CN102327571B - 川贝母总生物碱及所含化合物在制备抗癌药物中的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了川贝母总生物碱在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的用途。本发明还提供了川贝母中的化合物的新用途。本发明川贝母总生物碱可抑制真核生物肿瘤细胞增殖，具有治疗肿瘤的作用，可用于治疗多种肿瘤，且在同等剂量下，药效明显优于其中所含有化合物贝母甲素和贝母乙素；质量稳定，使用安全，易于控制，且制备方法简单，便于大生产和临床使用；川贝母总生物碱中含有的单体化合物川贝酮、西贝碱、西贝素氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛，也可抑制真核生物肿瘤细胞增殖，具有治疗肿瘤的作用，在同等剂量下，药效明显优于化合物贝母甲素和贝母乙素，为临床治疗肿瘤提供了一种新的选择。

Description

川贝母总生物碱及所含化合物在制备抗癌药物中的新用途

技术领域

本发明涉及川贝母所含生物碱类成分的抗癌新用途；还涉及一种川贝母总生物碱及含有该提取物的药物组合物，属药物领域。

背景技术

据世界卫生组织(WHO)统计，每年世界有1000万人患上癌症，而死于癌症人数占全球死亡人数的12％。我国每年新增癌症患者180万，死亡140万，而且我国癌症发病率呈急剧上升趋势。在过去不到20年的时间里，我国癌症发病率上升69％，死亡率增长了29.4％。因此，癌症正在严重威胁到世界人民和中国人民的健康。中医药治疗肿瘤，是中国在肿瘤治疗领域的一大特色，且越来越受到重视。但目前很少见到直接用于肿瘤治疗的中成药，这种状况并不表明中医药中没有治疗肿瘤的药物，而是对这类药物的研发重视不够，还有巨大的潜力有待挖掘。

肿瘤细胞一个主要特征就是无限增殖，通过抑制真核生物肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，就可以有效控制肿瘤的增长，达到治疗肿瘤的目的。目前，抑制癌细胞生长和增殖是肿瘤治疗的重要策略。另外，诱导肿瘤细胞发生一种非凋亡的程序性死亡，即Necroptosis，为一种新的治疗肿瘤的途径。但在治疗肿瘤中，是各种途径综合作用结果。

有研究表明，从蒲圻贝母中提取的蒲贝酮碱显示了强的抗小鼠艾氏腹水癌、宫颈癌及肝癌的抑制活性。有研究者通过2种肿瘤病理模型考察了鄂贝总碱、贝母乙素、贝母甲素、鄂贝定碱对小鼠的抗肿瘤活性，指出鄂贝总碱具显著抗肿瘤活性，生物碱单体亦都具有抗肿瘤活性。作者指出鄂贝定碱很有希望成为新型、高效、低毒的抗肿瘤药。此外，有专利文献报道贝母生物碱及活性，如：申请号：200510025583.4，发明名称：贝母生物碱提取物在制备肿瘤药物中的应用；该发明提供了贝母生物碱提取物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。该发明通过试验表明可明显抑制基底细胞癌。治疗的肿瘤包括了基底细胞癌，以及其他髓质细胞瘤、横纹肌瘤、纤维肉瘤、消化道肿瘤和小细胞肺癌等通过hedgehog/圆滑信号传导途径来繁殖细胞和防止细胞凋亡的肿瘤。由于贝母品种较多，我国药典中收载了5种源于贝母属药材：川贝母、浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母，这几种药材贝母的功能主治各不相同，成分结构及其药理活性有明显差异，该发明没有指明采用的是哪种贝母。申请号：200810118446.9，发明名称：贝母素类化合物的新用途，该发明公开了贝母素类化合物的新用途。式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐的新用途包括：在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的应用和在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物上可接受的盐可与G-四链体DNA结合，增加G-四链体的稳定性，从而竞争性抑制端粒酶与端粒的结合，抑制端粒酶的活性，减弱细胞的增殖能力，抑制端粒延伸，促进细胞凋亡。将式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物上可接受的盐用于制备预防和/或治疗癌症的药物。由于贝母甲素和贝母乙素在贝母中的含量低，提取分离纯化成本高，不能满足大生产和临床的需求。

目前，还未见对川贝母总生物碱、川贝酮、西贝碱、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛在抗癌活性方面的报道。

发明内容

本发明技术方案的主要目的在于提供从川贝母中分离得到的生物碱类化合物的新用途。本发明的另一目的是提供了川贝母中化合物的新用途。

本发明提供了川贝母总生物碱在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

其中，所述的药物是抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物。

其中，所述的药物是治疗非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、食道癌、皮肤癌、宫颈癌、口腔癌、胃癌或肝癌的药物。

其中，所述的川贝母总生物碱中生物碱含量以西贝碱计为5-100％W/W。

进一步优选地，所述川贝母总生物碱中含有西贝碱0.01％～40.0％W/W、川贝酮0.01-25.0％W/W、西贝碱氮氧化物0.01-10.0％W/W、异浙贝甲素0.01-10.0％W/W、异浙贝甲素氮氧化物0.01-10.0％W/W、贝母辛0.01-30.0％W/W、贝母甲素0.01-25.0％W/W、贝母乙素0.01-25.0％W/W。

其中，所述提取物是由如下方法制备的：

取川贝母，粉碎或不粉碎，碱水溶液浸润或不浸润，用氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、酸水等溶剂或混合溶剂提取，干燥，进行或不进行分离纯化，45℃真空干燥，即得川贝母总生物碱。

所述川贝母来源主要包括《中华人民共和国药典》2010年版一部中川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)、暗紫贝母(FritillariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsia)、甘肃贝母(Fritillariaprzewalskii)、梭砂贝母(FritillariadelavayiFranch)、太白贝母(FritillariataipaiensisP.Y.Li)、瓦布贝母(FritillariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsiavar.wabuensis(S.Y.TangetS.C.Yue)Z.D.Liu，S.WangetS.C.Chen)等变种和栽培品，以及分布于四川西部、云南西北部、西藏南部至东部、甘肃、青海等高山、高原，来源于百合科贝母属FritillariaL.植物的鳞茎或地上部分。

本发明还提供了式I所示的川贝母生物碱类化合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途

式I；

其中，R1为：＝O或R2、R3为：H；R4为：H或OH；R5为：O或无。

其中，所述的药物是抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物。

其中，所述的药物是治疗非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、食道癌、皮肤癌、宫颈癌、口腔癌、胃癌或肝癌的药物。

其中，所述化合物为川贝酮、西贝碱、西贝素氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛：

式II(川贝酮)式III(西贝碱)

式IV(西贝素氮氧化物)式V(异浙贝甲素)

式VI(异浙贝甲素氮氧化物)式IX(贝母辛)。

进一步优选地，本发明还提供了川贝酮在制备治疗非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、皮肤癌、直肠癌的药物中的用途；西贝碱在制备治疗肝癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、口腔癌、皮肤癌的药物中的用途。西贝碱氮氧化物在制备治疗肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、直肠癌的药物中的用途。异浙贝甲素在制备治疗非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、肺癌、口腔癌、食道癌的药物中的用途。异浙贝甲素氮氧化物在制备治疗非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、肺癌、口腔癌、皮肤癌、直肠癌的药物中的用途。贝母辛在制备治疗非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、皮肤癌、口腔癌的药物中的用途。

本发明川贝母总生物碱可抑制真核生物肿瘤细胞增殖，具有治疗肿瘤的作用，可用于治疗多种肿瘤，且在同等剂量下，药效明显优于其中所含有化合物贝母甲素和贝母乙素；质量稳定，使用安全，易于控制，且制备方法简单，便于大生产和临床使用；川贝母总生物碱中含有的单体化合物川贝酮、西贝碱、西贝素氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛，也可抑制真核生物肿瘤细胞增殖，具有治疗肿瘤的作用，在同等剂量下，药效明显优于化合物贝母甲素和贝母乙素，为临床治疗肿瘤提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.川贝母总生物碱影响A549细胞株形态变化

图2.川贝母总生物碱影响A2780细胞株形态变化

图3.川贝母总生物碱影响HepG2细胞株形态变化

图4.川贝母总生物碱影响LLC细胞株形态变化

图5.贝母甲素影响HepG2细胞株形态变化

图6.贝母乙素对A549细胞株形态变化的影响

图7.贝母乙素对A2780细胞株形态变化的影响

图8.贝母乙素对HepG2细胞株形态变化的影响

图9.贝母乙素对LLC细胞株形态变化的影响

图10.川贝酮对A2780细胞株形态变化的影响

图11.川贝酮对HepG2细胞株形态变化的影响

图12.西贝碱对A2780细胞株形态变化的影响

图13.西贝碱对HepG2细胞株形态变化的影响

图14.西贝碱对LLC细胞株形态变化的影响

具体实施方式

实施例1本发明川贝母总生物碱的提取

取川贝母粗粉，用六倍量甲醇(乙醇等有机溶剂)连续回流提取三次，每次2h，减压浓缩，45℃真空干燥10h，得粗提物。粗提物用适量3％HCl捏溶(所谓捏溶就是用手捏分散至溶解，手挤压的作用使样品变成细腻微小颗粒加速溶解)，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次，用氨水调PH值至10，用氯仿适量萃取四次，置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得到川贝母总生物碱提取物(川贝母总生物碱I)。

实施例2本发明川贝母总生物碱的提取

取川贝母适量，粉碎，过60目筛，用10％氨水浸润24h，置回流提取装置中用氯仿-甲醇(4∶1)回流提取3次，每次3h。减压浓缩，回收提取液，得到棕色浸膏。浸膏用适量3％HCl捏溶，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次，用氨水调PH值至10，用氯仿适量萃取四次，置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得川贝母总生物碱(川贝母总生物碱II)。本发明浸润时采用的氨水用量，是以液面能够没过待提取的药材为准。

实施例3本发明川贝母总生物碱的提取

取川贝母适量，用氨水适量浸润2h，置回流提取装置中用氯仿-甲醇(2∶1)回流提取3次，每次3h。减压浓缩，回收提取液，得到棕色浸膏。浸膏用适量3％HCl捏溶，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次，用氨水调PH值至10，用氯仿适量萃取四次，置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得川贝母总生物碱(川贝母总生物碱III)。

实施例4本发明川贝母总生物碱的提取

取川贝母适量，用氨水适量浸润2h，置回流提取装置中用氯仿-乙醇(2∶1)回流提取3次，每次3h。减压浓缩，回收提取液，得到棕色浸膏。浸膏用适量3％HCl捏溶，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次，用氨水调PH值至10，用氯仿适量萃取四次，置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得川贝母总生物碱(川贝母总生物碱IV)。

实施例5本发明川贝母总生物碱的提取

取川贝母适量，用酸水(含0.5％HCl水溶液)渗漉提取，至无生物碱反应，减压浓缩，45℃真空干燥72h，得粗提物。粗提物用适量3％HCl捏溶，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次，用氨水调PH值至10，用氯仿适量萃取四次，得到川贝母总生物碱(川贝母总生物碱V)。

实施例6川贝母总生物碱提取物中总生物碱含量的测定

1.对照品溶液的制备

精密称取西贝碱对照品，加三氯甲烷置水浴上微热使溶解，制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。

2.标准曲线制备

精密量取对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6与1.0ml分别置25ml具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10ml，精密加蒸馏水5ml，加0.05％溴甲酚绿缓冲液(取溴甲酚绿约0.05g，加入6ml0.2mol·L^-1氢氧化钠溶液使溶解，定量转移至100ml量瓶中，再加入1.0g磷酸二氢钾和适量水使溶解，用水稀释到刻度，摇匀，滤过，即得)2.0ml，密塞，剧烈振摇3分钟后，移入至分液漏斗中，静置30分钟。分取三氯甲烷层，以干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应试剂为空白，照紫外分光光度法(一部附录VA)，在415nm的波长处测定吸光度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3.供试品溶液的制备

取按实施例1～5制备的提取物适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液3ml，浸润1h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液20ml，80℃水浴回流提取2h，放冷，滤过，用适量混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液与滤液合并于100ml量瓶中，加混合溶液至刻度，摇匀。精密量取2ml，置25ml具塞试管中，水浴蒸干，精密加入三氯甲烷10ml使溶解，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加蒸馏水5ml”起，依法测定吸光度，计算出总生物碱的含量。

经含量测定，按实施例1～5提取方法所得到的川贝母总生物碱提取物中总生物碱含量以西贝碱计算，结果见表1。

表1.不同提取方法中总生物碱提取物中总生物碱含量

上述测定结果，川贝母总生物碱提取物中含总生物碱52.33％-68.84％，但是，由于川贝母的品种的巨大差异，如生药中总生物碱的含量范围为：0.05％-0.5％，所以限定川贝母总生物碱中生物碱含量以西贝碱计为5-100％W/W。

实施例7本发明川贝母总生物碱中川贝酮、西贝碱、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母甲素、贝母乙素、贝母辛来源：

单体生物碱的提取分离：将10kg川贝母打粉，用氨水浸泡24小时，再用氯仿-甲醇(4∶1)回流提取。蒸干，得粗提物。粗提物用3％HCl分次溶解，用氯仿萃取。将PH调至10.0，再用氯仿萃取水液。蒸干氯仿层，提取物反复经过硅胶柱分离，分段收集，既得。(Y.Jiang，H.Li，P.Li，Z.Cai，W.Ye，SteroidalalkaloidsfromthebulbsofFritillariapuqiensis，J.Nat.Prod.68(2005)264-267；王晓静，川贝母生物碱成分与品质研究[D].四川大学，2004)。其西贝碱、贝母素氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母甲素、贝母乙素、川贝酮、贝母辛光谱数据如下：

西贝碱(Imperialine)，m.p.，266-268℃，¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ：0.72(3H，s，19-CH₃)，1.04(3H，s，21-CH₃)，1.07(3H，d，J＝5.4Hz，27-CH₃)，3.55(1H，m，W1/2＝24Hz，3-αH).¹³C-NMR(50MHz，CDCl₃)，δ：37.4(C-1)，30.4(C-2)，70.8(C-3)，30.4(C-4)，56.4(C-5)，210.8(C-6，C＝O)，46.8(C-7)，42.0(C-8)，54.7(C-9)，38.1(C-10)，29.8(C-11)，46.5(C-12)，34.1(C-13)，40.1(C-14)，26.7(C-15)，18.7(C-16)，39.0(C-17)，59.7(C-18)，12.6(C-19)，72.0(C-20)，22.3(C-21)，63.4(C-22)，19.5(C-23)，29.4(C-24)，27.7(C-25)，61.3(C-26)，17.2(C-27).¹H-NMR，¹³C-NMR和下面文献报道的数据一致(Chenetal.，2004；etal.，1976；Kanekoetal.，1986；Zhangetal.，1998)。

贝母素氮氧化物(imperialine-β-N-oxide)，m.p.，231-234℃，¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)，δ：0.81(3H，s，19-CH₃)，1.12(3H，s，21-CH₃)，3.53(3-αH)，1.46(d，27-CH₃).¹³C-NMR(50MHz，CDCl₃)，δ：37.5(C-1)，30.5(C-2)，70.3(C-3)，29.5(C-4)，56.7(C-5)，210.4(C-6，C＝O)，46.7(C-7)，38.1(C-8)，56.7(C-9)，38.0(C-10)，30.1(C-11)，46.6(C-12)，28.5(C-13)，39.5(C-14)，26.8(C-15)，19.7(C-16)，42.0(C-17)，70.4(C-18)，12.6(C-19)，72.7(C-20)，24.5(C-21)，67.5(C-22)，15.5(C-23)，28.8(C-24)，27.6(C-25)，72.1(C-26)，19.5(C-27).¹H-NMR，¹³C-NMR和下面文献报道的数据一致(Chenetal.，2004；Zhangetal.，1995；Zhangetal.，1998)。

异浙贝甲素(Isoverticine)，m.p.，134-136℃，¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)，δ：1.03(6H，s，19-CH₃，21-CH₃)，1.09(3H，d，27-CH₃)，3.63(1H，m，3α-H)，3.85(1H，m，6α-H).¹³C-NMR(200MHz，CDCl₃)，δ：38.7(C-1)，31.2(C-2)，71.8(C-3)，34.8(C-4)，48.2(C-5)，72.7(C-6，C＝O)，39.3(C-7)，35.7(C-8)，57.5(C-9)，35.4(C-10)，29.5(C-11)，40.9(C-12)，39.0(C-13)，43.7(C-14)，24.8(C-15)，20.7(C-16)，48.9(C-17)，61.7(C-18)，14.9(C-19)，71.0(C-20)，20.8(C-21)，70.5(C-22)，19.0(C-23)，29.5(C-24)，27.7(C-25)，62.5(C-26)，17.3(C-27).¹H-NMR，¹³C-NMR和下面文献报道的数据一致(etal.，1968；Kanekoetal.，1979；Zhangetal.，1993；Zhangetal.，1998)。

异浙贝甲素氮氧化物(isoverticine-β-N-oxide)，m.p.，207-210℃，¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)，δ：3.85(6α-H)，3，59(3α-H).¹³C-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ：39.5(C-1)，32.3(C-2)，72.5(C-3)，35.7(C-4)，49.5(C-5)，73.4(C-6，C＝O)，40.3(C-7)，35.7(C-8)，58.8(C-9)，35.5(C-10)，31.9(C-11)，40.8(C-12)，36.8(C-13)，45.1(C-14)，25.8(C-15)，21.4(C-16)，49.7(C-17)，73.5(C-18)，15.2(C-19)，72.9(C-20)，18.6(C-21)，73.4(C-22)，21.1(C-23)，30.5(C-24)，26.7(C-25)，75.5(C-26)，16.8(C-27).¹H-NMR，¹³C-NMR和下面文献报道的数据一致(Chenetal.，2004)。

贝母甲素(Verticine)，¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)，δ：0.80(3H，s，19-CH₃)，1.01(3H，s，21-CH₃)，1.06(3H，d，J＝7Hz，27-CH₃)，3.44(1H，m，W_1/2＝24Hz，6-H).¹³C-NMR(50MHz，CDCl₃)，δ：37.7(C-1)，30.7(C-2)，71.3(C-3)，32.3(C-4)，52.0(C-5)，70.6(C-6)，40.3(C-7)，38.7(C-8)，56.7(C-9)，35.0(C-10)，29.1(C-11)，40.8(C-12)，38.6(C-13)，43.4(C-14)，26.8(C-15)，20.8(C-16)，48.7(C-17)，61.9(C-18)，12.8(C-19)，70.9(C-20)，22.6(C-21)，70.4(C-22)，18.9(C-23)，29.5(C-24)，27.4(C-25)，61.5(C-26)，17.8(C-27).¹H-NMR，¹³C-NMR和下面文献报道的数据一致(Chenetal.，2004；etal.，1976；Kanekoetal.，1986；Zhangetal.，1998)。

贝母乙素(Verticinone)，¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)，δ：0.72(3H，s，19-CH₃)，1.05(3H，s，21-CH₃)，1.07(3H，d，J＝7Hz，27-CH₃)，3.56(1H，m，W_1/2＝24Hz).¹³C-NMR(50MHz，CDCl₃)，δ：37.5(C-1)，32.2(C-2)，71.9(C-3)，30.5(C-4)，56.5(C-5)，210.6(C-6，C＝O)，46.5(C-7)，42.7(C-8)，56.7(C-9)，38.2(C-10)，29.9(C-11)，40.2(C-12)，39.1(C-13)，46.9(C-14)，26.8(C-15)，19.8(C-16)，49.7(C-17)，61.4(C-18)，12.6(C-19)，70.9(C-20)，22.4(C-21)，70.3(C-22)，18.8(C-23)，30.5(C-24)，27.8(C-25)，63.5(C-26)，17.2(C-27).¹H-NMR，¹³C-NMR和下面文献报道的数据一致(Chenetal.，2004；etal.，1976；Kanekoetal.，1986；Zhangetal.，1998)。

川贝酮(Chuanbeinone)，¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)，δ：0.68(3H，s，19-CH₃)，0.82(3H，d，J＝6Hz，27-H)，0.96(3H，d，J＝7Hz，21-H)，3.56(1H，m，W_1/2＝23Hz，3α-H).¹³C-NMR(50MHz，CDCl₃)，δ：37.5(C-1)，30.9(C-2)，70.7(C-3)，30.4(C-4)，56.2(C-5)，211.4(C-6，C＝O)，46.7(C-7)，38.1(C-8)，54.6(C-9)，38.0(C-10)，31.9(C-11)，36.4(C-12)，37.5(C-13)，43.1(C-14)，24.2(C-15)，24.7(C-16)，47.9(C-17)，65.5(C-18)，12.3(C-19)，37.2(C-20)，12.4(C-21)，66.7(C-22)，30.2(C-23)，33.5(C-24)，30.9(C-25)，59.7(C-26)，19.7(C-27).¹H-NMR，¹³C-NMR和下面文献报道的数据一致(Chenetal.，2004；etal.，1976；Kanekoetal.，1986；Zhangetal.，1998)。

贝母辛(Peimisine)，¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)，δ：0.66(3H，s，19-CH₃)，0.92(3H，d，J＝7Hz，27-CH₃)，0.95(3H，d，J＝7Hz，21-CH₃)，1.61(3H，s，18-CH₃)，3.09(1H，dd，C25-H)，3.58(1H，m，W_1/2＝28Hz，3α-H)，3.23(1H，td，C23-αH).¹³C-NMR(50MHz，CDCl₃)，δ：38.8(C-1)，31.2(C-2)，70.5(C-3)，36.9(C-4)，56.6(C-5)，210.8(C-6，C＝O)，45.7(C-7)，45.9(C-8)，54.2(C-9)，38.4(C-10)，28.4(C-11)，128.4(C-12)，141.5(C-13)，48.4(C-14)，24.0(C-15)，31.4(C-16)，85.1(C-17)，12.5(C-18)，12.4(C-19)，39.3(C-20)，10.6(C-21)，65.9(C-22)，75.2(C-23)，29.8(C-24)，30.2(C-25)，54.3(C-26)，18.7(C-27).¹H-NMR，¹³C-NMR和下面文献报道的数据一致(Chenetal.，2004；etal.，1976；Kanekoetal.，1986；Zhangetal.，1998)。

本发明川贝母生物碱中有效单体化合物的含量测定

1.混合对照品储备液的制备

分别精密称取自制生物碱类对照品西贝碱、川贝酮、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母甲素、贝母乙素、贝母辛分别为6.0mg，3.0mg，1.5mg，1.5mg，1mg，3mg，3mg，5mg置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，振摇使混合均匀，配制成混合对照品储备液。

2.供试品溶液的制备

收集来源不同的8个川贝母药材样品(样品1：2007年采于松潘县水晶乡；样品2：2009年采于松潘县川主寺镇；样品3：2008年采于茂县松坪沟乡；样品4：2009年采于茂县松坪沟乡；样品5：2008采于重庆市；样品5-8：购于成都国际商贸城中药材市场)，按实施例1中总生物碱的提取方法提取液所得的提取物适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液3ml，浸润1h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液20ml，80℃水浴回流提取2h，放冷，滤过，用适量混合溶液洗涤药渣2～3次，将滤液减压回收至干，加甲醇溶液溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。进液相前用0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

3.色谱条件

kromasil-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙睛(A)与0.2％三乙胺溶液(B)；流速1.0ml/min；检测器为SEDEX75蒸发光散射检测器，载气压力为3.6Bar，漂移管温度为40℃；进样量为20μl；柱温为35℃。线性梯度洗脱程序：0-60min，10％A-100％A。

表2.不同川贝母提取物中有效成分的含量W/W

考虑到不同产地、不同批次的原料药的质量差异，川贝母总生物碱中含有西贝碱0.01％～40.0％W/W、川贝酮0.01-25.0％W/W、西贝碱氮氧化物0.01-10.0％W/W、异浙贝甲素0.01-10.0％W/W、异浙贝甲素氮氧化物0.01-10.0％W/W、贝母辛0.01-30.0％W/W、贝母甲素0.01-25.0％W/W、贝母乙素0.01-25.0％W/W。

以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1本发明化合物的药效实验

1.试验材料与方法

1.1试验材料

实施例1-6制备得到的川贝母总生物碱。川贝母生物碱类化合物按实施例7的方法制备得到。

1.2癌细胞株传代与培养

人肝癌细胞株HepG2、人非小细胞肺癌细胞株A549、鼠lewis肺癌细胞株LLC、人卵巢癌细胞株A2780、人胃癌细胞株NCI-N87、人乳腺癌细胞株HCC-1937、人宫颈癌细胞株Hela、人白血病细胞株CEM、人胰腺癌细胞株BxPc3、人直肠癌细胞株HCT-116、人食道癌细胞株Eca-109C、人皮肤癌细胞株A431、人口腔癌细胞株KB由四川大学华西药学院靶向药物及释药系统教育部重点实验室提供。

A549、HepG2、NCI-N87、HCC-1937、CEM细胞置于含10％的FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中培养，LLC、A2780、Hela、BxPc3、KB、Eca-109C、A431、HCT-116细胞置于10％的FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，弃去培养液，用适量的PBS洗去残留培养基，加入0.25％的胰蛋白酶适量消化1-3分钟，加入含有胎牛血清的培养基终止胰蛋白酶消化，离心去除上清液，更换培养液，分瓶培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3川贝母生物碱类化合物及总生物碱体外抗肿瘤活性实验

1.3.1实验分组及药物处理：每个癌细胞株分为11个组，组1为阳性对照组(盐酸米托蒽醌，终浓度为5ug/ml)，组2为阴性对照组(培养板上接种癌细胞，不加入受试药物，其他操作和实验组一致)，组3为空白组(培养板孔中不接种癌细胞，仅加入培养基，其他操作和实验组一致)，组4～11为实验组(组4为川贝母总生物碱I～V、组5为贝母甲素、组6为贝母乙素、组7为川贝酮、组8为西贝碱、组9为西贝素氮氧化物、组10为异浙贝甲素、组11为异浙贝甲素氮氧化物、组12为贝母辛)。根据预实验结果，实验组分别设6个剂量，各种药物的溶剂均为每种细胞相对应的培养基。给药剂量见表3。

表3.MTT比色法实验各种药物给药剂量表

1.3.2接种癌细胞于96孔板：选用对数生长期的癌细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化数分钟后，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，离心去除培养基，每种细胞株加入对应的培养基配制成1×10⁵个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，96孔培养板四周的孔加PBS，不接细胞，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱培养24h，使其贴壁。

1.3.3给药于96孔板：24h后，吸去96孔板原培养基，加入相应的药物，使终浓度如1.3.1项下所述，每孔加培养基至200ul，每个剂量设6个平行孔。置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养72h。

1.3.4MTT比色法实验：培养72h，弃去上清液，每空加入100ul新鲜配制的含0.5mg/mlMTT的无血清培养基，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养4h。小心弃去上清液，并加入150ulDMSO溶解MTTformazon沉淀，用微型振荡器混匀，在酶标仪上测定波长490nm处的吸光度(A值)。按照下述公式计算癌细胞生长抑制率，肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-样品组A值/阴性对照组A值)×100％，其中各项A值均已扣除空白组实验值。

1.4倒置显微镜观察给药后细胞形态变化

选用对数生长期的癌细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化数分钟后，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，离心去除培养基，每种细胞株加入对应的培养基配制成1×10⁵个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，96孔培养板四周的孔加PBS，不接细胞，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱培养24h，使其贴壁。24小时后分别对每个细胞加入不同川贝母生物碱单体和川贝母总生物碱，使终浓度为IC₅₀，分别于24h，48h，72h，使用倒置显微镜观察细胞形态变化并拍照片。

1.5川贝母总生物碱及生物碱单体抗癌活性机制研究

1.5.1接种癌细胞于6孔板：选用对数生长期的癌细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化数分钟后，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，离心去除培养基，每种细胞株加入对应的培养基配制成2×10⁵个/ml的细胞悬液，接种在6孔培养板中，每孔接种2.0ml，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱培养24h，使其贴壁。

1.5.2给药于6孔板：24h后，吸去6孔板原培养基，根据MTT实验，我们选取活性较好的药物进行抗癌活性机制初步研究，川贝母总生物碱对LLC癌细胞株抑制；贝母甲素对A431癌细胞株抑制；贝母乙素对Eca-109C癌细胞株抑制；川贝酮对A549癌细胞株抑制；西贝碱对A2780癌细胞株抑制；西贝碱氮氧化物对HCC-1937癌细胞株抑制；异浙贝甲素对HepG2癌细胞株抑制；异浙贝甲素氮氧化物对NCI-N87癌细胞株抑制；贝母辛对Hela癌细胞株抑制。加入药物的浓度为IC₅₀的浓度，每孔加培养基至2ml，设加入等量培养基者为实验阴性对照组，每个剂量设2个平行孔。置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养72h。

1.5.3流式细胞仪(FCM)分析癌细胞周期和凋亡：收集上述处理后的包括贴壁和悬浮的细胞，用4℃预冷PBS洗涤细胞一次，用低温离心机于4℃以转速1000rpm离心10min，缓慢加入1ml-20℃预冷70％乙醇于4℃固定过夜，再用4℃预冷的PBS漂洗细胞两次，用上述离心条件离心，加100ug/ml的PI染色剂150ul和0.4％triton150ul，4℃避光染色30min，于30min内用FCM进行细胞周期DNA含量分析，确定细胞周期分布。

1.5数据处理

MTT实验采用应用SPSS17.0统计软件进行统计分析，细胞周期和凋亡采用CellQuest及Motifit分析软件分析。

2.结果

2.1药物对癌细胞株生长抑制作用

MTT比色法检测的各种川贝母总生物碱对各种癌细胞株的抑制率见表4，川贝母生物碱单体对各种癌细胞株的抑制率见表5。根据表4、表5，应用SPSS17.0统计软件进行统计分析得出相应的IC₅₀值，各种川贝母总生物碱提取物中总生物碱对各种癌细胞株的IC₅₀值见表6，各种川贝母生物碱单体对各种癌细胞株的IC₅₀值见表7。终浓度为5ug/ml的盐酸米托蒽醌阳性对照组的抑制率见表8。其中化合物IC₅₀值大于200ug/ml表明其无抑制作用。

表4.川贝母总生物碱MTT比色法抑制率实验结果

表5.川贝母生物碱类化学成分MTT比色法抑制率实验结果

表4和表5中各种川贝母总生物碱、川贝母生物碱单体对各种癌细胞株的抑制率结果表明，其抑制作用呈现剂量依赖性，随着剂量的增加，抑制作用越强。

由表4、6可知，川贝母总生物碱对人肝癌细胞株HepG2、人非小细胞肺癌细胞株A549、鼠lewis肺癌细胞株LLC、人卵巢癌细胞株A2780、人胃癌细胞株NCI-N87、人乳腺癌细胞株HCC-1937、人直肠癌细胞株HCT-116、人食道癌细胞株Eca-109C、人皮肤癌细胞株A431、人口腔癌细胞株KB、人宫颈癌细胞株Hela都有抑制作用，相对于阴性组而言，抑制作用明显。且随着药物浓度的增加，对增殖抑制效果越明显，其抑制作用呈剂量依赖关系。由表5可知，各种提取方法所获得的总生物碱提取物对各种癌细胞株的IC₅₀值无显著性差异，表明各种提取方法所得的总生物碱提取物的抗癌活性无显性差异。

由表5、7可知，各种川贝母生物碱单体对癌细胞株IC₅₀值小于200ug/ml表明有抑制作用，IC₅₀值大于200ug/ml，表明其无明显抑制作用。其中贝母甲素对HepG2、A431、Eca-109C癌细胞株有明显抑制作用；贝母乙素对A549、HepG2、NCI-N87、HCC-1937、LLC、A2780、Hela、KB、Eca-109C、A431、HCT-116癌细胞株有明显抑制作用；川贝酮对A549、HepG2、NCI-N87、HCC-1937、A2780、Eca-109C、A431、HCT-116癌细胞株有明显抑制作用；西贝碱对HepG2、NCI-N87、LLC、A2780、Hela、KB、A431癌细胞株有明显抑制作用；西贝碱氮氧化物对HepG2、HCC-1937、LLC、A2780、Hela、A431、HCT-116癌细胞株有明显抑制作用；异浙贝甲素对A549、HepG2、NCI-N87、LLC、KB、Eca-109C癌细胞株有明显抑制作用；异浙贝甲素氮氧化物对A549、HepG2、NCI-N87、LLC、KB、A431、HCT-116癌细胞株有明显抑制作用；贝母辛对A2780、A549、LLC、HCC-1937、Hela、KB、A431癌细胞株有明显抑制作用。且随着药物浓度的增加，对增殖抑制效果越明显，其抗癌活性呈现剂量依赖关系。

由表6、7可知，川贝母总生物碱和川贝母生物碱单体对人白血病细胞株CEM、人胰腺癌细胞株BxPc3的IC₅₀值均大于200ug/ml，表明对该两种细胞株均无抑制作用，表明无论是川贝母总生物碱还是生物碱单体抗癌活性都具有一定的选择性。并且，总生物碱的作用效果明显优于任何川贝母生物碱单体。且通过表5、6的实验结果可知，川贝母总生物碱对A549、HepG2、NCI-N87、HCC-1937、LLC、A2780、Hela、KB、Eca-109C、A431、HCT-116癌细胞株增殖抑制活性优于贝母甲素和贝母乙素。另外，对A2780、HCC-1937癌细胞株西贝碱氮氧化物的抑制活性优于贝母甲素、贝母乙素；对A549、HepG2、LLC、NCI-N87、A431癌细胞株异浙贝甲素氮氧化物的抑制活性优于贝母甲素、贝母乙素；对A549、HepG2、LLC、NCI-N87、A431癌细胞株异浙贝甲素氮氧化物的抑制活性优于贝母甲素、贝母乙素；对Hela癌细胞株西贝碱的抑制活性优于贝母甲素、贝母乙素；对Eca-109C、HCT-116癌细胞株川贝酮的抑制活性优于贝母甲素、贝母乙素；对KB癌细胞株异浙贝甲素的抑制活性优于贝母甲素、贝母乙素。由此可知，川贝母生物碱类化合物对各种肿瘤的治疗作用具有选择性，并非对所有的肿瘤都有效。

2.2对细胞形态学影响

各种癌细胞株阴性对照组细胞生长状况良好，在镜下观察可见，透明度大、折光性强、细胞轮廓不清、形态较规则、贴壁性好。相反，给药组各种癌细胞生长状态不良，细胞折光性变弱、轮廓增强、胞质中常出现空泡、脂质和颗粒样物、细胞之间空隙加大、细胞变得不规则、贴壁性不好，部分细胞成凋亡状态，细胞变圆，细胞贴壁性变差，细胞膜发生皱缩、凹陷，并可见细胞凋亡小体。如图1-图14。

2.3对细胞周期的影响

流式细胞仪分析可知，川贝母总生物碱和各种生物碱单体作用后，G₀/G₁细胞数增加，S和G₂/M期细胞数减少，细胞增殖指数降低，显示川贝母生物碱作用后细胞分裂增殖被抑制在G₀/G₁→S期。从细胞周期的时相分布来看，川贝母生物碱可使G₀/G₁期的细胞数增加，而使S期细胞数减少，即阻止细胞于G₀/G₁→S期。川贝母总生物碱和贝母甲素、贝母乙素、川贝酮、西贝碱、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛可能都是作用于G₀→S间的限制点。通过流式细胞仪(FCM)分析癌细胞周期和凋亡，初步探索了此类化合物抑制肿瘤细胞增殖的初步机制，此类非甾体生物碱类化合物通过阻止细胞于G₀/G₁→S期，发挥抗癌作用。

3.结论

由以上实验结果可知，川贝母总生物碱对人肝癌细胞株HepG2、人非小细胞肺癌细胞株A549、鼠lewis肺癌细胞株LLC、人卵巢癌细胞株A2780、人胃癌细胞株NCI-N87、人乳腺癌细胞株HCC-1937、人直肠癌细胞株HCT-116、人食道癌细胞株Eca-109C、人皮肤癌细胞株A431、人口腔癌细胞株KB、人宫颈癌细胞株Hela都有抑制作用，相对于阴性组而言，抑制作用明显，且其抑制作用呈剂量依赖关系。

贝母甲素对HepG2、A431、Eca-109C癌细胞株有明显抑制作用；贝母乙素对A549、HepG2、NCI-N87、HCC-1937、LLC、A2780、Hela、KB、Eca-109C、A431、HCT-116癌细胞株有明显抑制作用；川贝酮对A549、HepG2、NCI-N87、HCC-1937、A2780、Eca-109C、A431、HCT-116癌细胞株有明显抑制作用；西贝碱对HepG2、NCI-N87、LLC、A2780、Hela、KB、A431癌细胞株有明显抑制作用；西贝碱氮氧化物对HepG2、HCC-1937、LLC、A2780、Hela、A431、HCT-116癌细胞株有明显抑制作用；异浙贝甲素对A549、HepG2、NCI-N87、LLC、KB、Eca-109C癌细胞株有明显抑制作用；异浙贝甲素氮氧化物对A549、HepG2、NCI-N87、LLC、KB、A431、HCT-116癌细胞株有明显抑制作用；贝母辛对A2780、A549、LLC、HCC-1937、Hela、KB、A431癌细胞株有明显抑制作用。且随着药物浓度的增加，对增殖抑制效果越明显，其抗癌活性呈现剂量依赖关系。

另外，川贝母总生物碱和生物碱单体对人白血病细胞株CEM、人胰腺癌细胞株BxPc3均无抑制作用。表明无论是川贝母总生物碱还是生物碱单体抗癌活性都具有一定的选择性。且各种提取方法所获得的总生物碱的抗癌活性无显著性差异。

川贝母总生物碱对HepG2、A549、LLC、A2780、NCI-N87、人HCC-1937、HCT-116、Eca-109C、A431、KB、Hela都有抑制作用，而川贝母生物碱单体对有些癌细胞没有抑制作用(见表5、6)，且川贝母总生物碱的活性是优于川贝母生物碱单体。由此可见，各种生物碱单体抗癌活性具有互补性。另外，川贝母总生物碱对A549、HepG2、NCI-N87、HCC-1937、LLC、A2780、Hela、KB、Eca-109C、A431、HCT-116癌细胞株增殖抑制活性优于贝母甲素和贝母乙素。对A2780、HCC-1937癌细胞株西贝碱氮氧化物的活性优于贝母甲素、贝母乙素；对A549、HepG2、LLC、NCI-N87、A431癌细胞株异浙贝甲素氮氧化物的活性优于贝母甲素、贝母乙素；对A549、HepG2、LLC、NCI-N87、A431癌细胞株异浙贝甲素氮氧化物的活性优于贝母甲素、贝母乙素；对Hela癌细胞株西贝碱的活性优于贝母甲素、贝母乙素；对Eca-109C、HCT-116癌细胞株川贝酮的活性优于贝母甲素、贝母乙素；对KB癌细胞株异浙贝甲素的活性优于贝母甲素、贝母乙素。

通过流式细胞仪(FCM)分析癌细胞周期和凋亡，初步探索了此类化合物抑制肿瘤细胞增殖的初步机制，即此类非甾体生物碱类化合物通过阻止细胞于G₀/G₁→S期，发挥抗癌作用。以上试验证明，川贝母总生物碱、川贝酮、西贝碱、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛具有抑制肿瘤细胞增殖活性。

Claims (4)

1.川贝母总生物碱在制备治疗卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌或肝癌的药物中的用途；其中，

川贝母总生物碱按以下任一方法制备而成：

取川贝母粗粉，用六倍量甲醇连续回流提取三次，每次2h，减压浓缩，45℃真空干燥10h，得粗提物；粗提物用适量3％HCl捏溶，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次,用氨水调pH值至10，用氯仿适量萃取四次,置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得到川贝母总生物碱；

取川贝母适量，粉碎，过60目筛，用10％氨水浸润24h，置回流提取装置中用氯仿-甲醇4:1回流提取3次，每次3h；减压浓缩，回收提取液，得到棕色浸膏；浸膏用适量3％HCl捏溶，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次,用氨水调pH值至10，用氯仿适量萃取四次,置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得川贝母总生物碱；

取川贝母适量，用氨水浸润2h，置回流提取装置中用氯仿-甲醇2:1回流提取3次，每次3h；减压浓缩，回收提取液，得到棕色浸膏；浸膏用适量3％HCl捏溶，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次,用氨水调pH值至10，用氯仿适量萃取四次,置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得川贝母总生物碱；

取川贝母适量，用氨水适量浸润2h，置回流提取装置中用氯仿-乙醇2:1回流提取3次，每次3h；减压浓缩，回收提取液，得到棕色浸膏；浸膏用适量3％HCl捏溶，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次,用氨水调pH值至10，用氯仿适量萃取四次,置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得川贝母总生物碱；

取川贝母适量，用含0.5％HCl水溶液渗漉提取，至无生物碱反应，减压浓缩，45℃真空干燥72h，得粗提物；粗提物用适量3％HCl捏溶，得到酸液，酸液用石油醚适量萃取三次,用氨水调pH值至10，用氯仿适量萃取四次,得到川贝母总生物碱。

2.西贝碱在制备治疗胃癌的药物中的用途，其结构式如下：

3.异浙贝甲素在制备治疗胃癌、口腔癌的药物中的用途，其结构式如下：

4.贝母辛在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的用途，其结构式如下