CN103070876B

CN103070876B - 一类抗乙型脑炎病毒感染的组合物及其应用

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Publication number: CN103070876B
Application number: CN201110329906.4A
Authority: CN
Inventors: 马志永; 史子学; 魏建超; 邵东华; 薛飞群; 王少辉; 李蓓蓓
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2031-10-25
Also published as: CN105030797A; CN105030797B; CN103070876A

Abstract

本发明公开了一类具有抗乙型脑炎病毒作用的组合物及其在制备预防和/或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用；所述的组合物含有如式A所示的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物，其还含有海藻糖或黄芪生脉饮；其中，R¹为OH、OCOCH₃、OCOC₂H₅、OCOCH₂CH₂CH₃或OCOCH(CH₃)₂；R²、R³和R⁴独立地为H或C₁～C₃的烷基；R⁵为卤素、硝基或C₁～C₃的烷基磺酰基；R⁶为H或C₁～C₃的烷基磺酰基。本发明所述的组合物能够有效抑制乙型脑炎病毒的增殖。

Description

一类抗乙型脑炎病毒感染的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一类抗乙型脑炎病毒感染的组合物及其应用。

背景技术

流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis，JE)，又称乙脑，是乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起的一种病毒性脑炎。该病主要由库蚊属蚊子叮咬传播。乙脑病毒感染可引起严重的神经紊乱和脑膜炎，每1000个乙型脑炎病毒感染者中约1-3人伴随神经疾病，乙型脑炎的致死率大约在30％以上。

每年全球乙型脑炎临床患者30000-50000人左右，死亡人数超过10000人，且主要分布在中国，东南亚和印度等国家。目前，乙型脑炎流行范围已扩大至南亚、东亚、东南亚和亚洲环太平洋地区，全世界大约30亿人生活在乙型脑炎病毒流行区，乙型脑炎已经成为全世界关注的重要公共卫生问题。

目前治疗乙型脑炎病毒感染没有特效药，只能在病毒感染后采取对症治疗的方法，包括缓解颅内压升高、肢体痉挛和长期感染的神经损伤。治愈率很低。即使治愈，也会伴随终生神经系统后遗症。

我国虽采取普遍接种疫苗方法预防乙脑，取得一定成效，但乙脑在人群中的发病率和死亡率仍居高不下，如2008年我国乙脑病例2975例，死亡率达4.8％。长三角各省市一直是乙脑高发区，其流行严重程度仅次于云南、贵州和四川乙脑重灾区。公共卫生学防控上一个不容忽视的问题是乙脑不但感染人，也是养猪业重大疫病之一，有的猪场乙脑带毒率高达100％，猪已经成为人乙脑感染的主要的传染源。

乙型脑炎病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(genus Flavivirus)病毒，根据基因组进化关系可以分为5个基因型(基因I-V)。乙型脑炎病毒是单股正链RNA病毒，基因组长约11kb，包括：5′和3′非编码区，中间序列编码一个大的开放阅读框，在细胞和病毒蛋白酶的裂解作用下成3个结构蛋白(C、prM和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。病毒E囊膜糖蛋白是主要的结构蛋白，构成病毒粒子表面主要结构。E蛋白上有受体结合位点和中和抗体表位，而且影响乙型脑炎病毒对细胞嗜性和侵入易感细胞能力。

国际上人群免疫使用的乙脑疫苗主要是中国的地鼠肾细胞灭活疫苗和日本的鼠脑提纯灭活疫苗，疫苗免疫后保护率可达60～90％，但仍存在着免疫失败和漏免的现象，有相当多的人群处于乙脑病毒感染的威胁中。预防为主、重视治疗是防控传染病的有效途径，因此各国都对开发乙脑治疗药物高度重视，然而至今仍没有研制出特效药物。开发新型、特异和有效的抗乙脑治疗药物对于乙脑患者的治疗，及重要经济价值动物的保护具有重要意义。

硝唑尼特是硝基噻唑酰胺类化合物，由美国Romark实验室于1976年首次合成。其化学名为2-乙酰氧基-N-(5-硝基-2-噻唑)苯甲酰胺[2-(acetolyloxy)-N-(5-nitro-2-thiazoly)benzamide]，分子式为C₁₂H₉N₃O₃S，分子量为307.3，熔点202℃，通常状态下是一种稳定的淡黄色结晶状粉末，不溶于水，微溶于乙醇，可溶于二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂。硝唑尼特苯环上的氢原子被不同基团取代，可形成一系列衍生物。

硝唑尼特是一种安全性较高的药物，动物实验急性口服毒性研究表明，大鼠、猫、犬的半数致死量(LD₅₀)均达到10g/kg以上，小鼠达1.4g/kg。慢性毒性研究表明，大鼠口服450mg/(kg·d)，连服90天，仅出现极少的毒性现象。

硝唑尼特具有抗厌氧细菌、原生动物和病毒的活性，起初被作为一种肠道原虫的治疗药物。其抗病毒效用是在治疗AIDS病人隐孢子虫病(Cryptosporidium spp.)的过程中发现的。2002年，由美国FDA批准作为治疗成人和12个月以下儿童隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)或贾滴虫(Giardia lamblia)引起的肠炎和腹泻的药物(Alinia，Romark Laboratories，Tampa，Florida USA)。临床实验证明，硝唑尼特能够治疗隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、湾鞭毛虫(G.lamblia)、阿米巴原虫(Entamoebahistolytica)和人酵母菌(Blastocystis hominis)引起的肠炎和腹泻。近几年的临床实验进一步证明，硝唑尼特对于成人梭菌性肠炎(Clostridium difficilecolitis)、儿童轮状病毒肠胃炎和成人轮状病毒和诺如病毒(Norovirus)肠胃炎都有良好的治疗作用。体外实验证明，硝唑尼特还能够抑制H1N1型流感病毒成熟粒子的释放。

硝唑尼特抗厌氧微生物的机制是干扰其丙酮酸：铁氧还蛋白还原酶(PFOR)所依赖的电子转移反应，这是厌氧菌能量代谢的重要步骤。

硝唑尼特抗病毒感染涉及的机制尚未完全阐明，对于不同科属的病毒，硝唑尼特发挥抗病毒的机制也不同。虽然已有研究证明硝唑尼特可用于轮状病毒和诺如病毒(Norovirus)引起的肠胃炎、丙型肝炎、乙型肝炎等的治疗，但是硝唑尼特治疗乙型脑炎病毒感染未见任何报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一类具有抗乙型脑炎病毒作用的组合物及其在制备预防和/或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用。此类组合物能够有效抑制乙型脑炎病毒的增殖，达到预防和/或治疗乙型脑炎病毒感染的目的。

本发明涉及一类具有抗乙型脑炎病毒作用的组合物，其含有如式A所示的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物，其还含有海藻糖或黄芪生脉饮；

其中，R¹为OH、OCOCH₃、OCOC₂H₅、OCOCH₂CH₂CH₃或OCOCH(CH₃)₂；R²、R³和R⁴独立地为H或C₁～C₃的烷基；R⁵为卤素、硝基或C₁～C₃的烷基磺酰基；R⁶为H或C₁～C₃的烷基磺酰基。

本发明中，所述的黄芪生脉饮可为市场上可购得的常规黄芪生脉饮，是由古方生脉散变化而来，其主要成分一般为黄芪、党参、麦冬，五味子，南五味子。生脉散始见于唐·孙思邈《千金要方》，生脉散(孙思邈《备急千金要方》)制备方法：处方：西洋参15克，麦冬15克，五味子10克，枳实15克，生地黄30克。采用两遍煎服取药液。头煎以药液开始沸腾起计时需20～25分钟，滤取药液后再加水煎二汁，二煎沸15～20分钟。煎好后立即用药筛或纱布将药液过滤出来。两次煎出的药液应控制在400毫升左右。

本发明中，所述的组合物中黄芪生脉饮的用量优选20％～100％，更优选50％～80％(体积浓度)。

本发明中，所述的海藻糖为符合国家标准GB/T23529-2009的海藻糖，优选以海藻糖的细胞培养液溶液的形式存在；其中，所述的细胞培养液可为本领域常规的细胞培养液。所述的海藻糖的细胞培养液溶液的浓度优选2％～15％，更优选5％～15％，最优选8％；所述的百分数均为海藻糖质量(g)/细胞培养液的体积(100ml)。

本发明中，所述的组合物中海藻糖的用量优选2％～15％，更优选5％～15％，最优选8％，所述的百分数为质量体积百分数(质量(g)/100mL溶剂，所述的溶剂较佳地为水。)。

本发明中，所述的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物和海藻糖或N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物和黄芪生脉饮的用量比为不影响所述的组合物活性即可，当所述的组合物含有N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物和海藻糖时，优选N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物∶海藻糖＝1∶20000～150000(质量比)，更优选N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物∶海藻糖＝1∶50000～80000(质量比)；当所述的组合物含有N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物和黄芪生脉饮时，优选N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物∶黄芪生脉饮＝1mg∶2～10ml，更优选N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物∶黄芪生脉饮＝1mg∶5～10ml。

本发明中，所述的卤素优选氟、氯、溴或碘原子，更优选氯或溴原子。

本发明中，所述的组合物中，如式A所示的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物优选下述化合物：

如通式A所示的化合物，其中，

R¹为OCOCH₃，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为NO₂，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为NO₂，R⁶为H；

或R¹为OCOCH₃，R²为CH₃，R³为H，R⁴为H，R⁵为Br，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为Br，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为Cl，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为CH₃，R⁵为Cl；R⁶为H；

或R¹为OH，R²为CH₃，R³为H，R⁴为H，R⁵为Cl，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为CH₃，R⁴为H，R⁵为Cl，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为SO₂CH₃，R⁶为H；

或R¹为OCOCH₃，R²为H，R³为H，R⁴为CH₃，R⁵为Cl，R⁶为H；

或R¹为OCOCH₃，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为Cl，R⁶为SO₂CH₃。

本发明中，所述的组合物中，如式A所示的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物更优选下述化合物：

如通式A所示的化合物，其中，

R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为NO₂，R⁶为H；

或R¹为OCOCH₃，R²为CH₃，R³为H，R⁴为H，R⁵为Br，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为Br，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为Cl，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为SO₂CH₃，R⁶为H；

本发明中，所述的组合物中，如式A所示的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物最优选以下化合物：如通式A所示的化合物，其中R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为NO₂，R⁶为H。

本发明还涉及所述的组合物在制备预防和/或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用；优选用来制备预防和/或治疗动物乙型脑炎病毒感染的药物。

本发明中，所述的组合物可与药学上各种常用添加剂(如稀释剂和赋形剂等)结合使用，形成其药物组合物。根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等，优选液体、悬浮液、乳液、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。

为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉，碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。还可以根据需要选用通常的涂渍材料制成糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。

为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂，例如，载体，如乳糖，淀粉，椰子油，硬化植物油，高岭土和滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉，黄蓍胶粉，明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。

为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如，聚乙二醇，椰子油，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成的甘油酯等。

为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液或悬浮液消毒后(最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油等)，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体。例如，水，乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。

本发明中，所述的组合物在药物组合物中的含量无特殊限制，可在很宽的范围内进行选择，通常可为质量百分比的10～90％，较佳的为质量百分比30～80％。

本发明中，所述的组合物的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂或胶囊口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合进行静脉注射；栓剂为给药到直肠。

本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量，通常为100～500mg药物活性成分/kg/人/天。一般来说，每个给药单位剂型可含90～450mg的药物活性成分。

本发明所述的药物组合物中，可以以本发明所述的组合物，即N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物与海藻糖或N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物与黄芪生脉饮作为活性成分，也可以还含有其它活性成分。所述的其它活性成分，为对本发明中所述的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物与海藻糖或N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物与黄芪生脉饮的活性没有不良影响的成分。

本发明中，在体外培养的BHK细胞上接种乙型脑炎病毒，然后在细胞培养液中加入硝唑尼特或其衍生物和海藻糖，或硝唑尼特或其衍生物和黄芪生脉饮，可以有效抑制细胞内乙型脑炎病毒的增殖；小鼠感染乙型脑炎病毒后，在其饮水中加入一定浓度的硝唑尼特或其衍生物和海藻糖，或硝唑尼特或其衍生物和黄芪生脉饮，可以提高小鼠的存活率。

本发明中，含有如式A所示的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物，及还含有海藻糖或黄芪生脉饮的药物组合物，能够显著提高小鼠感染乙脑病毒后的存活率，其效果明显优于单单使用硝唑尼特、海藻糖或二甲亚砜的情况。

本发明中所述的组合物可通过有效成分的简单均匀混合制得。

本发明中所述原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：所述的含有如式A所示的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物，及还含有海藻糖或黄芪生脉饮的组合物及该组合物与常用添加剂结合使用后得到的药物组合物，能有效抑制乙脑病毒在细胞中的增殖，降低患病动物的死亡率。从而弥补了目前无治疗乙型脑炎特效药物的不足，改善了乙型脑炎病毒感染后的治疗措施。

附图说明

图1为硝唑尼特加海藻糖混合物组、硝唑尼特处理组、DMSO处理组和只加含5％海藻糖的细胞培养液组抑制BHK细胞中乙型脑炎病毒增殖的曲线图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例中所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

下列实施例中所述的百分数若非特别说明都为质量(g)/体积(100ml)分数。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

硝唑尼特及其衍生物购自美国Romark实验室，纯度≥95％(质量百分比)。所有硝唑尼特及其衍生物溶解于二甲基亚砜中，保存浓度50μg/μl。

实施例中所用乙型脑炎病毒SA14标准强毒株，其生物学特性能代表我国的乙型脑炎病毒特点。

实施例中所用溶解剂为二甲基亚砜，它对许多药物具有溶解性、渗透性，本身具有消炎、止痛、镇静、利尿以及促进血液循环和伤口愈合的作用，因此对实验细胞或动物体无毒性作用。

6孔细胞培养板，美国Corning产品。

DMEM培养基，美国GIBCO产品，REF：16000-044。

青霉素，美国GIBCO公司产品，REF：15140-122。

链霉素，美国GIBCO公司产品，REF：15140-122。

金黄地鼠肾细胞(BHK细胞)，购自中科院上海生命科学研究院细胞库。

1.5ml离心管，美国Axygen公司产品。

丙酮，江苏强盛化工有限公司，许可证号：XK13-201-00227。

小鼠抗乙型脑炎病毒抗体，美国Abcam公司产品，Code：ab26950。

PBS，购自美国GIBCO公司，REF：20012-027。

PBST：配制方法参考《分子克隆实验指南》第三版。

羊抗小鼠FITC标记的荧光抗体，美国Invitrogen公司产品，Code：CA11034s。

100％甘油，国药集团化学试剂有限公司。

海藻糖(购自南宁中诺生物工程有限责任公司，分子式C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，纯度≥98％(质量百分比))，白色颗粒，味甜。海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其它生物制品的生物活性物质的稳定剂以外，食用海藻糖的血糖反应更平稳，更适合作为机体能量提供物质。

黄芪生脉饮(购自浙江新光药业有限公司，药品批准文号：国药准字Z33020235)，由黄芪、党参、麦冬，五味子，南五味子组成。其主要成份黄芪为具有补气作用的药物，味甘而性微温，入脾肺两经。据药理研究，黄芪含有多糖、胆碱、皂苷、氨基酸、甜菜硷、香豆素及黄酮等，能增强机体抵抗力。

本发明各实施例中涉及的硝唑尼特及其衍生物的结构式，名称或编号如表1所示。

表1硝唑尼特及其衍生物的取代基、名称或编号

实施例1硝唑尼特和海藻糖混合制剂对体外BHK细胞(购自中科院上海生命科学研究院细胞库)(金黄地鼠肾细胞)中乙脑病毒增殖的抑制作用

实施步骤：

(1)细胞培养

将生长状态良好的BHK细胞于6孔细胞培养板(美国Corning产品)上进行细胞传代培养(1×10⁶个细胞/孔)。12h后，用无血清DMEM(美国GIBCO产品，REF：16000-044)培养基1ml洗一遍，向每孔细胞中加入1×10³TCID₅₀的乙型脑炎病毒，于37℃细胞培养箱内放置1h。取出后，用无血清DMEM 1ml洗二遍，再加入3ml含5μg/ml硝唑尼特和5％海藻糖的细胞培养液(所述的细胞培养液还含有2％小牛血清、100单位青霉素(美国GIBCO公司产品，REF：15140-122)和100μg/ml链霉素(美国GIBCO公司产品，REF：15140-122))作为：

d.接种病毒加硝唑尼特和海藻糖组。

同时设立以下对照组：

a.接种病毒加硝唑尼特组，即在所述的加入乙型脑炎病毒的BHK细胞中，加入3ml细胞培养液；所述的细胞培养液含硝唑尼特5μg/ml、2％小牛血清、100单位青霉素和100μg/ml链霉素；

b.接种病毒加二甲基亚砜组，即在所述的加入乙型脑炎病毒的BHK细胞中，加入3ml细胞培养液；所述的细胞培养液含硝唑尼特溶剂二甲基亚砜0.3μl，体积比为万分之一；

c.接种病毒加海藻糖组，即在所述的加入乙型脑炎病毒的BHK细胞中，加入3ml细胞培养液，所述的细胞培养液含5％海藻糖、2％小牛血清、100单位青霉素和100μg/ml链霉素。

(2)样品收集

分别在接种病毒后0h、6h、12h、18h和24h的时刻，收取细胞培养板中四组(a.接种病毒加硝唑尼特组；b.接种病毒加二甲基亚砜组；c.接种病毒加5％海藻糖组；d.接种病毒加硝唑尼特和海藻糖组)细胞和细胞培养上清到1.5ml离心管(美国Axygen公司产品)中，充分冻融3次后，再以10000rpm的转速离心10min，收集上清到新的离心管中以测定乙型脑炎病毒的滴度。

(3)免疫荧光实验

生长良好的BHK细胞于96孔细胞培养板上进行细胞传代培养(1×10⁴个细胞/孔)后，将其置于37℃细胞培养箱中备用。

将收取到的0h、6h、12h、18h和24h的样品均作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6稀释，再分别取0.1ml各稀释液接种于上述放置于培养箱中备用的96孔细胞培养板内的单层细胞上，每种稀释液接种4孔，于37℃吸附2h后，弃去稀释液，用无血清、无抗生素的DMEM培养基1ml洗涤2次，再每孔加入0.1ml含2％小牛血清的DMEM培养基(含100单位青霉素、100μg/ml链霉素)，在37℃、含5％二氧化碳的培养箱中培养72h。

取出96孔细胞培养板，弃去细胞培养液，用80％的冷丙酮(-20℃)(江苏强盛化工有限公司，许可证号：XK13-201-00227；80％丙酮，即800ml丙酮加200ml蒸馏水配制成。)固定细胞20min。然后向其中加入小鼠抗乙型脑炎病毒抗体(美国Abcam公司产品，Code：ab26950，用PBS(购自美国GIBCO公司，REF：20012-027)稀释300倍后使用，每孔50μl)，于37℃下作用1h。再用PBST(配制方法参考《分子克隆实验指南》第三版)洗3遍，每孔200μl，加入羊抗小鼠FITC标记的荧光抗体(美国Invitrogen公司产品，Code：CA11034s，用PBS(购自美国GIBCO公司，REF：20012-027)稀释500倍后使用，每孔50μl)，避光、37℃下作用1h。再用PBST洗3遍，每孔200μl，最后一遍清洗后，尽量排干细胞培养板孔中的PBST，向细胞培养板内的细胞上加入50％的甘油(100％甘油中加入蒸馏水配制成50％的甘油)加入量以覆盖细胞为准，用荧光显微镜观察结果。

(4)计算乙型脑炎病毒滴度

记录能看到绿色荧光的细胞孔及其对应的稀释倍数，利用公式计算单位体积病毒悬液中的TCID₅₀，以3次重复实验结果的算术平均值作为样品的最终感染滴度。

(1931)公式：

lg TCID₅₀＝L1.0-Lint(S-0.5)L1.0＝全部感染的最高稀释度的对数

Lint＝稀释梯度的对数

S＝阳性比率的和

0.5＝因子常数

“分别计算四组(a.接种病毒加硝唑尼特组；b.接种病毒加二甲基亚砜组；c.接种病毒加海藻糖组；d.接种病毒加硝唑尼特和海藻糖组)”细胞中乙型脑炎病毒的增殖情况，各不同时刻病毒滴度的具体数据见表2，根据表2绘制病毒滴度增长曲线，结果见图1。

据图1可知：硝唑尼特加海藻糖混合物组能有效抑制乙脑病毒在BHK细胞中的增殖，且抑制病毒效果比只加硝唑尼特组明显，0h、6h、12h、18h两组间病毒滴度差异不显著(p＞0.05)；24h两组间病毒滴度差异显著(p＝0.034)。

实施例2 硝唑尼特和海藻糖混合制剂对小鼠体内乙脑病毒增殖的抑制作用

实施步骤：

(1)动物：雌性昆明小鼠90只(上海斯莱克实验动物有限公司)，体重12～14g。平均分为9组：

a.接毒小鼠饮水含0.2％二甲基亚砜(百分比为二甲基亚砜/蒸馏水体积比)；

b.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml；

c.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml和2％海藻糖；

d.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml和5％海藻糖；

e.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml和8％海藻糖；

f.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml和15％海藻糖；

g.未接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml；

h.未接毒小鼠饮水含5％海藻糖；

i.未接毒小鼠饮水正常(蒸馏水)。

(2)JEV感染昆明小鼠硝唑尼特治疗试验：按照(1)中分组方法分别处理小鼠，接毒组昆明小鼠腹腔注射100LD₅₀的乙型脑炎病毒。1天后，按照实验步骤(1)的饮水，让各组小鼠按组别自由饮水。每日观察小鼠的精神状态，记录攻毒后小鼠的死亡情况，具体存活率数据见表3。

根据表3可知：硝唑尼特和海藻糖混合制剂能有效降低感染乙脑病毒小鼠的死亡率。

实施例3硝唑尼特衍生物和海藻糖混合制剂对小鼠体内乙脑病毒增殖的抑制作用

具体实施步骤同实施例2，试验数据见表4。

根据表4可知：本发明中的硝唑尼特衍生物Tizoxanide、RM4803、RM4832、RM4848、RM4850、RM4851、RM4852、RM4863、RM4865和RM5014都能有效降低感染乙脑病毒小鼠的死亡率。

表4：硝唑尼特衍生物处理后接毒小鼠的存活率

实施例4硝唑尼特和黄芪混合制剂对小鼠体内乙脑病毒增殖的抑制作用

实施步骤：

b.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml；

c.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml和20％黄芪生脉饮(体积百分含量)；

d.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml和50％黄芪生脉饮(体积百分含量)；

e.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml和80％黄芪生脉饮(体积百分含量)；

f.接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml和100％黄芪生脉饮(体积百分含量)；

g.未接毒小鼠饮水含硝唑尼特100μg/ml；

h.未接毒小鼠饮水含80％黄芪生脉饮(体积百分含量)；

i.未接毒小鼠饮水正常(蒸馏水)。

(2)JEV感染昆明小鼠硝唑尼特治疗试验：按照(1)中分组方法分别处理小鼠，接毒组昆明小鼠腹腔注射100LD₅₀的乙型脑炎病毒。1天后，按照实验步骤(1)的饮水，让各组小鼠按组别自由饮水。每日观察小鼠的精神状态，记录攻毒后小鼠的死亡情况，具体存活率数据见表5。

根据表5可知：本发明中的硝唑尼特和黄芪混合制剂能有效降低感染乙脑病毒小鼠的死亡率。

实施例5硝唑尼特衍生物和黄芪混合制剂对小鼠体内乙脑病毒增殖的抑制作用

具体实施步骤同实施例4，试验数据见表6。

根据表6可知：本发明中的硝唑尼特衍生物Tizoxanide、RM4803、RM4832、RM4848、RM4850、RM4851、RM4852、RM4863、RM4865和RM5014都能有效降低感染乙脑病毒小鼠的死亡率。

表6：硝唑尼特衍生物和黄芪混合制剂处理后接毒小鼠的存活率

Claims

1.一类具有抗乙型脑炎病毒作用的组合物，其特征在于：所述的组合物含有如式A所示的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物，其还含有海藻糖；所述的组合物中海藻糖的质量体积浓度为2％～15％；

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的组合物中海藻糖的质量体积浓度为5％～15％。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述的组合物中海藻糖的质量体积浓度为8％。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的海藻糖以海藻糖的细胞培养液溶液的形式存在。

5.如权利要求1或4所述的组合物，其特征在于：N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物：海藻糖的质量比＝1：20000～150000。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于：N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物：海藻糖的质量比＝1：50000～80000。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的卤素为氟、氯、溴或碘原子。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的如式A所示的N-(2-噻唑)苯甲酰胺类化合物为以下化合物：

如通式A所示的化合物，其中，

R¹为OCOCH₃，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为NO₂，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为NO₂，R⁶为H；

或R¹为OCOCH₃，R²为CH₃，R³为H，R⁴为H，R⁵为Br，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为Br，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为Cl，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为CH₃，R⁵为Cl；R⁶为H；

或R¹为OH，R²为CH₃，R³为H，R⁴为H，R⁵为Cl，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为CH₃，R⁴为H，R⁵为Cl，R⁶为H；

或R¹为OH，R²为H，R³为H，R⁴为H，R⁵为SO₂CH₃，R⁶为H；

或R¹为OCOCH₃，R²为H，R³为H，R⁴为CH₃，R⁵为Cl，R⁶为H；

9.如权利要求1～4和6～8任一项所述的组合物在制备预防和/或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用。

10.如权利要求5所述的组合物在制备预防和/或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用。