CN113440562B - 复方鱼腥草合剂在制备预防或治疗冠状病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复方鱼腥草合剂在制备预防或治疗冠状病毒药物中的新应用,体外细胞模型研究显示,复方鱼腥草合剂可有效抑制SARS‑CoV‑2、HCoV‑229E或HCoV‑OC43等冠状病毒活性,具有很好的临床开发价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及复方鱼腥草合剂在制备预防和治疗冠状病毒药物中的新应用,具体涉及复方鱼腥草合剂在制备预防或治疗SARS-CoV-2、HCoV-229E或HCoV-OC43药物中的应用。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus,CoV)为有包膜的单股正链RNA病毒,可引起动物和人的呼吸道、消化道和神经系统的感染,是一种重要的人兽共患病病毒。根据冠状病毒的进化特点,国际病毒分类委员会第九次报告将其分为α、β、γ以及δ四个群。其中,α与β群冠状病毒主要感染哺乳动物,γ与δ群冠状病毒主要感染禽类。
目前,已知的能感染人的冠状病毒有七种,包括引起上呼吸道感染症状普通感冒的人冠状病毒229E(HCoV-229E)、NL63(HCoV-NL63)、HKU1(HCoV-HKU1)、OC43(HCoV-OC43)以及能导致重症呼吸道疾病的严重急性呼吸道综合症冠状病毒(Severe acute respiratorysyndrome coronavirus,SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle east respiratorysyndrome coronavirus,MERS-CoV)和2019新型冠状病毒(Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。其中,三种高致病性的冠状病毒SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2均属于β群冠状病毒;引发的疾病症状较轻的HCoV-229E、HCoV-NL63属于α群冠状病毒。值得关注的是,虽然冠状病毒是引起人类急性呼吸道感染的常见病原体之一,但是,目前尚无批准的特异性药物治疗冠状病毒引起的感染,即使针对由SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2感染引起的严重急性呼吸道患者,临床也主要以对症治疗减少患者并发症为主。即使是前期所推荐的阿比朵尔、达芦那韦等抗流感用药在SARS-CoV-2引起的新型肺炎相关的临床研究中也被证实无效,这是由于SARS-CoV-2与流感病毒在基因遗传、粒子的排列组合方式均不同,两者在宿主细胞的转染机制也不同。因此,已有研究者将抗病毒药物开发转向传统的中药领域,尤其是中药提取物方向。
复方鱼腥草合剂的组方为黄芩、连翘、金银花、鱼腥草、板蓝根,具有清热解毒作用,用于外感风热引起的咽喉疼痛和急性咽炎、扁桃腺炎有风热证候;临床上广泛用于单用或联合抗生素治疗急性上、下呼吸道感染,治疗腮腺炎(致病病毒为腮腺病毒),与利巴韦林等联合应用治疗疱疹性咽颊炎、小儿手口足病(致病病毒为柯萨奇病毒)等,可以有效促进各类症状的恢复,安全性好。此外,也有复方鱼腥草制剂用于流感病毒等体外和动物研究的报道,如张树乘等人(张树乘,赵伟,耿宝星,等.复方鱼腥草糖浆及其治疗脑脊髓炎的制药用途及检测方法[P].中国:CN201610298335.5,2016-07-20.)发现,复方鱼腥草糖浆对单纯疱疹病毒I型(HSV-1)感染小鼠单纯疱疹病毒性脑炎具有较好的治疗作用。在颅内直接注射HSV-1建立稳定的Ba1b/c小鼠的单纯疱疹病毒性脑炎模型中,复方鱼腥草糖浆能明显降低单纯疱疹病毒性脑炎小鼠的死亡率(P<0.05),能显著降低单纯疱疹病毒性脑炎小鼠脑内HSV-1DNA的拷贝数。祖勉等人(祖勉,周丹,高丽,等.临床常用中成药的体外抗流感病毒活性评价[J].药学学报,2010,45(3):408-412)通过评价33种清热解毒中成药的流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制活性,之后应用病毒感染所致细胞病变效应(CPE)抑制模型评价部分NA抑制活性较高的中成药。结果发现复方鱼腥草片在酶活力测定中对H1N1、H3N2、B型流感病毒具有中等抑制作用(IC50分别为286.24±19.36、169.32±3.29、230.39±25.57μg·mL-1),而采用流感病毒(H1N1)诱导的CPE抑制模型,复方鱼腥草片在细胞水平抑制活性较强。可见,复方鱼腥草合剂等对于流感病毒、疱疹病毒、腺病毒等具有很好的抑制作用,其还有抗炎、增强免疫力等作用。
易文龙(双黄连、鱼腥草、大蒜新素注射液抗鼠冠状病毒MHV-3效应的体内外实验研究[D].华中科技大学,2006)报道,在体外细胞模型,鱼腥草注射液具有明显抗鼠冠状病毒小鼠肝炎病毒3型(MHV-3)作用,其抑制效应呈剂量依耐性,可能涉及病毒吸附和穿入以及细胞内增殖等多个环节。K.H.Chiow等在Evaluation of antiviral activities ofHouttuynia cordata Thunb.extract,quercetin,quercetrin and cinanserin onmurine coronavirus and dengue virus infection(鱼腥草提取物,槲皮素,槲皮苷和肉桂硫胺对鼠冠状病毒和登革热病毒的抗病毒活性评估)(Asian Pacific Journal ofTropical Medicine,2016,9(1):1-7.)一文中报道了鱼腥草乙酸乙酯提取部分对小鼠肝炎病毒(MHV)的IC50是0.98μg/mL,且无相关毒性反应;给予小鼠2000mg/kg的鱼腥草乙酸乙酯提取物后也未见急性毒性反应;此外,提取物中的某些黄酮类成分及槲皮素具有较弱的抗病毒活性。MHV-3是冠状病毒科的单正链RNA病毒,敏感小鼠如Balb/c、C57/BL6感染可在肝血窦形成血栓,致肝脏微循环改变,大量肝细胞缺血坏死,引起暴发性病毒肝炎甚至死亡;但MHV-3与SARS-CoV-2在基因同源上有较大的差距,其所导致的临床症状也明显不同,尚未见到MHV-3感染人的相关报道。此外,复方鱼腥草合剂其为鱼腥草等五味药材提取制备的制剂,与鱼腥草注射液、鱼腥草乙酸乙酯提取物的药效组成部分不同,目前也尚未见其有抗冠状病毒活性的报道,但作为清热解毒用药,探索其对于冠状病毒,尤其是SARS-CoV-2的抑制活性,在新型冠状病毒扩散至全球的时期具有重要的开发价值。
发明内容
本发明提供了一种复方鱼腥草合剂在制备预防或治疗冠状病毒药物中的应用,其可以是预防冠状病毒感染,也可以是与冠状病毒同时作用于宿主或宿主细胞时,抑制所述冠状病毒对所述宿主或所述宿主细胞的感染,且具有良好的安全性,具有临床应用的价值。
其中,所述的冠状病毒为SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43,其宿主优先考虑人类。
本发明采用Vero E6细胞模型,细胞毒性测定结果显示复方鱼腥草合剂在稀释1/100倍及以上稀释度对细胞有毒性;复方鱼腥草合剂经稀释1/200倍时在细胞上对SARS-CoV-2病毒有抑制效果,稀释1/400倍时,4个复孔中有1个孔对病毒有抑制效果,提示复方鱼腥草合剂具有体外抑制SARS-CoV-2活性。经计算,复方鱼腥草合剂对SARS-CoV-2的CC50(稀释倍数)=1/100,EC50(稀释倍数)=1/318,SI=3.18。故复方鱼腥草合剂的稀释倍数为m时,其具有抑制SARS-CoV-2活性,且无细胞毒性,m的范围为1/400﹤m﹤1/100;更进一步说,复方鱼腥草合剂抑制SARS-CoV-2的EC50(稀释倍数)=1/318,且无细胞毒性。
同时,复方鱼腥草合剂在Huh7细胞中,受试药物对HCoV-229E的CC50(稀释倍数)=1/20,EC50(稀释倍数)=1/60,其SI为3.00。故复方鱼腥草合剂的稀释倍数n时,其具有抑制HCoV-229E活性,且无细胞毒性,n的范围为1/80﹤n﹤1/20;更进一步说,复方鱼腥草合剂抑制HCoV-229E的EC50(稀释倍数)=1/60,且无细胞毒性。
在H460细胞中,受试药物对HCoV-OC43的CC50(稀释倍数)=1/20,EC50(稀释倍数)=1/104,其SI为5.57。故复方鱼腥草合剂的稀释倍数x时,其具有抑制HCoV-OC43活性,且无细胞毒性,x的范围为1/160﹤x﹤1/20;更进一步说,复方鱼腥草合剂抑制HCoV-OC43的EC50(稀释倍数)=1/104,且其无细胞毒性。
可见,复方鱼腥草合剂可抑制SARS-CoV-2、HCoV-229E和HCoV-OC43等冠状病毒活性,其具有良好的安全性,具有开发用于预防或治疗临床新型冠状病毒肺炎等的医疗价值。其临床给药剂量是10~100mL/次,一日2~3次。
此外,在本发明的治疗方法中,复方鱼腥草合剂也可以与其他抗病毒剂联合使用。
本发明的有益效果为:本发明提供复方鱼腥草合剂在制备预防或治疗冠状病毒药物中的应用,主要用于抑制SARS-CoV-2、HCoV-229E和HCoV-OC43等冠状病毒活性,解决临床上抗SARS-CoV-2、HCoV-229E和HCoV-OC43冠状病毒特异性药物缺乏的问题。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版,科学出版社,2005)等本领域常用工具书中所述的条件,或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1:复方鱼腥草合剂在Vero E6细胞中的毒性测试及抗SARS-CoV-2效果
1、实验目的
在疫情应急期间,通过细胞水平评价中药市售成药的Vero E6细胞毒性测试和抗SARS-CoV-2效果。
2、实验材料
2.1受试药物:复方鱼腥草合剂。
2.2细胞:Vero E6细胞,由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心保存。
2.3病毒:SARS-CoV-2,滴度为105TCID50/mL,由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心-80℃保存。使用病毒滴度为100TCID50。
3、实验方法
3.1样品准备
受试药物:浙江康恩贝中药有限公司生产的复方鱼腥草合剂(批号A191031,生产日期2019年10月16日,有效期2年)。
3.2受试药物细胞毒性实验
(1)无菌96孔培养板,每孔加入100μL浓度为5×104cell/mL Vero E6细胞,37℃5%CO2孵箱培养24h;
(2)受试药物用DMEM培养基(含2%双抗和16μg/mL胰蛋白酶)分别倍比系列稀释,1/25,1/50,1/100,……1/3200共8个稀释度;
(3)弃去步骤(1)中96孔培养板中细胞培养液,分别加入步骤(2)稀释好的药物,每孔100μL,每个浓度4个复孔,每孔100μL DMEM培养基(含2%双抗和16μg/mL胰蛋白酶);
(4)同时设立细胞对照:每孔200μL DMEM培养基(含2%双抗和16μg/mL胰蛋白酶)加入至长成每层的Vero E6细胞96孔培养板中,共4个复孔;
(5)37℃,5%CO2孵箱孵育3d;
(6)光学显微镜下观察细胞病变(CPE),细胞有CPE变化记录为“+”,细胞无CPE变化或正常细胞形态记为“-”。
3.3受试药物抗病毒试验
(1)无菌96孔培养板,每孔加入100μL浓度为5×104cell/mL Vero E6细胞,37℃5%CO2孵箱培养24h;
(2)受试药物用DMEM培养基(含2%双抗和16μg/mL胰蛋白酶)分别倍比系列稀释1/200,1/400,1/800,……1/24000共8个稀释度,每个浓度4个复孔,每孔100μL DMEM培养基(含2%双抗和16μg/mL胰蛋白酶),然后每孔再加入等体积100TCID50病毒,37℃,5%CO2孵箱作用1h;
(3)1h后,弃去步骤(1)中96孔培养板中细胞培养液,加入步骤(2)混合液;
(4)同时设立细胞对照和病毒对照(阴性对照);
(5)细胞37℃,5%CO2孵箱孵育4~5d;
(6)光学显微镜下观察细胞病变(CPE),细胞有CPE变化记录为“+”,细胞无CPE变化或正常细胞形态记录为“-”。
3.4实验条件:以上实验操作均在BSL-3实验室内完成。
3.5药物效果计算:
(1)药物对细胞半数中毒浓度(CC50)
A:大于50%细胞病变率的百分数,B:小于50%细胞病变率的百分数,C:log(稀释倍数),D:log(小于50%细胞病变率所对应的药物浓度)。
(2)药物抑制病毒百分率
(3)药物抑制病毒半数有效浓度(EC50)
A:大于50%抑制率的百分数,B:小于50%抑制率的百分数,C:log(稀释倍数),D:log(小于50%抑制率所对应的药物浓度)。如药物无抑制病毒作用将无法测得EC50。
3.6药物效果计算:
药效评价指标:选择指数(Selection Index,SI)指药物对细胞50%毒性浓度与对病毒50%抑制浓度的比值(CC50/EC50),或者表示药物对细胞最大无毒浓度与对病毒最小有效浓度的比值(CC0/EC0),为判断药物效果的安全范围。选择指数大于1.00为药物有效,指数越大安全范围越大,安全性越高。
4、实验结果
4.1受试药物细胞毒性试验
药物分别设置8个稀释倍数,细胞毒性测定结果显示受试药物在稀释1/100倍及以上稀释度对细胞有毒性,结果见表1,根据CC50计算公式,结合中药特性,得出CC50(稀释倍数)=1/100。
表1.药物毒性结果
注:“+”为细胞有CPE变化,“-”为细胞无CPE变化或正常细胞形态。
4.2受试药物抗病毒试验
药物分别设置8个稀释倍数,受试药物在稀释1/200倍时在细胞上对病毒有抑制效果,稀释1/400倍时,4个复孔中有1个孔对病毒有抑制效果,结果见表2,根据EC50计算公式,结合中药特性,得出EC50(稀释倍数)=1/318。
表2.药物抗SARS-CoV-2效果
注:“+”为细胞有CPE变化,“-”为细胞无CPE变化或正常细胞形态。
5、结论:
根据细胞水平的筛选结果,复方鱼腥草合剂CC50(稀释倍数)=1/100,EC50(稀释倍数)=1/318,SI=3.18。
实施例2:复方鱼腥草合剂在Huh7细胞中的毒性测试及抗HCoV-229E效果
试验操作方法参考实施例1。
实验结果:在Huh7细胞中,受试药物CC50(稀释倍数)=1/20,EC50(稀释倍数)=1/60,其SI为3.00。
实施例3:复方鱼腥草合剂在H460细胞中的毒性测试及抗HCoV-OC43效果
试验操作方法参考实施例1。
实验结果:在H460细胞中,受试药物CC50(稀释倍数)=1/20,EC50(稀释倍数)=1/104,其SI为5.57。
Claims (1)
1.复方鱼腥草合剂在制备预防或治疗冠状病毒药物中的应用,其特征在于,所述冠状病毒为SARS-CoV-2、HCoV-229E或HCoV-OC43中的一种或几种,所述复方鱼腥草合剂组分为黄芩,连翘,金银花,鱼腥草和板蓝根。
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