CN106344549B

CN106344549B - 大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用

Info

Publication number: CN106344549B
Application number: CN201610944645.XA
Authority: CN
Inventors: 萧伟; 曹泽彧; 丁玥; 孙兰; 曹亮; 王振中
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-11-02
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2036-11-02
Also published as: CN106344549A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，特别涉及大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。本发明通过实验证明了大黄酸对多种能够引导手足口病的病毒株诱导的细胞病变均有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率；同时在体内可以抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，从而具有治疗手足口病的作用与应用价值。

Description

大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。

背景技术

手足口病是由病毒引起的儿童传染病，为我国法定丙类传染病。该病主要感染0-6岁的婴幼儿，以2-3岁儿童感染最为常见，手足口病发病初期在患儿四肢末端以及口腔等出引起疱疹或溃疡，患儿多在1-2周内痊愈。然而，少数病例病情进展迅速，可在发病1-5天左右出现脑膜炎、无菌性脑炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、肺水肿以及循环障碍等，极少数病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遗症。

根据世界卫生组织报告，能够引起手足口病症状的病毒大约有20多种，其中以肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A16，CoxA16)最为常见，由这两种病毒感染引起的病例数约占总病例数70％以上。其他能够引起手足口病的病毒主要包括：柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型(CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯萨奇病毒B组2和5型(CoxB2和CoxB5)以及埃可病毒(ECHO)等。目前，尽管针对EV71病毒的疫苗已经获批上市，但仍没有直接靶向病毒的药物，临床主要采取对症治疗的策略。

目前，常见的抗手足口病药物有利巴韦林等核苷类似物类药物，但是这些药物易诱发溶血性贫血等不良反应；同时，作为核苷类似物类药物对婴幼儿生长发育具有潜在的抑制作用，临床用于婴幼儿时需慎重权衡获益与风险。

近年来，中药抗手足口病的研究逐渐引起人们的关注，而且由于很多中药组分属于天然提取药物，具有副作用小等优点。

大黄酸(rhein)，具有式Ⅰ所示结构，属于蒽醌类化合物，可从蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)的根茎、何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)的根、豆科植物狭叶番泻(Cassia angustifolia Vahl)的荚、芸香科植物芸香(Ruta graveolens L.)的全草以及百合科植物麝香萱(Hemerocallis thunbergii Bak.)的根中提取，药理研究表明大黄酸具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、利尿、泻下和免疫调节等作用。

目前未见大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中应用的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。本发明研究结果表明，大黄酸对肠道病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率；同时在体内可以抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，从而具有治疗手足口病的作用；并可预防病毒在体内的增殖和扩散，保护正常组织免受损伤，起到预防病毒感染性疾病发生的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。

在本发明中，大黄酸为大黄酸单体和/或大黄酸提取物。

作为优选，大黄酸提取物中，大黄酸单体的含量在90％以上，本发明可按照常规方法从含有大黄酸的中药材或者中药饮片中提取得到，如掌叶大黄和何首乌等；也可购买大黄酸的市售商品。

在本发明中，手足口病的致病病毒为A型柯萨奇病毒、B型柯萨奇病毒、肠道病毒或埃可病毒中的一种或几种。

在本发明提供的实施例中，A型柯萨奇病毒为CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9或CoxA10中的一种或几种。

在本发明提供的实施例中，B型柯萨奇病毒为CoxB2或CoxB5中的一种或两种。

在本发明中，肠道病毒为肠道病毒71型。

作为优选，大黄酸的活性剂量为50～400mg/kg/d。

优选地，大黄酸的活性剂量为50～200mg/kg/d。

更优选地，大黄酸的活性剂量为100～200mg/kg/d。

在本发明提供的实施例中，预防和/或治疗手足口病药物包括大黄酸和药学上可接受的载体。

在本发明中，药学上可接受的载体包括淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用碳酸氢钠、注射用大豆磷脂或注射用甘油中的一种或几种。

作为优选，预防和/或治疗手足口病药物的剂型为口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

在本发明中，预防和/或治疗手足口病药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。

作为优选，口服给药剂型中，大黄酸的质量分数为16.7％～88.9％。

优选地，口服给药剂型中，大黄酸的质量分数为20％～80％。

优选地，口服给药剂型中，大黄酸的质量分数为25％～75％。

作为优选，口服给药剂型的口服剂量为1.0～5.0mg大黄酸/kg人体体重/d。

优选地，口服给药剂型的口服剂量为0.5～2.5mg大黄酸/kg人体体重/d。

更优选地，口服给药剂型的口服剂量为0.625～2.0mg大黄酸/kg人体体重/d。

作为优选，注射给药剂型的注射剂量为0.5～2.5mg大黄酸/kg人体体重/d。

优选地，注射给药剂型的注射剂量为0.625～2.0mg大黄酸/kg人体体重/d。

本发明对所述包含大黄酸的抗手足口病药物的制备方法没有特殊的限制，按照本领域技术人员常用的制药方法即可。

本发明提供了大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。本发明具有如下有益效果之一：

本发明采用了MTS法测定了大黄酸对柯萨奇病毒A16型和肠道病毒EV71型的抑制活性，结果表明，大黄酸在体外对柯萨奇病毒A16、肠道病毒EV71，EC₅₀分别为86.13μmol/L和102.29μmol/L，SI分别为7.17和6.04；

本发明通过大黄酸对手足口病病原体的广谱抑制实验，实验结果显示0.15mM大黄酸对多种能够引起手足口病的病毒均具有明显的抑制作用，抑制率从52.9％～74.6％不等。表明大黄酸在抑制手足口病毒方面具有广谱性；

本发明以灌胃(口服)的方式进行了大黄酸对肠道病毒EV71型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，大黄酸在剂量100/200/400mg/kg/day时灌胃给药5天，小鼠的存活率分别为40％、60％和80％，呈剂量依赖关系；阳性对照药利巴韦林的小鼠存活率为70％；

本发明以灌胃(口服)的方式进行了大黄酸对柯萨奇病毒A16型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，大黄酸在剂量50/100/200mg/kg/day时灌胃给药5天，小鼠的存活率分别为55.6％、66.7％和77.8％，呈剂量依赖关系；阳性对照药利巴韦林的小鼠存活率为88.9％；

可见，大黄酸与阳性对照药利巴韦林对柯萨奇病毒A16型和肠道病毒EV71型的抑制效果相似，大黄酸可以抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，从而具有治疗手足口病的作用。

具体实施方式

本发明公开了大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用中所用药物及生物材料均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1大黄酸体外抗手足口病毒活性实验

1、实验材料：

柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，购于美国ATCC细胞库，由江苏康缘现代中药研究院保存。

DMEM培养基，购自江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20141024，细胞生长液中含10％胎牛血清、1×10⁵U/L青霉素、100mg/L链霉素。大黄酸，由江苏康缘药业股份有限公司自制，纯度99.06％。利巴韦林注射液，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1mL:0.1g，批号：140312。

M2e型酶标仪，Molecular Devices；移液器，eppendorf公司；生物安全柜，购自Heal Force公司，型号：HFsafe-1200；二氧化碳培养箱，购自Thermo Scientific公司，型号：Forma Steri-Cycle 371。

2、实验方法：

非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)用含2％胎牛血清的DMEM培养基按1×10⁵个/mL浓度接种96孔培养板，每孔100μL，加入用无血清DMEM培养基稀释至100TCID₅₀病毒，每孔50μL。用无血清DMEM培养基将大黄酸配制成不同浓度分别处理细胞，设3个复孔，同时设置正常组(既不攻毒也不加药)和模型组(只攻毒不加药)。Vero细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。加入100μL PBS溶液洗涤96孔2次，加入用无血清DMEM培养基稀释10倍的MTS试剂，每孔100μL，37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h，酶标仪490nm测定吸光度(A)。计算病毒抑制率＝[A(样品组)-A(模型组)]/[A(正常组)-A(模型组)]×100％，并计算大黄酸对两种流感病毒细胞的EC₅₀(半数有效浓度)、SI(选择指数)。

表1大黄酸体外抗病毒试验(μM)

表1结果显示：大黄酸对肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A16型具有一定的抑制作用，EC₅₀分别为102.29和86.13μM，SI分别为7.17和6.04，实验结果表明大黄酸对以上毒株体外复制具有抑制作用，提高了病毒感染细胞的存活率，具备应用于柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型感染治疗的体外活性基础。

实施例2大黄酸对手足口病病原体的广谱抑制作用

1、实验材料：

柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型(CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯萨奇病毒B组2和5型(CoxB2和CoxB5)以及埃可病毒(ECHO)。临用前测定各病毒TCID₅₀分别为10^6.6、10^7.2、10^7.5、10^5.5、10⁸、10^6.3、10⁷和10^5.8/mL，上述病毒均由中科院武汉病毒研究所提供。

2、实验方法：

非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)用含2％胎牛血清的DMEM培养基按1×10⁵个/mL浓度接种96孔培养板，每孔100μL，加入用无血清DMEM培养基稀释至100TCID₅₀病毒，每孔50μL。用含0.15mM大黄酸的无血清DMEM培养基处理细胞，设3个复孔，同时设置正常组(既不攻毒也不加药)和模型组(只攻毒不加药)。Vero细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。加入100μLPBS溶液洗涤96孔2次，加入用无血清DMEM培养基稀释10倍的MTS试剂，每孔100μL，37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h，酶标仪490nm测定吸光度(A)。计算病毒抑制率＝[A(样品组)-A(模型组)]/[A(正常组)-A(模型组)]×100％。

表2大黄酸对多种手足口病病原体的抑制率(％，n＝3)

病毒	抑制率(％)
		CoxA4	67.0±3.7
CoxA5	58.3±4.9
		CoxA7	61.5±2.1
CoxA9	74.6±5.3
		CoxA10	52.9±2.9
CoxB2	65.8±3.5
		CoxB5	64.5±4.4
ECHO	70.9±5.2

如表2所示，0.15mM大黄酸对多种能够引起手足口病的病毒均具有明显的抑制作用，抑制率从52.9-74.6％不等。本实施例表明，大黄酸在抑制手足口病毒方面具有广谱性。

实施例3大黄酸灌胃对肠道病毒EV 71型感染的治疗作用

1、实验材料：

肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。SPF级怀孕15-16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18-28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150-300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。利巴韦林颗粒，购自葵花药业集团(衡水)得菲尔有限公司，国药准字H20066463，规格：50mg/袋，批号：130654。

2、实验方法：

3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林组200mg/kg/d、大黄酸低剂量组100mg/kg/d，中剂量组200mg/kg/d，高剂量组400mg/kg/d，每组10只，除正常组外，其余各组腹腔注射EV71病毒液(10⁷TCID₅₀)，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1mL，连续5天，正常组和模型组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，并根据下列标准评分：

0分：健康；

1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；

2分：后肢力量减弱；

3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；

4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；

5分：濒死或死亡。

计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。

表3大黄酸灌胃对肠道病毒EV71感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)

注：P与模型组比较。

表4大黄酸灌胃对肠道病毒EV71感染Babl/c乳鼠的死亡保护作用(n＝10)

注：**P＜0.01，*P＜0.05与模型组比较。

上述研究表明，大黄酸各剂量组进行治疗性给药后，可以显著减缓肠道病毒EV71感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异；大黄酸高、中、低剂量的死亡保护率分别为80％、60％和40％，表明大黄酸各剂量组感染程度均明显减少肠道病毒EV71感染乳鼠死亡率和感染程度，与模型组比较具有显著性差异，提示大黄酸对肠道病毒EV71感染具有治疗作用。

实施例4大黄酸注射对柯萨奇病毒A16型感染的治疗作用

1、实验材料：

柯萨奇病毒A16型(Cox A16)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。SPF级怀孕15-16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18～28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。利巴韦林注射液，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1mL：0.1g，批号：140312。

2、实验方法：

3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林组100mg/kg/d、大黄酸低剂量组50mg/kg/d，中剂量组100mg/kg/d，高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射柯萨奇病毒A16型(CoxA16)病毒液(10⁷TCID₅₀)，0.1mL/只，各给药组以注射给药，每次0.1mL，连续5天，正常组和模型组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，并根据下列标准评分：

0分：健康；

1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；

2分：后肢力量减弱；

3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；

4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；

5分：濒死或死亡。

计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。

表5大黄酸注射对柯萨奇病毒A16型感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)

注：P与模型组比较。

表6大黄酸注射对柯萨奇病毒A16型感染Babl/c乳鼠死亡的保护作用(n＝10)

注：**P＜0.01，*P＜0.05与模型组比较。

上述研究表明，大黄酸各剂量组进行治疗性给药后，可以显著减缓柯萨奇病毒A16型感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异。大黄酸高、中、低剂量的死亡保护率分别为77.8％、66.7％和55.6％，表明大黄酸各剂量组感染程度均明显减少柯萨奇病毒A16型感染乳鼠死亡率和感染程度，与模型组比较具有显著性差异，提示大黄酸对柯萨奇病毒A16型感染具有治疗作用。

实施例5大黄酸在制备胶囊剂药物中的应用

将300g大黄酸和32g淀粉、6g低取代羟丙基纤维素、4.5g微粉硅胶、1.5g硬脂酸镁、及适量10％淀粉浆混合，装入胶囊，得到大黄酸的胶囊制剂1000粒。每日3次，每次1粒。

实施例6大黄酸在制备颗粒剂药物中的应用

将300g大黄酸和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常规方法制成1000包大黄酸颗粒剂。每日3次，每次1粒。

实施例7大黄酸在制备片剂药物中的应用

将300g大黄酸和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉钠、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸镁及适量10％淀粉浆适混合，按照常规方法制成大黄酸片剂1000片。每日3次，每次1片。

实施例8大黄酸在制备丸剂药物中的应用

将300g大黄酸和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、适量液状石蜡混合，按照常规方法制成大黄酸丸剂1000粒。每日3次，每次1粒。

实施例9大黄酸在制备注射剂药物中的应用

将400g大黄酸粉末按照常规方法制成大黄酸分针剂1000支(A瓶)，另将50gNaHCO₃溶于1000mL注射用水，按照常规方法制成NaHCO₃注射液1000支(B瓶)，临用前采用B瓶中溶液将A瓶中粉末预溶解，再至少采用250mL0.9％氯化钠注射液稀释后静脉滴注。每日1次，每次1支。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.大黄酸在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用；

所述手足口病的致病病毒为A型柯萨奇病毒、B型柯萨奇病毒、肠道病毒或埃可病毒中的一种或几种；所述B型柯萨奇病毒为CoxB2或CoxB5中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述A型柯萨奇病毒为CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9或CoxA10中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠道病毒为肠道病毒71型。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大黄酸的活性剂量为50～400mg/kg/d。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗手足口病药物包括大黄酸和药学上可接受的载体。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗手足口病药物的剂型为口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述口服给药剂型中，大黄酸的质量分数为16.7％～88.9％。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述口服给药剂型的口服剂量为1.0～5.0mg大黄酸/kg人体体重/d；所述注射给药剂型的注射剂量为0.5～2.5mg大黄酸/kg人体体重/d。