色谱柱：：Agilent Eclipse Plus C18(2.1*50mm，5μm)；
流动相：溶剂A：H2O(含0.4‰甲酸)，溶剂B：CH3CN(含0.4‰甲酸)。
进样量：3μL
洗脱梯度条件见表5：
表5色谱洗脱条件
时间(min) A相比例(％) B相比例(％) 流速(mL/min)
0～1.0 90 10 0.3
1.1～2.5 35 65 0.3
2.6～4.0 0 100 0.3
4.1～6.0 90 10 0.3
质谱条件
API4000 Q trap质谱，采用正离子MRM扫描，奈非那韦568.3→330.2(打碎能量45V)。标曲浓度：1.37～3000nM。
表6质控样品的准确性和精密度
Figure BDA0002942877960000151
4.7数据分析
采用统计分析软件R进行数据分析。对于体温、体重、拭子病毒载量等，使用Two-way mixed ANOVA进行组间比较；如果不满足ANOVA的条件，则采用 Mann-Whitney U test进行比较。对于组织病毒载量和组织病理，使用t-test 或Mann-Whitney U test进行比较。P值＜0.05判定为具有统计学差异。
如图4所示，甲磺酸奈非那韦给药组可以显著降低猴子的体温(相当于改善临床症状)，但同时不影响猕猴的体重，有良好的临床应用前景。
如图5所示，甲磺酸奈非那韦给药组可以显著降低鼻拭子和肛拭子的病毒载量；但不能显著降低咽拭子的病毒载量；也可以显著降低肺和肾脏的病毒载量。
如图6所示，甲磺酸奈非那韦给药组可改善全身主要器官的病理组织损伤。
如图7所示，甲磺酸奈非那韦给药组的血药浓度测试发现，本实施例中，当以200mg/kg的甲磺酸奈非那韦浓度对猕猴预防给药后，血药浓度仅为临床给药浓度的十分之一。
上述实验结果表明，在活体猕猴实验模型中，奈非那韦或其药学上可接受的盐可以在较低的血药浓度的情况下达到较好的预防和/或治疗新型冠状病毒的效果。
讨论
2019n-CoV-3CLpro与SARS-CoV-3CLpro的序列等同性高达96％。2003年 SARS-CoV后针对SARS-CoV-3CLpro设计和发现了多个抑制剂，其多为共价作用的类肽和多肽抑制剂，同时有少量杂环酯类、吡唑类及大环类的非共价抑制剂见报道。这些已知抑制剂的生物活性主要通过体外酶水平检测，少量抑制剂在细胞水平具有一定的抑制效率(IC50多为微摩尔级别)。
2004年发现奈非那韦在细胞水平可以抑制SARS-CoV的复制(Biochem.Biophys.Res.Commun.2004,318(3),719-25)，2005年发现奈非那韦针对 SARS-CoV Mpro的IC50为46μM(Biochem.Biophys.Res.Commun.2005,333(1), 194-199)。
然而，后期的进一步研究表明，奈非那韦对SARS-CoV的动物模型是无效的(Antivir.Chem.Chemother.2006,17(5),275-84)，主要原因在于细胞上活性太差。奈非那韦在Visual assay实验中，IC50＝3.5μM，CC50＝9.5μM，计算得到的治疗指数仅为SI＝3。而在NR assay中，奈非那韦的IC50＝3.5μM，CC50＝3.5μM，计算得到的治疗指数为SI＝1。
在本发明中，出乎意料的是，针对2019-nCoV的实验结果表明，奈非那韦的IC50＝3.06μM，CC50＝70μM，治疗指数SI>20，具有非常优异的抗2019新型冠状病毒(2019-nCoV)活性。
此外，奈非那韦针对SARS-CoV的IC90为40μM，而本发明的实验表明奈非那韦针对2019-nCoV的IC90仅为6μM，两者相差6倍以上。
本发明的研究表明，与针对SARS-CoV相比，针对2019-nCoV时，奈非那韦具有出乎意料的高治疗指数和更优异的IC90值，这些结果提示，奈非那韦具有对2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的更为显著的抗病毒活性和用药安全性。此外，这些结果也提示2019新型冠状病毒(2019-nCoV)与以往的冠状病毒(如 SARS)的蛋白(尤其是3CL水解酶)相比，在结构和活性等方面存在不同。
在本发明之前，奈非那韦或其药学上可接受的盐对2019新型冠状病毒 (2019-nCoV)3CL水解酶的抑制作用尚未见报道。
在本发明之前，在猕猴的新冠肺炎模型中，没有一个化学药物可以降低拭子的病毒载量，而本发明活性成分(奈非那韦或其药学上可接受的盐)可出乎意料地显著降低鼻拭子和肛拭子的SARS-CoV-2病毒载量，并显著降低肺和肾脏的 SARS-CoV-2病毒载量并可改善全身主要器官的病理组织损伤。
在本发明中，本发明人首次公开了奈非那韦或其药学上可接受的盐对 2019-nCoV-3CLpro具有显著的抑制作用，IC50和IC90达到个位数微摩尔级别。此外，本发明人的研究还提示，奈非那韦还可通过作用于多靶标对SARS-CoV-2 的感染和复制起到有效的抑制作用，尤其是鼻拭子和肛拭子的SARS-CoV-2病毒载量下降一方面提示本发明活性成分的治疗效果显著，另一方面也可降低 SARS-CoV-2病毒进一步传染的风险。
因此，奈非那韦或其药学上可接受的盐具有优异的抗2019新型冠状病毒 (2019-nCoV)活性，具有良好的临床应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种活性成分或含所述活性成分的制剂的用途，其特征在于，所述的活性成分为奈非那韦或其药学上可接受的盐；
并且，所述的活性成分或含所述活性成分的制剂被用于制备(a)抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)3CL蛋白酶的抑制剂；和/或(b)治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的相关疾病的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述由2019新型冠状病毒感染引起的相关疾病选自下组：呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的活性成分选自下组：奈非那韦、奈非那韦甲磺酸盐。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还包括选自下组的额外组分：抗逆传录病毒的药物或增强免疫力的药物。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物或药物包括：口服制剂和非口服制剂。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：
(a1)第一活性成分，所述的第一活性成分选自下组：奈非那韦、或其药学上可接受的盐；或其组合；
(a2)任选的第二活性成分，所述的第二活性成分选自下组：(Y1)RNA复制酶抑制剂(如Remdesivir(瑞德西韦或GS-5734))；(Y2)洛匹那韦(Lopinavir)；(Y3)利托那韦(Ritonavir)；(Y4)法匹拉韦；(Y5)氯喹(Chloroquine,Sigma-C6628)或其药学上可接受的盐(如磷酸氯喹)、(Y6)上述Y1～Y5的任意组合；
以及(b)药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为用于抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)3CL蛋白酶的药物组合物。
8.一种权利要求6所述的药物组合物的用途，它被用于制备(a)抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)3CL蛋白酶的抑制剂；和/或(b)治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的相关疾病的药物。
9.一种抑制2019新型冠状病毒(2019-nCoV)3CL蛋白酶的方法，其特征在于，包括步骤：将第一活性成分或含所述第一活性成分的制剂与2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的3CL蛋白酶接触，从而抑制所述3CL蛋白酶的活性；
其中，所述的第一活性成分为奈非那韦或其药学上可接受的盐。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，与2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的3CL蛋白酶接触的奈非那韦或其药学上可接受的盐的浓度为2-20μM，较佳地为3-10μM(或在IC50和IC90之间)。
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