WO2010040254A1

WO2010040254A1 - 黄芩黄酮在制备治疗肠道病毒感染药物的应用

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Publication number: WO2010040254A1
Application number: PCT/CN2008/072600
Authority: WO
Inventors: 刘家琛; 曲敬来; 刘玉玲; 温纯青; 温育青; 曾晓莲; 高雪
Original assignee: 大百汇生物科技（深圳）有限公司
Priority date: 2008-10-06
Filing date: 2008-10-06
Publication date: 2010-04-15

Description

黄芩黄酮在制备治疗肠道病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及一类可用于抗肠道病毒感染的黄酮类活性物质。所述的黄酮活性物质为黄芩黄酮，具体包括黄芩素、黄芩苷和黄芩总黄酮提取物。所述的肠道病毒系指引起手足口病的柯萨奇病毒 A组、柯萨奇病毒 B组、埃可病毒和肠道病毒 EV71。将黄酮类活性物质与药剂学上允许的赋形剂混合，制成患者可按受的制剂，通过注射、粘膜、口服或吸入给药，可用于手足口病的治疗及预防。属于生物医药技术领域。背景技术

手足口病 (Hand-foot-mouth disease, HFMD) 是由多禾中肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。少年儿童和成人感染后多不发病，但能够传播病毒。引起手足口病的肠道病毒很多，主要为小 RNA 病毒科、肠道病毒属的柯萨奇病毒（Coxasckie virus) A组 16、 4、 5、 7、 9、 10型， B组 2、 5、 13型；埃可病毒（ECHO viruses ) 的某些血清型和肠道病毒 71型（EV71 ) , 其中以 CoxA16型及 EV71型最为常见。手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。早期发现的手足口病的病原体主要为 Cox A16型， 1969年 EV71在美国被首次确认。此后 EV71感染与 Cox A16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。 EV71感染引起重症的比例高于其他类型肠道病毒，重症患儿病死率较高。上世纪 70年代以来，一些欧亚国家和地区先后发生较大规模 EV71感染流行。 1998年，我国台湾地区曾发生大规模 EV71 疫情，报告病例 129106例，其中重症 405例，死亡 78例。 2008年 3月，安徽省阜阳市发生了较大规模的手足口病疫情，病原体为 EV71和

CoxA16 , 其中多数为 EV71肠道病毒引起的感染。自 2008年 5月 2日起，手足口病纳入我国丙类传染病管理。

目前尚无针对手足口病的疫苗和特效治疗药物。因此，寻找一种疗效明确的治疗及预防手足口病药物成为医疗界关注的焦点。

中药不仅具有耐药性低、副作用和不良反应少等优点，而且还有抑制病毒复制、调节免疫功能、改善血液循环、解热镇痛及抗菌消炎等综合功效，其在防治病毒感染方面具有独特的优势和广阔的发展前景。研究表明，清热解毒类中药大多具有直接抗病毒的作用，如连翘、金银花、野菊花、黄莲、黄芩、大青叶、鱼腥草、柴胡、牛蒡子等。该类药材所含成分复杂，目前研究比较清楚的主要有两类：一是多酚类物质，另一类是黄酮类物质。因此，从清热解毒类中药材的多酚或黄酮类成分中筛选具有抗病毒作用的活性物质是发展抗病毒药物的重要途径之一。

黄芩为唇形科 (l abiatae)植物黄芩 (Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，又名子芩、条芩、独尾芩、鼠尾芩、黄芩条等，具有清热、泻火、解毒、止血、安胎等作用，是中医治疗肺热的要药，在我国有上千年的使用历史，安全性好，被收载于《神农本草经》中并列为中品。目前临床上用于清热解毒和治疗肺热的双黄连注射液、痰热清注射液和清开灵注射液均将中药黄芩作为主要药材。黄酮是黄芩中的重要活性物质，主要包括黄芩苷 ( Baicalin)、黄芩素（Baicalein)、汉黄芩素 (wogomin)、汉黄芩苷（Wogonoside) 等四种成分，其中以黄芩苷和黄芩素活性较强。黄芩素化学名称为 5， 6， 7—三羟黄酮黄芩苷。黄芩素 7位羟基被取代后形成的黄芩素 -7-0-葡萄糖醛酸苷即为黄芩苷。黄芩素为黄芩苷的苷元，两者具有类似的药理活性，化学结构式如下: HO HO

大量研究证实黄芩中的黄酮类成分具有抑制胰酶活性、抗菌、抑制炎症反应、抗病毒、清除自由基等广泛的药理作用，其中抗炎、抗病毒的主要活性物质为黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素。黄芩黄酮类成分具有广谱抗病毒活性，对多种病毒有灭活作用，对炎症的渗出、水肿均有明显的抑制作用，对各种病毒感染引起的发热有明显解热作用；并能增强机体细胞的免疫功能，提高白细胞、中性粒细胞及巨噬细胞对病毒的吞噬能力。有关黄芩黄酮抗病毒作用的研究，目前主要集中在呼吸道流感病毒、肝炎病毒和艾滋病病毒，而对引起手足口病的各类肠道病毒的抑制作用尚未见报道。

基于黄芩黄酮类成分的药理作用特点，本发明将其应用到肠道病毒的研究领域中，考察黄芩黄酮类成分对各类肠道病毒的抑制作用。鉴于手足口病目前尚无特效治疗药物和疫苗，本发明研究内容对发展手足口病治疗及预防药物具有重要价值和重大现实意义。

B月 ^ I

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一类黄酮活性物质在制备治疗肠道病毒感染药物的应用。

所述的活性物质为黄芩黄酮，具体包括黄芩素、黄芩苷和黄芩总黄酮提取物。本发明中涉及的黄芩素和黄芩苷的单体可采用黄芩药材提取精制的方法获得，还可采用化学合成的方法制备。

黄芩总黄酮提取物可以通过公知的技术制备或购买市售的产品获得。常规提取方法包括水煎煮法、乙醇回流法、乙醇和 /或水室温浸提法等，从黄芩药材中提取得到的混合成分；提取物的黄酮组分中，除黄芩苷外，还包含黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素中的至少一种。采用 HPLC法测定，总黄酮含量（以黄芩苷计）在 50 %以上。本发明进行对黄芩黄酮类活性物质进行了体外抗病毒试验和临床疗效观察。

本发明考察了黄芩素、黄芩苷及不同含量的黄芩总黄酮提取物对 VERO细胞（绿猴肾细胞）的细胞毒性作用，采用 Reed and Muench 法对药物半数有毒浓度 TC_5Q进行了计算，并确定最大无毒浓度 TQ)。在此基础上，考察了各受试药物对柯萨奇病毒 A组亚型、柯萨奇病毒 B组亚型、埃可病毒和肠道病毒 EV71的抑制效果，以 Reed and Muench 法计算药物对病毒生长抑制率及半数有效浓度 IC₅₍₎。

结果表明，黄芩素和黄芩苷单体及黄芩总黄酮提取物对肠道病毒具有明显的抑制作用，安全性好。对病毒的抑制活性依次为黄芩素〉黄芩苷〉黄芩黄酮提取物（黄芩素和黄芩苷含量总和为 73. 4% )〉黄芩黄酮提取物（黄芩素和黄芩苷含量总和为 50% )。

所述的肠道病毒选自肠道病毒 EV71、柯萨奇病毒（Coxasckie virus)或埃可病毒 ( ECHO viruses ) 中至少一种。

所述的柯萨奇病毒包括柯萨奇病毒 A组亚型、柯萨奇病毒 B组亚型。

所述的柯萨奇病毒 A组亚型包括 A组的 A16、 A4、 A5、 A7、 A9 和 A10型，柯萨奇病毒 B组亚型包括 B组的 B2、 B5、 B13型。

优选的柯萨奇病毒包括 Cox A16、 A5 和 Cox B 2 或肠道病毒 EV71 ,更优选的柯萨奇病毒为 Cox A组的 A 16型或肠道病毒 EV71。在体外抗病毒试验基础上，本发明又考察了黄芩素用于手足口病治疗的临床效果，将符合诊断标准的病例随机分为两组，治疗组 30 例，对照组 30例，两组在性别、年龄、病程、病情方面无明显差异。对照组用利巴韦林治疗。治疗组在对照组基础上，配合应用黄芩素喷剂。结果显示治疗组的治愈率为 18/30、有效率为 10/30、总有效率为 93.3 % , 而对照组的治愈率为 10/30、有效率为 8/30、总有效率为 60.3 %。经卡方检验， p<0.05，治疗组与对照组有统计学意义。说明黄芩黄酮类活性物质用于手足口病的治疗和预防，具有显著疗效。本发明另一方面涉及一种治疗和预防由肠道病毒引起的手足口病的方法，通过口服、注射、吸入或粘膜途径给予黄芩黄酮制剂。

所述的黄芩黄酮制剂是黄芩黄酮与药剂学上允许的赋形剂混合，制成患者可接受的制剂。黄芩黄酮制剂中优选的是黄芩黄酮 /脂质复合物。

所述的黄芩黄酮 /脂质复合物中黄芩黄酮和脂质重量比例范围黄芩黄酮：脂质材料 =1 : 19-3 : 1。

脂质材料选自天然脂质、合成脂质以及它们的混合物，

其中所述的天然脂质材料选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆甾醇、胆酸、海藻酸钠或壳聚糖中至少一种。优选的是大豆卵磷脂。黄芩黄酮 /脂质复合物的制备方法如下：将黄芩黄酮与脂质材料按一定比例混合，加适量有机溶剂溶解，或者分别用不同的有机溶剂溶解后再混合，在合适的温度条件下搅拌，干燥，制得黄芩黄酮 /脂质复合物。

所述的干燥包括旋转蒸发、喷雾干燥或冷冻干燥。

所述的有机溶剂中优选的是四氢呋喃。取大豆卵磷脂适量，按药物 /大豆磷脂摩尔比为 1 : 4投料，用四氢呋喃溶解，搅搅 2小时，旋转蒸发去除溶解制备磷脂复合物，加入适量甘露醇和 CMC-Na，用 40 %的叔丁醇溶解，冷冻干燥，临用时加水稀释制成含黄芩素浓度为 0. 1-1. 0 %的溶液，分装于定量喷雾瓶中，备用。或将大豆卵磷脂先制成磷脂复合物，再溶于 0.5 %的 CMC-Na溶液中，制成含黄芩素 0. 1-1. 0 %的溶液，经口腔及咽喉喷雾给药。优选的浓度是 0.5 % 黄芩黄酮制剂中另一种优选的是黄芩黄酮水包油（0/W) 脂肪乳剂。

黄芩黄酮水包油（0/W) 脂肪乳剂包括油相、水相、乳化剂、助乳化剂和稳定剂。

黄芩黄酮水包油（0/W) 脂肪乳剂的制备方法。将黄芩黄酮 /脂质复合物溶于油中形成油相，加入水相、乳化剂、助乳化剂和稳定剂，经乳化制成水包油（0/W) 脂肪乳剂。黄芩黄酮制剂中所述的黄芩黄酮选自黄芩素、黄芩苷和黄芩总黄酮提取物，优选的黄芩黄酮是黄芩素。具体实施方式

以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一歩详细说明，但本发明的权利要求并不只局限于这些具体实施例的内容。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。实施例 1 受试样品的含量测定

受试样品：黄芩素

黄芩苷

黄芩总黄酮提取物 1

黄芩总黄酮提取物 2

测定方法：取四组受试样品适量，精密称定，分别加甲醇溶解并稀释成浓度为 l.O g/mL的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取黄芩素、黄芩苷对照品适量，同法制备浓度相当的对照品溶液；分别量取对照溶液和供试溶液，照 HPLC法测定，色谱柱为 Agilent ZORBAX SB C18柱 (25mmX 4. 6mm, 5μπι)，流动相及洗脱梯度见下表，流速 lmL/min，进样体积 20μΙ^，检测波长 275nm，室温检测。黄芩素和黄芩苷含量分别根据各自的对照按外标法计算，黄芩总黄酮提取物的含量以黄芩苷为对照按外标法计算。

表 1 HPLC 流动相组成及梯度

洗脱梯度（％)(v/v)

时间 (分钟）流速 (mL/min)

0. 05%磷酸

0 1. 0 20 80

5 1. 0 30 70

20 1. 0 50 50

25 1. 0 20 80

30 1. 0 20 80 结果表明，黄芩素受样品含量为 94.2% ; 黄芩苷受试样品含量为 96.5 %；黄芩总黄酮提取物 1的黄酮总含量（以黄芩苷计）为 50% ; 黄芩总黄酮提取物 2的黄酮总含量为 73.4%。实施例 2 黄苓素对肠道病毒的抑制作用

实验材料：体外抗病毒试验使用的细胞为 VERO绿猴肾细胞（香港大学赠与，自行传代培养）；使用的试剂包括细胞培养液、 MEM培养基（I X ) 500ml (美国 GIBCO公司）、胰酶消化液（0.25%胰酶， 0.02% EDTA ) (美国 GIBCO公司）、胎牛血清（美国 GIBCO公司）；双抗（Amp +strep) (美国 GIBCO公司）、维持液（MEM培养基 +2% 胎牛血清）、 DMSO ( Sigma公司）和 MTT ( Sigma 公司）；使用的仪器包括 T25细胞培养瓶、培养板 96孔板（美国 CORNING公司）、二氧化碳孵箱（美国 CORNING公司）、酶标仪（伯乐公司）和倒置显微镜（OLYMPAS)。

体外抗病毒试验具体操作方法如下：

细胞培养待 VERO 细胞铺满，吸去培养液，加入胰酶消化液 lml, 37°C消化 10 分钟，弃去胰酶，加培养液把细胞吹打下来， 1 :3 传代， 3天长满，消化并计数，接种 96孔细胞培养板，每孔 0.1ml, 细胞个数 10⁴ /ml,37°C， 5%C02 培养 24小时，细胞长成单层后进行实验。药物细胞毒性试验取受试药物，加 DMSO制成浓度为 10m_g/ml 的贮备液，贮备液用培养液稀释至合适浓度， 5个稀释度。每浓度 8 孔，每个药品均设无药物细胞对照。培养 48小时后弃去培养液，加入 0.5mg/ml的 MTT液 20μ1，继续培养 4小时，去掉上清液，每孔加入 40μ1 DMSO以减少溶剂的干扰，作用 20min后用酶标仪测每孔 OD 值（选择单波长 570nm)，并以 Reed and Muench法计算 TD₅₍₎。

TC₅₀ = lg"¹[lgD-i (∑Pi-0. 5 )]

其中 D为药物最大浓度值， i为相邻剂量间比例的对数， P为药物对细胞生长的抑制率， P= (对照孔 A570—实验孔 A570) /对照孔 A570。

根据 MTT结果确定最大无毒浓度 0¾))。

药物对病毒的抑制试验 VERO细胞接种 96孔细胞培养板，每孔 0.1ml, 37°C, 5 %C02 培养 24小时，弃培养液，每孔接种 50μ1 100 TCID_5Q病毒液，吸附 90min后，弃病毒上清液，根据细胞毒性实验的结果，在无毒范围内，加入不同浓度的药物 ΙΟΟμΙ/孔，并设正常细胞对照组和病毒对照组。然后将培养板置 37°C 5%C0₂ 培养，每日观察 CPE。完全破坏为 4; 破坏 75%为 3 ; 破坏 50%为 2; 破坏 25% 为 1 ; 无病变为 0。约在病毒对照 75%-100%病变时用 MTT法测各孔 570nm波长下 OD值，并以 Reed and Muench法计算药物对病毒生长抑制率及半数有效浓度 IC_5Q。按以下公式计算 IC_{5() :}

半数有效浓度（IC₅Q) =lg— 1 [lgD-i (∑Pi-0. 5 )] 其中 D为药物最大浓度值， 1为相邻剂量间比例的对数， P为药物对病毒生长的抑制率

药物处理组 OD值 -病毒对照组 OD值

P =

细胞对照组 OD值 -病毒对照组 OD值

按照发明内容项下的体外抗病毒试验方法，依法考察黄芩素受试样品对柯萨奇病毒 A16型（Cox A16)、肠道病毒 71型（EV 71 )、柯萨奇病毒 A5型（Cox A5)和柯萨奇病毒 B2型（Cox B2)所致细胞病变的抑制作用，考察结果见下表：

表 2: 黄芩素对不同肠道病毒的抑制作用

实施例 3: 黄苓苷对肠道病毒的抑制作用

试验方法同实施例 2，

依法考察黄芩苷受试样品对柯萨奇病毒 A16型（Cox A16)、肠道病毒 71型（EV 71 )、柯萨奇病毒 A5型（Cox A5)和柯萨奇病毒 B2型

(Cox B2)所致细胞病变的抑制作用，考察结果见下表:

表 3 : 黄芩苷对不同肠道病毒的抑制作用

实施例 4: 黄苓总黄酮提取物 1对肠道病毒的抑制作用

试验方法同实施例 2，

依法考察黄芩总黄酮提取物 1对柯萨奇病毒 A16型（Cox 肠道病毒 71型（EV 71 )、柯萨奇病毒 A5型（Cox A5)和柯萨

B2型 (Cox B2)所致细胞病变的抑制作用，考察结果见下表：

表 4: 黄芩总黄酮提取物 1对不同肠道病毒的抑制作用

黄芩总黄酮提取物 1抗病毒试验结果病毒 TD50( μ g/ml) TD0( μ g/ml) IC50( μ g/ml) TI

柯萨奇病毒 A16型 >400 100 1.605 >25

肠道病毒 EV 71 >400 100 1.531 >25

柯萨奇病毒 A5型 >400 100 1.749 >25

柯萨奇病毒 B2型 >400 100 1.980 >25

实施例 5: 黄苓总黄酮提取物 2对肠道病毒的抑制作用

试验方法同实施例 2，

依法考察黄芩总黄酮提取物 2对柯萨奇病毒 A16型（Cox A16) 肠道病毒 71型（EV 71 )、柯萨奇病毒 A5型（Cox A5)和柯萨奇病

B2型 (Cox B2)所致细胞病变的抑制作用，考察结果见下表:

表 5: 黄芩总黄酮提取物 2对不同肠道病毒的抑制作用

实施例 6: 黄苓素的制剂

取黄芩素适量，按药物 /大豆磷脂摩尔比为 1 : 4投料，用四氢呋喃溶解，搅搅 2小时，旋转蒸发去除溶剂，加入适量甘露醇和 CMC-Na, 用 40 %的叔丁醇溶解，冷冻干燥，临用时加水稀释制成含黄芩素浓度为 0. 5 %的溶液，分装于定量喷雾瓶中，备用。或取黄芩素适量，按药物 /大豆磷脂摩尔比为 1 : 4投料，用四氢呋喃溶解，搅搅 2小时，旋转蒸发去除溶剂制成磷脂复合物，再溶于 0.5 %的 CMC-Na溶液中，制成含黄芩素 0.5 %的溶液，分装于定量喷雾瓶中，备用。实施例 7: 黄苓素用于手足口病临床疗效的观察

病例及分组小儿手足口病患儿 60 例，均符合以下诊断标准： (1)流行病学资料，（2)发热，多为中度或中度以上发热，（3)疱疹，以手足掌部疱疹为特征，疱疹基底部围以红暈，部分病例疱疹发生在肛门周围，（4)口腔疱疹常与手足疱疹同时存在或先于手足部疱疹。将病例随机分为两组，治疗组 30例，对照组 30例，年龄 6个月〜 10 岁。两组在性别、年龄、病程、病情方面无明显差异。治疗方案对照组单用利巴韦林注射液 10-15 mg / kg,加入 5 % 葡萄糖注射液稀释后静脉滴注，每日 1次。治疗组在对照组基础上，配合使用 0.5 %黄芩素喷剂，经口腔及咽喉喷雾给药，每日两次，每次 1 喷，每喷 0. 1ml。 5天为 1疗程，两组均给予常规液体疗法及对症处理。疗效标准治愈：体温正常，皮疹消退，口腔溃疡愈合良好；有效：体温呈下降趋势，皮疹减少，口腔溃疡部分愈合；无效：体温无变化或高于正常，皮疹及口腔溃疡无变化。结果显示，配合使用黄芩素喷剂的治疗组疗效明显优于对照组，两者有统计学意义。治疗组和对照组疗效结果见下表：表 6: 黄芩素对手足口病治疗效果

组别例数治愈有效无效总有效率％治疗组 30 18 10 2 93.3% 对照组 30 10 8 12 60% 经卡方检验， p<0.05，有统计学意义。

Claims

权利要求书

1、黄芩黄酮在制备预防和 /或治疗抗肠道病毒感染药物的应用。

2、根据权利要求 1的应用，其特征在于，所述的黄芩黄酮选自式 (I)所示的黄芩素、式（Π)所述的黄芩苷或黄芩总黄酮提取物，

3、根据权利要求 1 的应用，其特征在于，所述的黄芩素和黄芩苷可由黄芩药材中提取精制制备或通过化学合成方法制备； HPLC法测定，单体含量 90%。

4、根据权利要求 1 的应用，其特征在于，所述的黄芩总黄酮提取物为由黄芩药材经水和 /或醇提取而得，提取物的活性成分由黄芩苷和黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素中的至少一种组成； HPLC法测定，以黄芩苷计算，提取物中总黄酮含量 50%。

5、根据权利要求 1的应用，其特征在于，所述的肠道病毒选自肠道病毒 EV71、柯萨奇病毒（Coxasckie virus)或埃可病毒 (ECHO viruses) 中禾中。

6、根据权利要求 5的应用，其特征在于，所述的柯萨奇病毒包括柯萨奇病毒 A组亚型、柯萨奇病毒 B组亚型。

7、根据权利要求 6 的应用，其特征在于，所述的柯萨奇病毒 A 组亚型包括 A16、 A4、 A5、 A7、 A9和 A10型；所述的柯萨奇病毒 B组亚型包括 B2、 B5、 B13型。

8、根据权利要求 5 的应用，其特征在于，所述的肠道病毒选自柯萨奇病毒包括 Cox A16、 A5和 Cox B 2或肠道病毒 EV71 ,

9、根据权利要求 8 的应用，其特征在于，所述的肠道病毒选自柯萨奇病毒 A 16型或肠道病毒 EV71。

10、一种治疗和预防由肠道病毒引起的手足口病的方法，包括通过口服、注射、吸入或粘膜途径给药给予患者黄芩黄酮制剂，

11、根据权利要求 10 的方法，其特征在于，所述的黄芩黄酮制剂选自黄芩黄酮 /脂质复合物或黄芩黄酮水包油（0/W) 脂肪乳剂。

12、根据权利要求 11的方法，其特征在于，所述的黄芩黄酮 /脂质复合物中黄芩黄酮和脂质重量比例范围为黄芩黄酮：脂质材料 =1 : 19-3 : 1。

13、根据权利要求 12 的方法，其特征在于，所述的脂质材料选自天然脂质、合成脂质以及它们的混合物。

14根据权利要求 13的方法，其特征在于，所述的天然脂质材料选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆醇、胆酸、海藻酸钠或壳聚糖中至少一种。

15、根据权利要求 11 的方法，其特征在于，所述的黄芩黄酮水包油（0/W)脂肪乳剂包括油相、水相、乳化剂、助乳化剂和稳定剂。

16、根据权利要求 11-15中任一的方法，其特征在于，所述的黄芩黄酮选自黄芩素、黄芩苷和黄芩总黄酮提取物。