CN117603210B - 靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂及其在制备抗新冠病毒药物中的应用 - Google Patents
靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂及其在制备抗新冠病毒药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公布了靶向抑制RNAm6A甲基转移酶活性的抑制剂及其在制备抗新冠病毒药物中的用途。本发明通过计算机辅助高通量筛选技术成功找到靶向抑制RNAm6A甲基转移酶活性的小分子，并用实验证明Onvansertib和Vilazodone能抑制SARS‑CoV‑2病毒的复制，通过靶向结合METTL3蛋白从而抑制其甲基转移酶活性，且具有较低的细胞毒性和较好的抗病毒活性。本发明证明Onvansertib和Vilazodone是靶向抑制RNAm6A甲基转移酶活性的抑制剂且可以作为抗新冠病毒的候选药物。Onvansertib和Vilazodone属于老药新用，安全可靠，也为抗击新冠病毒提供了新的策略和思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂及其在制备抗新冠病毒药物中的应用。
背景技术
目前，一些针对新型冠状病毒自身蛋白的抗病毒药物研发取得了重要进展，但病毒可能通过缺失或突变以拮抗上述药物的抗病毒作用。随着临床实验的不断扩展，越来越多研究指出，目前用于临床治疗的药物存在作用机制不明、抗病毒活性不强、药代动力学性质不佳等问题。此外，不断出现的SARS-CoV-2变异株不但给有效化合物的疗效和安全性等带来了挑战，同时也为新药研发带来了困难。
SARS-CoV-2属于RNA病毒，其基因组稳定性差，突变率高。自2019年以来，已经演化出多种突变体，是导致抗病毒药物、疫苗和中和抗体保护效果减弱的主要原因。因此，针对病毒蛋白或RNA序列的抗病毒药物研发面临着巨大挑战。与病毒相比，宿主基因组稳定性高，突变率低；并且在漫长的进化过程中，宿主细胞已经形成了一套保守且广谱的抗病毒分子调控机制，其中RNA m6A修饰及其相关蛋白酶在调节SARS-CoV-2介导的感染和COVID-19疾病进展中发挥着关键性调节作用。研究表明，RNA m6A修饰允许SARS-CoV-2病毒逃逸宿主的天然免疫反应，从而在感染个体的肺部创造一个隐蔽地带，以促进疾病恶化。METTL3作为核心的RNA m6A修饰甲基转移酶，参与催化多种病毒RNA分子的m6A修饰生成，从而调节病毒基因组复制、转录和翻译等。近期研究发现，METTL3作为催化SARS-CoV-2RNA m6A修饰形成的关键酶，对SARS-CoV-2的生命周期调控及宿主细胞反应至关重要。在SARS-CoV-2感染的早期阶段，病毒进入宿主细胞后生成5'-磷酸化的病毒RNA，随后METTL3催化其生成m6A修饰以减少RIG-I对其的识别，从而降低炎症基因的激活和下游天然免疫信号通路响应。病毒基因组利用宿主细胞成分逃避天然免疫反应，并且病毒RNA m6A修饰在病毒逃避宿主天然免疫识别和反应中发挥着重要作用，该机制的发现可为抗病毒治疗提供新的靶点和治疗策略。
METTL3已被证明是SARS-CoV-2病毒复制的关键酶，在抗病毒治疗中发挥重要作用，因此，将其作为目的蛋白，建立高通量药物小分子筛选平台，以获得新的抗冠状病毒药物具有重要意义，同时可为后续联合用药研究提供完善的分子调控机制和理论依据。
奥文色替，英文别名Onvansertib(PCM-075)和1-(2-hydroxyethyl)-8-((5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2-(trifluoromethoxy)phenyl)amino)-4,5-dihydro-1H-pyrazolo[4,3-h]quinazoline-3-carboxamide，是一款新型PLK1抑制剂。研究者在2021年ASCO胃肠道研讨会(GI)上公开了其二线治疗KRAS阳性的转移性结直肠癌患者的疗效。此外，Onvansertib具有抑制MYC扩增的G3型髓母细胞瘤增殖并增强其放疗敏感性的作用；因此Onvansertib可作为单药和/或联合放疗，用于治疗该亚型髓母细胞瘤。Onvansertib是一类小分子化合物，相对分子质量为532.52，分子式C24H27F3N8O3，结构式如下
维拉佐酮，英文别名Vilazodone、UNII-S239O2OOV3和5-[4-[4-(5-Cyano-1H-indol-3-yl)butyl]-1-piperazinyl]-2-benzofurancarboxamidehydrochloride，被用于治疗重度抑郁症。Vilazodone是一类小分子化合物，相对
分子质量为441.52，分子式C26H27N5O2，结构式如下
经检索，在现有技术中，化合物Onvansertib、Vilazodone均没有被报道过有抗新冠病毒的作用，也没有报道过其可靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性。
发明内容
鉴于此，本发明提供靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂及其在制备抗新冠病毒药物中的应用。
靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂，其特征在于：所述的靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂为化合物Onvansertib和/或Vilazodone，所述的Onvansertib为4,5-二氢-1-(2-羟基乙基)-8-[[5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-(三氟甲氧基)苯基]氨基]-1H-吡唑并[4,3-H]喹唑啉-3-甲酰胺，所述的Vilazodone的为5-(4-[4-(5-氰基-1H-吲哚-3-基)丁基]哌嗪-1-基)苯并呋喃-2-甲酰胺盐酸盐。
本发明还保护所述的靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂在制备抗新冠病毒药物中的应用。
进一步地，所述的抗新冠病毒药物通过靶向结合METTL3蛋白从而抑制RNA m6A甲基转移酶活性。
优选地，所述的药物为包含靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂。
进一步地，所述的药物为在其药效上可接受的。
本发明首先在Huh-7、Caco-2、Calu-3细胞系中验证敲低METTL3基因确实能够显著抑制SARS-CoV-2原始病毒株的复制；随后通过分子对接和分子动力学拟合分析发现Onvansertib和Vilazodone具备靶向结合METTL3蛋白的能力；进一步联合镍柱亲和层析蛋白纯化技术、表面等离子共振实验和细胞热位移实验，本发明证实了Onvansertib和Vilazodone在分子和细胞水平均可靶向结合METTL3蛋白；最后利用抗甲基转移酶活性实验，本发明证实它们均可抑制甲基转移酶METTL3与底物SAM的结合，从而削弱其甲基转移酶活性。证明化合物Onvansertib或Vilazodone可靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性。
在体外抗原始病毒株活性评估中，Onvansertib和Vilazodone在Huh-7、Caco-2和Calu-3细胞中均表现出较低的细胞毒性和较好的抗病毒效果：在Huh-7细胞中EC50分别为2.763±0.211μM、3.270±0.077μM，CC50分别为123.131±12.573μM、199.151±23.542μM；在Caco-2细胞中EC50分别为1.778±0.357μM、2.279±0.407μM，CC50均大于200μM；在Calu-3细胞中EC50分别为1.843±0.386μM、2.301±0.381μM，CC50均大于200μM。此外，在Caco-2细胞中，这两个药物对Omicron BA.2突变株同样具备较好的抗病毒效果，EC50分别为1.105±0.202μM、1.023±2.090μM。上述结果表明，Onvansertib和Vilazodone均可通过抑制METTL3甲基转移酶活性，发挥广谱的抗SARS-CoV-2病毒的作用。此外，Onvansertib和Vilazodone具备和现有抗SARS-CoV-2小分子药物(Remdesivir和Nirmatrelvir)，以及m6A甲基转移酶阳性抑制剂STM2457相当的抗病毒活性，并且对原始病毒株及Omicron BA.2的抗病毒活性显著优于现有抗SARS-CoV-2小分子药物Molnupiravir。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明通过靶向宿主的RNA m6A修饰甲基转移酶METTL3，使用计算机辅助高通量筛选技术成功找到了一些能够竞争性抑制METTL3与底物SAM结合的小分子药物，从而有效抑制新冠病毒复制，不仅实现了“老药新用”的目的，也为抗新冠病毒提供了新的策略和思路。此外，这种方法为研究和开发其他疾病的药物提供了新的方向和途径，具有广阔的应用前景。
2)本发明为深入了解SARS-CoV-2的生物学机制和药物靶点提供了理论支持，并为寻找有效的抗病毒药物和治疗手段提供了指导，具有重要的全球公共卫生意义。
附图说明
图1为在Huh-7细胞中METTL3正向调节SARS-CoV-2原始病毒株病毒的复制。注：图1中A免疫印迹：使用shRNA在Huh-7细胞中敲低METTL3后，通过特定的抗体对METTL3的表达进行了Westernblot检测；图1中B为CCK8实验：对敲低了METTL3基因的Huh-7细胞进行活力检测；图1中C为实时荧光定量PCR：使用shRNA敲低Huh-7细胞中的METTL3，从感染SARS-CoV-2原始病毒株的Huh-7细胞中提取上清RNA，使用针对N基因的特异引物，通过RT-qPCR定量检测SARS-CoV-2RNA。数据统计采用t-test分析，差异有统计学意义：P<0.0001。
图2为在Caco-2细胞中METTL3正向调节SARS-CoV-2原始病毒株病毒的复制。注：图2中A免疫印迹：使用shRNA在Caco-2细胞中敲低METTL3后，通过特定的抗体对METTL3的表达进行了Western blot检测；图2中B为CCK8实验：对敲低了METTL3基因的Caco-2细胞进行活力检测；图2中C为实时荧光定量PCR：使用shRNA敲低Huh7细胞中的METTL3，从感染SARS-CoV-2原始病毒株的Caco-2细胞中提取上清RNA，使用针对N基因的特异引物，通过RT-qPCR定量检测SARS-CoV-2RNA。数据统计采用t-test分析，差异有统计学意义：P＝0.0012。
图3为在Calu-3细胞中METTL3正向调节SARS-CoV-2原始病毒株病毒的复制。注：图3中A为免疫印迹：使用shRNA在Caco-2细胞中敲低METTL3后，通过特定的抗体对METTL3的表达进行了Western blot检测；图3中BCCK8实验：对敲低了METTL3基因的Calu-3细胞进行活力检测；图3中C实时荧光定量PCR：使用shRNA敲低Calu-3细胞中的METTL3，从感染SARS-CoV-2原始病毒株的Calu-3细胞中提取上清RNA，使用针对N基因的特异引物，通过RT-qPCR定量检测SARS-CoV-2RNA。数据统计采用t-test分析，差异有统计学意义：P＝0.027。
图4为计算虚拟筛选获得METTL3候选抑制剂Onvansertib和Vilazodone。注：图4中A为计算虚拟筛选流程；图4中B和C分别为Onvansertib和Vilazodone结构式；图4中D,E分别分子对接获得的Onvansertib和Vilazodone与METTL3的相互作用。
图5为Onvansertib、Vilazodone、SAM与METTL3/METTL14相互作用的表面等离子体共振传感图。注：图5中A为Onvansertib与METTL3/METTL14相互作用的表面等离子共振传感图；图5中B为Vilazodone与METTL3/METTL14相互作用的表面等离子共振传感图；图5中C为SAM与METTL3/METTL14相互作用的表面等离子共振传感图。
图6为Onvansertib和Vilazodone对METTL3蛋白热稳定性的影响。注：图6中A为Onvansertib和Vilazodone对METTL3蛋白热稳定性的影响的免疫印迹图；图6中B为Onvansertib和Vilazodone对METTL3蛋白热稳定性的影响的溶解曲线图，DMSO为溶媒对照组。
图7为Onvansertib和Vilazodone抑制METTL3甲基转移酶活性。注：数据统计采用单因素方差分析，差异有统计学意义：P<0.005。
图8为Onvansertib和Vilazodone在Huh-7细胞中的抗SARS-CoV-2原始病毒株活性。注：Onvansertib和Vilazodone在Huh-7细胞中的抗SARS-CoV-2原始病毒株活性。注：图8中A，B分别为免疫印迹：SARS-CoV-2感染Caco-2细胞后，用不同浓度的Onvansertib(A)、Vilazodone(B)处理细胞，提取胞内蛋白，用免疫印迹检测病毒的N蛋白；PC孔感染SARS-CoV-2之后加了等量的药物溶剂DMSO，NC孔只加了等量的药物溶剂DMSO；图8中C为Onvansertib、Vilazodone在不同的浓度下对病毒N基因的抑制情况；图8中D为Onvansertib和Vilazodone在不同浓度下对Caco-2细胞的毒性。
图9为Onvansertib和Vilazodone在Caco-2细胞中的抗SARS-CoV-2原始病毒株活性。注：图9中A，B免疫印迹：SARS-CoV-2感染Caco-2细胞后，用不同浓度的Onvansertib(A)、Vilazodone(B)处理细胞，提取胞内蛋白，用免疫印迹检测病毒的N蛋白；PC孔感染SARS-CoV-2之后加了等量的药物溶剂DMSO，NC孔只加了等量的药物溶剂DMSO；图9中C为Onvansertib、Vilazodone在不同的浓度下对病毒N基因的抑制情况；图9中D为Onvansertib和Vilazodone在不同浓度下对Caco-2细胞的毒性。
图10为Onvansertib和Vilazodone在Calu-3细胞中的抗SARS-CoV-2原始病毒株活性。注：图10中A，B为免疫印迹：SARS-CoV-2感染Calu-3细胞后，用不同浓度的Onvansertib(A)、Vilazodone(B)处理细胞，提取胞内蛋白，用免疫印迹检测病毒的N蛋白；PC孔感染SARS-CoV-2之后加了等量的药物溶剂DMSO，NC孔只加了等量的药物溶剂DMSO；图10中C为Onvansertib、Vilazodone在不同的浓度下对病毒N基因的抑制情况；图10中D为Onvansertib和Vilazodone在不同浓度下对Caco-2细胞的毒性。
图11为Onvansertib和Vilazodone在Caco-2细胞中的抗Omicron BA.2病毒株活性。
图12为阳性药STM2457在Huh-7、Caco-2和Calu-3细胞中的抗SARS-CoV-2原始病毒株活性对比。
具体实施方式
实施例1不同细胞系中的METTL3敲低抑制SARS-CoV-2原始病毒株的复制
本发明选择了Huh-7、Caco-2和Calu-3这四种细胞系。
(1)在Huh-7细胞中敲低METTL3基因抑制SARS-CoV-2原始病毒株复制
通过包装shMETTL3以及shNC慢病毒，感染Huh-7细胞，用终浓度为2μg/mL的嘌呤霉素筛选阳性细胞，最终通过Western blot验证其敲低效率达到82％(图1中A)；且通过CCK8可以看出敲低METTL3基因之后并不影响Huh-7细胞的活力(图1中B)；用MOI＝0.2感染未敲低和敲低的Huh-7细胞，提取上清的RNA，通过RT-qPCR可以看到敲低METTL3基因后显著抑制了新冠病毒的复制(图1中C)。
(2)在Caco-2细胞中敲低METTL3基因抑制SARS-CoV-2原始病毒株SARS-CoV-2原始病毒株复制
通过包装shMETTL3以及shNC慢病毒，感染Caco-2细胞，用终浓度为4μg/mL的嘌呤霉素筛选阳性细胞，最终通过Westernblot验证其敲低效率达到70％(图2中A)；且通过CCK8可以看出敲低METTL3基因之后并不影响Caco-2细胞的活力(图2中B)；用MOI＝0.2感染未敲低和敲低的Caco-2细胞，提取上清的RNA，通过RT-qPCR可以看到敲低METTL3基因后显著抑制了新冠病毒的复制(图2中C)。
(3)在Calu-3细胞中敲低METTL3基因抑制SARS-CoV-2原始病毒株复制
在Calu-3细胞中用lipo 2000转染siMETTL348 h后，通过Westernblot验证其敲低效率达到37％(图3中A)；且通过CCK8可以看出敲低METTL3基因之后并不影响细胞的活力(图3中B)；用MOI＝0.5感染未敲低和敲低的Calu-3细胞，提取上清的RNA，通过RT-qPCR可以看到敲低METTL3基因后显著抑制了新冠病毒的复制(图3中C)。
实施例2计算虚拟筛选得到候选METTL3小分子抑制剂
从RCSB蛋白数据库下载METTL3晶体结构(PDB ID:5K7W)。首先使用薛定谔软件的蛋白质准备模块对其进行结构优化。随后从Selleck、DrugBank、MEC和APExBIO数据库中收集了21,300多个化合物。经过重复数据删除和过滤(AlogP值在-3～5之间、分子量在200～600之间、可旋转键数<10)，只保留了5,498个的化合物用于后续分析。使用薛定谔软件的LigPrep模块生成三维结构。通过Glide SP模型和XP模型进行对接，要求对接化合物与METTL3的ASP377 OD1、ASP395 OD2、ILE378 H和ASN549 H形成至少两个氢键。采用Desmond软件进行分子动力学拟合(OPLS_2005力场、TIP3P水模型、立方体盒子，盒边缘与化合物原子之间的缓冲距离为0.15M NaCl中和体系、300K温度，1.013Bar大气压)(图4中A)。联合化合物的可获得性及毒副作用，本发明最终选取Onvansertib和Vilazodone进行后续研究(图4中B-E)。
实施例3 Onvansertib和Vilazodone与METTL3/METTL14蛋白相互作用
使用表面等离子共振(SPR)技术来确认Onvansertib和Vilazodone是否能够直接与METTL3/METTL14蛋白结合。经过蛋白预富集实验，发现在稀释蛋白浓度的醋酸钠中，最适pH值为4.0，最终芯片上的蛋白浓度为70ug/mL。待芯片上连上蛋白后，配制了50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM的药物进行上样。KD值是蛋白与小分子物质之间的平衡解离常数，表示蛋白一半数量结合的浓度，KD值越小代表小分子物质对蛋白的亲和力越大，结合越紧密。图5展示了Onvansertib、Vilazodone和SAM与METTL3/METTL14相互作用的表面等离子体共振传感图。结果表明，化合物Onvansertib和Vilazodone均能够与METTL3/METTL14蛋白结合，并且结合能力大于底物SAM。因此，通过SPR实验确认了Onvansertib和Vilazodone能够与METTL3/METTL14蛋白相互作用。
实施例4 Onvansertib和Vilazodone靶向结合METTL3蛋白
通过细胞热位移实验确定Onvansertib和Vilazodone在细胞水平能否有效结合METTL3蛋白。此实验中，设置了7个不同的温度处理，CETSA结果显示(图6)，DMSO对照组的表观聚集温度值(Tagg)为48.64℃，而Onvansertib、Vilazodone的表观聚集温度值分别为52.25℃和52.92℃，与DMSO对照组相比，Onvansertib、Vilazodone的处理增加了表观聚集温度值，因此表明Onvansertib、Vilazodone的存在增加了METTL3的热稳定性。这进一步从细胞水平验证了Onvansertib、Vilazodone能够靶向结合METTL3蛋白。
实施例5 Onvansertib和Vilazodone能抑制METTL3/METTL14的酶活
使用MTase-GLOTM试剂盒对甲基转移酶METTL3/METTL14活性进行了检测，根据预先设定的条件，检测了浓度为12.5μM的Onvansertib、Vilazodone对其活性的影响。实验结果表明，12.5μM的Onvansertib、Vilazodone均能显著抑制METTL3/METTL14的甲基转移酶活性(图7)。
实施例6 Onvansertib和Vilazodone的体外抗SARS-CoV-2活性检测
6.1 Onvansertib和Vilazodone的细胞毒性检测
本发明选择了Huh-7、Caco-2和Calu-3这三种细胞系。
(1)将生长状态良好的Calu-3细胞按8×105个细胞/mL，Caco-2和Huh-7按4×105个细胞/mL的密度铺于96孔板中，每孔100μL，最后在96孔板的最外圈加入每孔200μL灭菌的纯水,防止培养基挥发，待次日所有细胞生长融合到90％左右即可使用。
(2)化合物的配制：将待测化合物从储液浓度稀释至待测最高浓度，每个化合物设置6个浓度梯度，3个复孔，同时设置不加化合物的阴性对照孔以及只含有培养基的空白对照孔，将化合物按每孔100μL依次从低浓度至高浓度加至含有细胞的96孔板中，轻晃混匀后，放回37℃、5％CO2细胞培养箱内继续培养3天。
(3)3天后，将板取出每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，使得终浓度为0.5mg/mL，随后将细胞培养板放回培养箱内孵育4h(活细胞中的琥珀酸脱氢酶使MTT还原为紫蓝色的甲臜，但死细胞无此能力)；4h后，小心将孔板中上清每孔吸去100μL，加入100μL 12％SDS-50％DMF溶液，放入细胞培养箱内过夜(DMSO能溶解细胞中的甲臜)。
(4)于次日，将板取出后置于ELx800酶标仪上读取OD值(570nm，630nm)，所得OD值可间接反应活细胞数量。根据OD值与药物浓度绘制剂量反应曲线，进行化合物半数细胞毒性浓度CC50的计算。
6.2 Onvansertib和Vilazodone的抗原始病毒株活性检测
将待测化合物从储液浓度稀释至待测最高浓度，每个化合物设置7个浓度梯度，同时设置感染SARS-CoV-2之后加等量DMSO的PC孔、只有细胞和等量DMSO的NC孔以及阳性化合物瑞德西韦孔(20μM)。
(1)将8×105个/mL的Calu-3细胞、4×105个/mL的Huh-7、Caco-2细胞以500μL孔铺于24孔板中，37℃、5％CO2细胞培养箱过夜，待次日细胞生长融合到90％即可使用。
(2)将化合物从储液浓度稀释至待测最高浓度(Onvansertib 50μM、Vilazodone100μM)，从最高浓度依次2倍稀释，每个药物设置7个梯度，每个浓度设置两个复孔。按照Calu-3 MOI＝0.5、Caco-2 MOI＝0.2、Huh-7 MOI＝0.2的感染复数配制病毒稀释液，将药物和病毒稀释液1：1混合后，加入细胞，放入37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育1h；1h后，使用1×PBS清洗3次，洗去游离病毒；随后，再将含有梯度稀释化合物的培养基加入细胞中，将细胞置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h，48h后收集上清并使用Roche公司的High PureViral RNAKit提取上清中总RNA，进行RT-qPCR检测(表1)。吸去剩余上清，1×PBS清洗2次，提取细胞内总蛋白，进行Western blotting检测。本研究所有实验均独立重复三次，其数值采用均数±标准差表示(Mean±SEM)。
表1 SARS-CoV-2的引物和探针
在Huh-7细胞中的细胞毒性和抗原始病毒株活性：如图8中A-C所示；通过Westernblot和RT-qPCR计算得知Onvansertib的EC50为2.763±0.211μM、Vilazodone的EC50为3.270±0.077μM，如图8中D所示；通过MTT实验结果计算得知Onvansertib的CC50为123.131±12.573μM、Vilazodone的CC50为199.151±23.542μM。
在Caco-2细胞中的细胞毒性和抗原始病毒株活性：如图9中A-C所示；RT-qPCR计算得知Onvansertib的EC50为1.778±0.357μM、Vilazodone的EC50为2.279±0.407μM，如图9中D所示；通过MTT实验结果计算得知Onvansertib的CC50>200μM、Vilazodone的CC50>200μM。
在Calu-3细胞的细胞毒性和抗原始病毒株活性：如图10中A-C所示；通过Westernblot和RT-qPCR计算得知Onvansertib的EC50为1.843±0.386μM，Vilazodone的EC50为2.301±0.381μM，如图10中D所示；通过MTT实验结果计算得知Onvansertib的CC50>200μM、Vilazodone的CC50>200μM。
6.3 Onvansertib和Vilazodone的抗Omicron BA.2活性检测
将Caco-2细胞以4×105个/mL的密度铺于24孔板，次日待细胞生长融合到90％即可用MOI＝0.2的感染复数感染，并且同时加药，感染后1h后用PBS清洗病毒三遍，即可加入含药的3％FBS培养基培养48h，48h时提取上清RNA，通过RT-qPCR计算得知Onvansertib的EC50为1.105±0.202μM，Vilazodone的EC50为1.023±0.090μM)(图11)。
此外，与现有抗SARS-CoV-2小分子药物Remdesivir、Molnupiravir和Nirmatrelvir相比，Onvansertib和Vilazodone对原始病毒株及Omicron BA.2的抗病毒效果与Remdesivir和Nirmatrelvir相当，并且明显优于Molnupiravir。
表2现有抗SARS-CoV-2小分子药物的抗病毒活性[1]
1Cho J,ShinY,Yang J S,et al.Evaluation ofantiviral drugs againstnewly emerged SARS-CoV-2Omicron subvariants.Antiviral Res,2023,214:105609.
实施例7 m6A甲基转移酶阳性抑制剂STM2457的体外抗SARS-CoV-2原始病毒株活性检测
分别在Huh-7、Caco-2和Calu-3细胞中检测STM2457的抗SARS-CoV-2原始病毒株活性(详见实施例6.2)。通过RT-qPCR实验和计算得知STM2457在三种细胞中的EC50分别为2.333±1.052μM、2.631±0.169μM和1.203±0.331μM)(图12)。因此，Onvansertib和Vilazodone具备和m6A甲基转移酶阳性抑制剂STM2457相当的抗SARS-CoV-2活性。
Claims (2)
1.靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂在制备抗新冠病毒药物中的应用，其特征在于：所述的靶向抑制RNA m6A甲基转移酶活性的抑制剂为化合物Onvansertib，所述的Onvansertib为4,5-二氢-1-(2-羟基乙基)-8-[[5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-(三氟甲氧基)苯基]氨基]-1H-吡唑并[4,3-H]喹唑啉-3-甲酰胺。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗新冠病毒药物通过靶向结合METTL3蛋白从而抑制RNA m6A甲基转移酶活性。
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| A phase Ib/II study of onvansertib (PCM-075) in combination with FOLFIRI and bevacizumab for second-line treatment of metastatic colorectal cancer in patients with a KRAS mutation;Lenz H.J.等;《Annals of Oncology》;20191031;第30卷;第v250页 * |
| In silico study to find a potent inhibitor, Vilazodone, to cure COVID-19 using molecular docking;Muhammad Ismail等;《2022 International Conference on Recent Advances in Electrical Engineering & Computer Sciences (RAEE & CS)》;20221122;第4页结论部分 * |
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