CN106309455B

CN106309455B - 贝母辛的用途

Info

Publication number: CN106309455B
Application number: CN201610680731.4A
Authority: CN
Inventors: 萧伟; 丁玥; 曹泽彧; 曹亮; 王振中; 丁岗; 胡晗绯
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2036-08-16
Also published as: CN106309455A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及贝母辛的用途。本发明提供贝母辛在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用，本发明实验结果表明，贝母辛对肠道病毒诱导的细胞病变有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率；同时在体内可以抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，从而具有治疗手足口病的作用；并可预防病毒在体内的增殖和扩散，保护正常组织免受损伤，起到预防病毒感染性疾病发生的作用。

Description

贝母辛的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及贝母辛的用途。

背景技术

手足口病是由病毒引起的儿童传染病，为我国法定丙类传染病。该病主要感染0～6岁的婴幼儿，以2～3岁儿童感染最为常见，手足口病发病初期在患儿四肢末端以及口腔等出引起疱疹或溃疡，患儿多在1～2周内痊愈。然而，少数病例病情进展迅速，可在发病1～5天左右出现脑膜炎、无菌性脑炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、肺水肿以及循环障碍等，极少数病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遗症。

根据世界卫生组织报告，能够引起手足口病症状的病毒大约有20多种，其中以肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A16，CoxA16)最为常见，由这两种病毒感染引起的病例数约占总病例数80％以上。

模型是化合物活性及作用机理的载体，手足口病毒感染可诱导多种细胞凋亡，包括人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)、神经上皮瘤细胞(SK-N-MC)、人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH、)成胶质细胞瘤细胞(SF268)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、人微血管内皮细胞以及HeLa细胞等，在实际的研究中由于RD细胞和Vero细胞对病毒的敏感性较好，常用于细胞水平的抗病毒研究。在动物模型方面，1～7日龄的小鼠对病毒敏感，常用作动物模型。小鼠接种病毒后3～5天出现拒乳和体重下降等症状，6～8天四肢出现僵直性瘫痪等明显症状，9～13天后根据病情自愈或死亡。

目前，尽管针对EV71病毒的疫苗已经获批上市，但仍没有直接靶向病毒的药物，临床主要采取对症治疗的策略。常见的抗手足口病药物为广谱抗病毒药物，例如：利巴韦林、阿昔洛韦、伐昔洛韦等。但是这些广谱抗病毒药物的药副作用较强，以最常见的利巴韦林为例，其应用于婴幼儿时有致畸和抑制生长发育的风险。近年来，中药抗手足口病的研究逐渐引起人们的关注，而且由于很多中药组分属于天然提取药物，具有副作用小等优点。因此，应进一步对中药或中药提取物进行研究，以期寻找副作用更小、更加安全的防治手足口病的药物。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供贝母辛的用途，本发明实验表明，贝母辛能够起到防治手足口病的作用且更加安全。

贝母辛(Peimisine)，具有式I所示结构，是从百合科植物平贝母(Fritillariaussuriensis Maxim.)中提取的生物碱类成分，药理研究表明贝母辛具有抗溃疡、祛痰、降血压及中枢抑制等多种作用。

本发明提供了贝母辛在制备防治肠道病毒感染的药物中的应用。

本发明实施例中，肠道病毒为肠道病毒71型(EV71)或柯萨奇病毒。

本发明实施例中，贝母辛能够抑制EV71所致的细胞病变，所述细胞为Vero细胞。且贝母辛能够降低EV71感染乳鼠的死亡率，减缓EV71感染引起的消瘦、后肢力量减弱、单侧后肢瘫痪等症状。

具体的，以EV71病毒感染的细胞为模型，在细胞培养体系中添加贝母辛，结果表明，贝母辛能够对EV71所致的细胞病变具有明显的抑制作用。贝母辛抑制EV71所致细胞病变的半数有效浓度(EC₅₀)为132.11μmol/L，半数毒性浓度(TC50)为780.21μmol/L，选择指数(SI)为5.91。该效果与常用抗病毒药物利巴韦林相比，虽EC₅₀值高于利巴韦林，但是其半数毒性浓度却显著低于利巴韦林(p<0.01)，进而使贝母辛的选择指数显著高于利巴韦林(p<0.01)。故而能够认为，在有效范围内贝母辛的用药安全性优于利巴韦林。

以EV71病毒感染的乳鼠为模型，灌胃给予贝母辛，结果表明，贝母辛能够对EV71病毒感染的乳鼠起到良好的治疗作用，贝母辛高、中、低剂量的死亡保护率分别为75.00％、50.00％、12.50％，生命延长率分别为78.45％、59.26％、35.61％，表明贝母辛各剂量组感染程度均显著减少EV71病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异(p<0.05)。实验表明，贝母辛治疗EV71病毒感染的剂量为50mg/kg/d～200mg/kg/d。优选为100mg/kg/d～200mg/kg/d；更优选为200mg/kg/d。该剂量经换算低于半数毒性浓度(TC50)，说明在有效范围内，贝母辛具有良好的安全性。

由于肠道病毒侵入宿主的过程相似，基于贝母辛能够对EV71病毒感染起到良好的防治作用，进而认为贝母辛对其他肠道病毒的感染也能够起到良好的防治作用。

本发明实施例中，柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。

本发明实施例中，贝母辛能够抑制CoxA16所致的细胞病变，所述细胞为Vero细胞。且贝母辛能够降低CoxA16感染乳鼠的死亡率，减缓CoxA16感染引起的消瘦、后肢力量减弱、单侧后置瘫痪等症状。

具体的，以CoxA16病毒感染的细胞为模型，在细胞培养体系中添加贝母辛，结果表明，贝母辛能够对CoxA16所致的细胞病变具有明显的抑制作用。贝母辛抑制CoxA16所致细胞病变的半数有效浓度(EC₅₀)为109.71μmol/L，半数毒性浓度(TC50)为780.21μmol/L，选择指数(SI)为7.11。该效果与常用抗病毒药物利巴韦林相比，虽EC₅₀值高于利巴韦林，但是其半数毒性浓度却显著低于利巴韦林，进而使贝母辛的选择指数显著高于利巴韦林。故而能够认为，在有效范围内贝母辛的用药安全性优于利巴韦林。

以CoxA16病毒感染的乳鼠为模型，灌胃给予贝母辛，结果表明，贝母辛能够对CoxA16病毒感染的乳鼠起到良好的治疗作用，贝母辛高、中、低剂量的死亡保护率分别为66.67％、44.44％、11.11％，生命延长率分别为83.56％、65.33％、43.58％，表明贝母辛各剂量组感染程度均显著减少CoxA16病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异(p<0.05)。实验表明，贝母辛治疗CoxA16病毒感染的剂量为50mg/kg/d～200mg/kg/d。优选为100mg/kg/d～200mg/kg/d；更优选为200mg/kg/d。该剂量经换算低于半数毒性浓度(TC50)，说明在有效范围内，贝母辛具有良好的安全性。

由于柯萨奇病毒侵入宿主的过程相似，基于贝母辛能够对CoxA16病毒感染起到良好的防治作用，进而认为贝母辛对其他柯萨奇病毒的感染也能够起到良好的防治作用。例如：柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型(CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯萨奇病毒B组2和5型(CoxB2和CoxB5)。

基于以上效果，本发明提供了贝母辛在制备防治手足口病的药物中的应用。

本发明实施例中，手足口病为由肠道病毒引起的手足口病。

一些具体实施例中，所述肠道病毒为EV71或柯萨奇病毒。优选的，所述柯萨奇病毒为CoxA16。

本发明实施例中，贝母辛防治手足口病的剂量为50mg/kg/d～200mg/kg/d。优选为100mg/kg/d～200mg/kg/d；更优选为200mg/kg/d。

本发明还提供了一种防治手足口病的药物，其中包括贝母辛。

本发明提供的防治手足口病的药物中，还包括药学上可接受的辅料。

本发明提供的防治手足口病的药物中贝母辛的质量分数为17.5％～88％；优选为20％～80％，更优选为25％～75％。

本发明提供的防治手足口病的药物的剂型为口服制剂、注射剂、气雾剂、贴剂或栓剂。

所述口服制剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、凝胶剂。

所述注射剂的剂型为注射液剂或注射用粉针剂。

本发明实施例中提供的防治手足口病的药物的剂型为，片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或注射液剂。

一些实施例中，防治手足口病的片剂中包括：贝母辛、淀粉、羧甲基淀粉钠、滑石粉、糊精、硬脂酸镁和淀粉浆。

具体的，贝母辛、淀粉、羧甲基淀粉钠、滑石粉、糊精与硬脂酸镁的质量比为350：5:7.5:0.8:50:0.8。

一些实施例中，防治手足口病的胶囊剂的内容物中包括：贝母辛、淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁和淀粉浆。

具体的，贝母辛、淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶与硬脂酸镁的质量比为350:32:6:4.5:1.5。

一些实施例中，防治手足口病的颗粒剂中包括：贝母辛、蔗糖和糊精。

具体的，贝母辛、蔗糖和糊精的质量比为350:1000:500。

一些实施例中，防治手足口病的丸剂中包括：贝母辛、聚乙二醇-6000和聚山梨酯-80。

具体的，贝母辛、聚乙二醇-6000和聚山梨酯-80的质量比为350:12:80.5。

一些实施例中，防治手足口病的注射液剂中包括：贝母辛、大豆磷脂、甘油和水。

具体的，贝母辛的浓度为200g/L；大豆磷脂的浓度为15g/L；甘油的浓度为25g/L。

注射时，将防治手足口病的注射液剂稀释后，静脉滴注；所述稀释采用5％葡萄糖注射液；所述稀释的比例为1:250。

本发明同时还提供了一种防治手足口病的方法，其为给予本发明提供的防治手足口病的药物。所述给予为口服或注射。

本发明提供的防治手足口病的药物每天的口服剂量以贝母辛的质量计为0.5mg/kg人体体重～2.5mg/kg人体体重。优选为0.625mg/kg人体体重～2.5mg/kg人体体重。

本发明提供的防治手足口病的药物每天的注射剂量以贝母辛的质量计为0.5mg～2.5mg/kg人体体重。优选为0.625mg/kg人体体重～2.5mg/kg人体体重。

本发明提供贝母辛在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用，本发明实验结果表明，贝母辛对肠道病毒诱导的细胞病变有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率；同时在体内可以抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，从而具有治疗手足口病的作用；并可预防病毒在体内的增殖和扩散，保护正常组织免受损伤，起到预防病毒感染性疾病发生的作用。实验表明，贝母辛对EV71病毒的EC50值为132.11μmol/L，半数毒性浓度(TC50)为780.21μmol/L，选择指数(SI)为5.91。对CoxA16所致细胞病变的半数有效浓度(EC₅₀)为109.71μmol/L，半数毒性浓度(TC50)为780.21μmol/L，选择指数(SI)为7.11。其安全性显著优于利巴韦林(p<0.01)。

具体实施方式

本发明提供了贝母辛的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中，所述防治是指预防和/或治疗，或预防和/或治理。

本发明所述贝母辛具有式I结构，其可通过化学方法制备，亦可通过对含有贝母辛的物质中提取。所述含有贝母辛的物质为含有贝母辛的中药材或者中药饮片；优选为平贝母。所述经提取制备的贝母辛中，贝母辛单体的质量分数不低于90％。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，贝母辛来自中国药品生物制品检定所。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1，贝母辛对EV71和CoxA16病毒感染细胞的保护作用

1、实验材料：

柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV 71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，购于美国ATCC细胞库，由江苏康缘现代中药研究院保存。

DMEM培养基，购自南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20141024，细胞生长液中含10％胎牛血清、1×10⁵U/L青霉素、100mg/L链霉素。细胞维持液中除含2％胎牛血清外，其它同细胞生长液。贝母辛，纯度98％，市售。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml:0.1g，批号：140312。

M2e型酶标仪，Molecular Devices；移液器，eppendorf公司；生物安全柜，购自Heal Force公司，型号：HFsafe-1200；二氧化碳培养箱，购自Thermo Scientific公司，型号：FormaSteri-Cycle 371。

2、实验方法：

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)用含2％胎牛血清的DMEM培养基按5×10⁴个/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl，置37℃5％CO₂培养箱中培养过夜形成细胞单层。弃上清后，用PBS将细胞洗涤1次，以洗去残留的胎牛血清，加入用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释至100TCID₅₀各株病毒(EV71和CoxA16)，每孔100μl，35℃孵育2h后，弃去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培养基将贝母辛配制成不同浓度，分别加入单层Vero细胞中，设3个复孔，Vero细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，每日观察细胞病变现象。48h后，弃上清后，加入100μl10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)结晶紫染色15min，酶标仪570nm测定吸光度。实验共重复3次。计算贝母辛对两种病毒的TC₅₀(半数毒性浓度)、EC₅₀(半数有效浓度)、SI(选择指数)。

表1贝母辛体外抗病毒试验(μM)

表1结果显示：贝母辛在体外对EV71和CoxA16病毒所致细胞病变具有明显抑制作用，其EC₅₀分别为132.11、109.71μM，SI分别为5.91、7.11；具备应用于抗手足口病毒感染治疗的体外药效学基础。

实施例2，贝母辛口服给药对EV71感染的治疗作用

1、实验材料：

肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

SPF级怀孕15-16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18～28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。

贝母辛，纯度98％，市售。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml:0.1g，批号：140312。

2、实验方法：

3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林颗粒组100mg/kg/d、贝母辛低剂量组50mg/kg/d，中剂量组100mg/kg/d，高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射EV71病毒悬液(10⁷TCID₅₀)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。

表2贝母辛灌胃给药对EV71感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)

组别	剂量(mg/kg/d)	0分	1分	2分	3分	4分	5分	P
									正常组	-	10	0	0	0	0	0	-
模型组	-	0	0	0	0	2	8	-
									利巴韦林组	100	0	4	2	1	1	2	＜0.01
高剂量组	200	0	3	3	1	1	2	＜0.01
									中剂量组	100	0	2	1	2	1	4	＜0.01
低剂量组	50	0	0	0	1	2	7	＜0.05

P示与模型组比较

表3贝母辛灌胃给药对EV71感染Babl/c乳鼠的死亡保护作用

**P<0.01，*P<0.05与模型组比较

表2结果显示，贝母辛各剂量组灌胃给药后，可以显著减缓EV71病毒感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异；表3结果显示，贝母辛高、中、低剂量的死亡保护率分别为75.00％、50.00％、12.50％，生命延长率分别为78.45％、59.26％、35.61％，表明贝母辛各剂量组感染程度均明显减少EV71病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示贝母辛对手足口病毒感染具有治疗作用。

实施例3，贝母辛口服给药对CoxA16感染的治疗作用

1、实验材料：

柯萨奇病毒A16型(Cox A16)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

2、实验方法：

3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林颗粒组100mg/kg/d、贝母辛低剂量组50mg/kg/d，中剂量组100mg/kg/d，高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射CoxA16病毒悬液(107TCID₅₀)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。

表4贝母辛灌胃给药对CoxA16感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)

组别	剂量(mg/kg/d)	0分	1分	2分	3分	4分	5分	P
									正常组	-	10	0	0	0	0	0	-
模型组	-	0	0	0	0	1	9	-
									利巴韦林组	100	0	2	2	1	1	4	＜0.01
高剂量组	200	0	2	3	1	1	3	＜0.01
									中剂量组	100	0	2	1	1	1	5	＜0.01
低剂量组	50	0	0	0	1	1	8	＜0.05

P示与模型组比较

表5贝母辛灌胃给药对CoxA16感染Babl/c乳鼠的死亡保护作用

**P<0.01，*P<0.05与模型组比较

表4结果显示，贝母辛各剂量组灌胃给药后，可以显著减缓CoxA16病毒感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异；表5结果显示，贝母辛高、中、低剂量的死亡保护率分别为66.67％、44.44％、11.11％，生命延长率分别为83.56％、65.33％、43.58％，表明贝母辛各剂量组感染程度均明显减少CoxA16病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示贝母辛对手足口病毒感染具有治疗作用。

实施例4胶囊剂

将350g贝母辛和32g淀粉、6g低取代羟丙基纤维素、4.5g微粉硅胶、1.5g硬脂酸镁、及适量10％淀粉浆混合，装入胶囊，得到贝母辛的胶囊制剂1000粒。每日3次，每次1粒。

实施例5颗粒剂

将350g贝母辛和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常规方法制成1000包贝母辛颗粒剂。每日3次，每次1粒。

实施例6片剂

将350g贝母辛和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉钠、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸镁及适量10％淀粉浆适混合，按照常规方法制成贝母辛片剂1000片。每日3次，每次1片。

实施例7丸剂

将350g贝母辛和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、适量液状石蜡混合，按照常规方法制成贝母辛丸剂1000粒。每日3次，每次1粒。

实施例8注射剂

将200g贝母辛和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常规方法制成贝母辛注射剂1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL 5％葡萄糖注射液稀释后静脉滴注。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.贝母辛在制备防治肠道病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述肠道病毒为肠道病毒71型或柯萨奇病毒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。

3.贝母辛在制备防治手足口病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述手足口病为由肠道病毒引起的手足口病。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肠道病毒为肠道病毒71型或柯萨奇病毒。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述贝母辛防治手足口病的剂量为50mg/kg/d～200mg/kg/d。

7.根据权利要求1或3任一项所述的应用，其特征在于，其中所述贝母辛在药物中的质量分数为17.5％～88％。

8.根据权利要求1或3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物剂型为口服制剂、注射剂、气雾剂、贴剂或栓剂。