CN105418726A - 一种通关藤总皂苷提取物及其提取方法 - Google Patents

一种通关藤总皂苷提取物及其提取方法 Download PDF

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Abstract

一种通关藤总皂苷，每mg通关藤总皂苷中含有0.3～0.4mg通关藤苷A，0.1～0.2mg牛奶菜苷K，0.02～0.03mg异通关藤苷A，0.02～0.03mg通关藤苷元B，以及0.1～0.2mg通关藤苷G，其中异通关藤A具有下述式（Ⅰ）结构，为通关藤苷A的同分异构体。

Description

一种通关藤总皂苷提取物及其提取方法
技术领域
本发明涉及一种通关藤总皂苷提取物，该提取物中含有一种通关藤苷新化合物。本发明还涉及含有所述通关藤苷新化合物的通关藤总皂苷提取物的制备方法。
背景技术
恶性肿瘤发病率越来越高，且具有较高的死亡率，严重威胁人类健康。采用放化疗治疗恶性肿瘤，在杀伤癌细胞的同时，也损害了机体正常细胞，愈后不理想。临床常用的广谱抗癌药物顺铂注射液对肿瘤细胞具有明显的杀伤能力，但也有较强的免疫抑制作用，造成治疗过程中机体免疫力低下，副作用较大。目前亟待寻求一种抑瘤效果明显但对机体损伤较小的抗癌药物。
通关藤，又名乌骨藤、通光散、通光藤、黄木香、下奶藤(云南)等，系萝藦科牛奶菜属植物通关藤(Marsdenia tenacissima(Roxb).Wight et Am)的干燥藤茎，广泛分布于亚洲热带和亚热带地区。通关藤的根、茎、叶均可入药，主要含C21甾体皂苷、生物碱、黄酮、多糖、树脂、色素及油脂等多种化学成分，其味苦，性微甘、凉，入肺、胃、膀胱经，具有清热解毒、消炎去痛、止咳平喘等功效。药理研究表明，通关藤含有的化学成分具有明显的抗肿瘤活性。研究证实，其抗肿瘤有效成分为甾体皂苷、生物碱和多糖，且主要活性成分是其中的甾体类成分。大量研究表明，C21甾体皂苷具有明显抑制大鼠瓦克瘤、小鼠肉瘤、宫颈癌、肝癌、艾氏腹水瘤作用和平喘等多种生物活性。有报道称通关藤多糖及一些脂溶性成分也具有抗肿瘤作用。
单用通关藤治疗肿瘤，对食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等都具有一定的疗效。中药消癌平注射液是以单味通关藤药材的水提取物为主要成分的制剂，具有清热解毒、化痰软坚之功效，临床用于各种消化系统肿瘤、肺癌、肝癌等的治疗，还可用于放疗，化疗的辅助治疗。消癌平注射液作用温和，具有显著改善和提高患者生活质量的功效。
目前已从通关藤植物中分离出50余种化学成分，其中主要的抗肿瘤活性成分C21甾体皂苷类化合物多为白色结晶或粉末，已有40种以上，是一类苷元甾体烷衍生物与2-去氧糖等形成的化合物，其糖链最多含有6个糖。传统观点认为，通关藤中的苷元主要有tenacigenin A、B、C(通光藤苷元A、B、C)、17β-tenacigenin B(17β-通关藤苷元B)、dihydrosarcostin(二氢肉珊瑚苷元)、tenacissigenin(通光素)、cissogenin(西索苷元)、drevogeninQ(苦绳苷元Q)、metaplexigenin(萝藦苷元)等。甾体皂苷苷元结构的差异可影响其对肿瘤的抑制程度。
杨仁洲等于1981年从通关藤中分离出了通光藤甙元甲、乙、丙，确定其分子式分别为C21H32O5、C21H32O5和C21H34O6，罗思齐等从通关藤中分离出一个分子式为C21H32O6的新化合物，化学名称5α,17α-孕甾-3,8α,11α,12,14-五醇-20-酮-11-缩酮，被命名为通光藤素。邢旺兴等用现代色谱分离技术分出两个新的化合物，并通过化学方法以及红外、紫外、质谱、核磁等技术确定了这两个化合物的结构，其中一个化合物鉴定命名为通光藤J，其结构特点为含有五个不同的糖，分别为磁麻糖、夹竹桃糖、3-O-甲基-6-脱氧阿洛糖和葡萄糖，与二氢肉珊瑚苷元以1→4糖苷键连接；另一个化合物通光藤K较通关藤J少一个葡萄糖。Liu等从通关藤药材中分离出了通关藤N，其分子式为C54H84O24，以通关藤B为苷元。雷勇胜通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、开放ODS柱色谱、制备HPLC等多种色谱手段，从通关藤A乙醇提取物中分离出了多种C21甾体苷：通光藤苷元乙，17β-通光藤苷元乙，11α-O-tigloyl-17β-tenacigenin B，11α-O-2-methylbutyryl-12β-O-acetyl tenacigenin B，11α-O-2-methylbutyryl-12β-O-benzoyl tenacigenin B， 11α-O-2-methylbutyryl-12β-O-tigloyl tenacigenin B，Tenacigenoside A，通光藤苷G，17β-通光藤苷G，通光藤苷H，通光藤苷I，通光藤苦苷A，通光藤苦苷F，通光藤苷B、通光藤苷O、17β-通光藤苷O。邢旺兴将通关藤A乙醇提取物制成浸膏，水混悬，用一系列溶剂萃取后反复用硅胶柱分离，纯化得到八个化合物，经结构鉴定，其中三个为大叶牛奶菜苷丁、大叶牛奶菜苷乙、喙柱牛奶菜苷乙。
目前通关藤药材的主要用法为简单水煮、水煮醇沉或用一定浓度乙醇提取，没有针对其中的药效成分进行富集，造成许多无效成分(包括人体无法吸收的成分)含量增多，服用剂量偏大。同时，由于药材之间成分差异性较大，简单工艺制成的粗提物不易控制已知有效成分的含量，从而造成粗提物质量控制的不便，影响疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑瘤效果明显，对机体损伤较小的通关藤总皂苷提取物，以及所述通关藤总皂苷提取物的制备方法。
本发明所述的通关藤总皂苷提取物是按照下述方法提取得到的：
1) 将通关藤药材以相当于药材8～12倍重量的70～75%乙醇浸泡过夜，加热至回流温度进行提取，提取液过滤并减压浓缩回收乙醇后，浓缩物干燥得到通关藤粗提取物；
2) 将通关藤粗提取物以相当于粗提取物10～20倍重量的蒸馏水溶解，离心，取上清液上ZTC-1大孔吸附树脂柱，依次用蒸馏水和50～55%乙醇淋洗树脂柱至淋洗液无色，用70～75%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，浓缩物干燥得到通关藤粗皂苷；
3) 取通关藤粗皂苷，以相当于粗皂苷8～15倍重量的40～50%乙醇溶解，上MCI Gel反相树脂柱，用40～50%乙醇淋洗树脂柱至淋洗液吸光度恒定，以75～80%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，浓缩物干燥得到通关藤总皂苷。
本发明上述方法中，所述各乙醇溶液的浓度均为体积百分浓度。
具体地，本发明是将所述浸泡过夜的通关藤药材加热回流提取3次，每次提取时间为2～3小时。
本发明用于提取通关藤粗皂苷的ZTC-1大孔吸附树脂的外观为乳白色球状颗粒，具有弱极性，粒径范围0.3～1.25mm，比表面积480～520m2/g，平均孔径130～140nm，孔隙率42～46%，孔容0.73～0.77ml/g。
大孔吸附树脂仅能按照洗脱剂浓度的不同对提取物进行粗分，不能按照分离成分的化学性质类别进行纯化。因此，本发明采用MCI Gel反相树脂对粗皂苷进行进一步纯化。本发明采用的MCI Gel反相树脂外观为白色球型，粒径50～75μm，比表面积310m2/g，孔径120A。
由于新购树脂可能含有分散剂、致孔剂、惰性溶剂等化学残留，所以本发明所述ZTC-1大孔吸附树脂和MCI Gel反相树脂在使用前都需要进行预处理，具体方法是先将树脂以2～4倍体积的丙酮浸泡过夜，使树脂充分溶胀后，置于层析柱中，先以丙酮淋洗至溶液无白色沉淀，再用乙醇淋洗至乙醇液加水无白色浑浊，最后以蒸馏水淋洗至无醇味。
进一步地，本发明是采用冷冻干燥的方式对各步骤的浓缩物进行干燥。
采用本发明上述方法制备得到的通关藤总皂苷，每mg通关藤总皂苷中含有的活性组分包括：0.3～0.4mg通关藤苷A，0.1～0.2mg牛奶菜苷K，0.02～0.03mg异通关藤苷A，0.02～0.03mg通关藤苷元B，以及0.1～0.2mg通关藤苷G。
更进一步地，每mg通关藤总皂苷中含有0.32～0.36mg通关藤苷A，0.12～0.18mg牛奶菜苷K，0.02～0.03mg异通关藤苷A，0.02～0.03mg通关藤苷元B，0.12～0.18mg通关藤苷G。
其中，所述的异通关藤A为首次报道的新化合物，该通关藤化合物为白色粉末，熔点218.2℃，以11α-O-顺芷酰基-12β-O-乙酰基-通关藤苷元B作为其苷元，连接有Glc-Allo-Ole-的糖链，分子式C48H74O19，分子量954，为化合物通关藤苷A的同分异构体，具有下述式（Ⅰ）所述的结构，其结构式中18位为反式构型。
本发明采用制备、半制备色谱系统对提取得到的通关藤总皂苷进行进一步的反复分离，得到了5种含量较高的纯度80%左右的活性组分，继而以Fuji C18制备色谱柱将这些活性组分提纯至纯度＞98%，采用1H-NMR，13C-NMR，HMQC，FT-MS等手段进行结构鉴定，确定了这5种活性组分的化学结构。
鉴定结果显示，化合物3为未报道化合物，其余化合物均为已知化合物，其中化合物1为通关藤苷A，化合物2为牛奶菜苷K，化合物4为通关藤苷元B，化合物5为通关藤苷G。
化合物1为白色粉末，易溶于甲醇、三氯甲烷，微溶于DMSO，熔点207.5℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Keller-Kiliani反应阳性，证明含有2-去氧糖甾体皂苷。FT-MS测定准分子离子峰976.4655[M+Na]+，分子量954，分子式C48H74O19，由此推测分子不饱和度12。核磁共振碳谱显示该化合物为皂苷类化合物，含有3个糖苷键。
图1的1H-NMR谱中，δ6.816（1H）有一烯氢质子，在高场区可以看到6个明显的-CH3质子单峰信号，分别为δ1.061，1.125，1.306，2.163，3.429，3.612。另外，还可以观察到较为明显的三个糖的端基质子信号：δ4.70（1H，d，J=9Hz），δ4.66（1H，dd，J=10，2Hz），δ4.36（1H，d，J=7Hz）。根据端基质子的偶合常数为7-10Hz，可知所含糖苷键均为β构型。另外还能观察到的明显质子信号有δ5.39（1H，t，J=11Hz），δ5.03（1H，d，J=10Hz），δ3.98（1H，t，J=3Hz），δ3.94（1H，dd，J=12Hz，2Hz），δ1.31（3H，d，J=6Hz）。图2的13C-NMR谱中显示48个碳信号，δ212.0，δ171.0，δ167.4提示存在3个羰基碳，δ138.0和128.4提示为烯双键。运用HMQC图谱对化合物1的所有碳氢进行归属，可以看出δ138.0与6.816相关（R2上的烯双键的C），δ104.9与4.36，δ100.8与4.70，δ97.6与4.66，三个C-H相关数据分别代表了三个糖环的端基碳。经文献比对，确定其结构为通关藤苷A，结构以11α-O-顺芷酰基-12β-O-乙酰基-通关藤苷元B为苷元主体结构，连接的糖链为Glc-Allo-Ole-。
化合物2为白色粉末，易溶于甲醇、三氯甲烷，微溶于DMSO，熔点215.4℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Keller-Kiliani反应阳性，FT-MS测定准分子离子峰为1016.5767[M+K]+，分子量976，分子式C50H72O19，由此推测分子不饱和度15。核磁共振碳谱显示该化合物为皂苷类化合物，含有3个糖苷键，且三个糖苷键的化学位移与化合物1完全一致，说明该化合物所含三个糖与化合物1完全一致，连接的糖链为Glc-Allo-Ole-。
图3和图4分别是化合物2的1H-NMR图谱和13C-NMR图谱。运用HMQC图谱对化合物2的所有碳氢进行归属可以看出，δ104.9与4.36（1H，d，J=7Hz），δ100.8与4.70（1H，d，J=9Hz），δ97.6与4.66（1H，dd，J=10，2Hz），三个C-H相关数据分别代表了三个糖环的端基碳。δ128.5，129.6，130.1，133.2提示化合物2存在Bz基团，结合骨架碳化学位移，经文献比对，确定化合物2为牛奶菜苷K（Marsdenoside K），结构以11α-O-苯甲酰基-12β-O-乙酰基-通关藤苷元B为苷元主体结构，连接的糖链为Glc-Allo-Ole-。
化合物3为白色粉末，易溶于甲醇、三氯甲烷，熔点218.2℃，Liebermann-Burchard反应及Keller-Kiliani反应呈阳性，表明含有2-去氧糖甾体皂苷。ESI-MS测定准分子离子峰为976.4613[M+Na]+，分子量954，分子式C48H74O19，由此推测分子的不饱和度为12。由质谱数据显示，该化合物与化合物1为同分异构体。核磁共振碳谱显示该化合物为皂苷类化合物，含有3个糖苷键，并且三个糖苷键的化学位移与化合物1完全一致，说明该化合物所含的三个糖与化合物1完全一致，分别为β-D-葡糖糖，β-D-夹竹桃糖和3-O-甲基-6去氧-β-D-阿洛糖。
图5的1H-NMR谱中，同化合物1，存在δ6.825（1H，m）的一烯氢质子，还可观察到较为明显的三个糖的端基质子信号：δ4.73（1H，t，J=9Hz），δ4.67（1H，dd，J=10，2Hz），δ4.37（1H，d，J=8Hz）。通过与化合物1的相关图谱比对，可知存在明显差异的为δ59.76/3.01（1H，d，J=7Hz），δ51.2/1.98（1H，m），δ26.32/2.04,1.43，δ20.23/1.89（2H，m）。由图6的13C-NMR图谱可知，C-9，C-12，C-13，C-17，C-18，C-19，Tig-C-2′，Ac-C-2′′存在化学位移差异，具体见表1。由此可以推测化合物3是化合物1（通关藤苷A）的同分异构体，其苷元为11α-O-顺芷酰基-12β-O-乙酰基-通关藤苷元B，结构中18位为反式构型，连接的糖链为Glc-Allo-Ole-，该化合物命名为异通关藤苷A。
其中下划线标示为与化合物1存在区别的碳的化学位移。
化合物4为白色针状晶体，易溶于甲醇、三氯甲烷，熔点182.5℃。ESI-MS测定准分子离子峰为489.2865[M+H]+，分子量488，分子式C28H41O7。图7和图8分别是化合物4的1H-NMR图谱和13C-NMR图谱。碳谱显示该化合物与化合物1的母环结构一致，为化合物1的苷元，经文献比对，化合物4即为下述结构式表示的11α-O-顺芷酰基-12β-O-乙酰基-通关藤苷元B。
化合物5为白色粉末，易溶于甲醇、三氯甲烷，熔点148.3℃。ESI-MS测定准分子离子峰为815.4150 [M+Na]+，分子量791，分子式C42H64O14。图9和图10的化合物5 1H-NMR和13C-NMR图谱显示该化合物与化合物1的母环结构一致，运用HMQC图谱对化合物5的所有碳氢进行归属可以看出，仅存在δ100.0与4.70（1H，d，J=9Hz）和δ97.6与4.66（1H，dd，J=10，2Hz）两个C-H相关数据，分别代表两个糖环的端基碳，即β-D-夹竹桃糖和3-O-甲基-6去氧-β-D-阿洛糖，不存在β-D-葡糖糖。经与文献比对，化合物5为通关藤苷G，结构以11α-O-顺芷酰基-12β-O-乙酰基-通关藤苷元B为苷元主体结构，连接的糖链为Allo-Ole-。
本发明制备的通关藤总皂苷提取物中含有多种抗肿瘤活性成分，在抗肿瘤作用的同时对机体自身免疫功能的恢复具有明显效果。试验证明，本发明通关藤总皂苷对体外培养的人肝癌Hepg2细胞的增殖具有抑制作用。通过建立S180，H22，EAC小鼠模型观察通关藤总皂苷在体内对三种肿瘤细胞的抑制作用，结果表明，虽然本发明通关藤总皂苷从抑瘤率角度看，对S180的抑制与阳性对照药物相当，对H22的抑制不及阳性对照药物，但从胸腺指数、脾脏指数和体重方面看，却均能明显增加荷瘤小鼠的脏器指数和体重，而阳性组则表现出明显的抑制作用；同时，本发明通关藤总皂苷能够有效延长EAC荷瘤小鼠的生存时间。因此，本发明通关藤总皂苷对肿瘤的抑制作用效果虽然不及化疗药物，但与化疗药物相比，存在的明显优势是能够在杀伤癌细胞的同时，增加荷瘤小鼠的自身免疫功能。
本发明通关藤总皂苷提取物的提取方法方便简单，得到的通关藤总皂苷提取物中，总皂苷含量以分光光度法测定可以达到90%以上。
附图说明
图1为通关藤苷A的1H-NMR谱图。
图2为通关藤苷A的13C -NMR谱图。
图3为牛奶菜苷K的1H-NMR谱图。
图4为牛奶菜苷K的13C -NMR谱图。
图5为异通关藤苷A的1H-NMR谱图。
图6为异通关藤苷A的13C -NMR谱图。
图7为通关藤苷元B的1H-NMR谱图。
图8为通关藤苷元B的13C -NMR谱图。
图9为通关藤苷G的1H-NMR谱图。
图10为通关藤苷G的13C -NMR谱图。
图11为通关藤总皂苷对人肝癌细胞Hepg2抑制作用的细胞形态观察（×120）。
图12为Hoechst-33258荧光染色观察人肝癌细胞Hepg2的细胞凋亡形态（×200）。
图13为不同浓度通关藤总皂苷对HepG2细胞凋亡的影响（AnnexinV/PI双染法）。
具体实施方式
实施例1
取通关藤药材10Kg，置于100Kg的70%乙醇溶液中，浸泡过夜，加热至回流温度进行提取，提取的次数为3次，每次2小时。提取液过滤，滤液减压浓缩回收乙醇后，冷冻干燥得到通关藤粗提取物约800g。
将ZTC-1大孔吸附树脂以2倍体积的丙酮浸泡过夜，置于层析柱中，以丙酮淋洗至无白色沉淀，再用乙醇淋洗，至乙醇液加水无白色浑浊后，以蒸馏水淋洗至无醇味。
MCI Gel反相树脂作相同处理。
将通关藤粗提取物用12Kg蒸馏水溶解，离心，取上清液缓慢加入ZTC-1大孔吸附树脂柱，流速控制在20ml/min，依次用蒸馏水和50%乙醇淋洗树脂柱至淋洗液无色后，用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥得到通关藤粗皂苷约150g。
以1.5Kg的40%乙醇溶解通关藤粗皂苷，缓慢加入粒径50～75μm的MCI Gel反相树脂柱，流速控制在20ml/min，用40%乙醇洗至淋洗液吸光度恒定，以80%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥得到通关藤总皂苷115g。
经检测，每mg通关藤总皂苷中含有通关藤苷A 0.3424mg，牛奶菜苷K 0.1543mg，异通关藤苷A0.0261mg，通关藤苷元B 0.0210mg，通关藤苷G 0.1570mg。
实施例2
取通关藤药材10Kg，置于120Kg的70%乙醇溶液中，浸泡过夜，加热至回流温度进行提取，提取的次数为3次，每次2小时。提取液过滤，滤液减压浓缩回收乙醇后，冷冻干燥得到通关藤粗提取物约850g。
将ZTC-1大孔吸附树脂以2倍体积的丙酮浸泡过夜，置于层析柱中，以丙酮淋洗至无白色沉淀，再用乙醇淋洗，至乙醇液加水无白色浑浊后，以蒸馏水淋洗至无醇味。
MCI Gel反相树脂作相同处理。
将通关藤粗提取物用17Kg蒸馏水溶解，离心，取上清液缓慢加入ZTC-1大孔吸附树脂柱，流速控制在20ml/min，依次用蒸馏水和55%乙醇淋洗树脂柱至淋洗液无色后，用75%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥得到通关藤粗皂苷约170g。
以3Kg的50%乙醇溶解通关藤粗皂苷，缓慢加入粒径50～75μm的MCI Gel反相树脂柱，流速控制在20ml/min，用40%乙醇洗至淋洗液吸光度恒定，以80%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥得到通关藤总皂苷约115g。
经检测，每mg通关藤总皂苷中含有通关藤苷A 0.3517mg，牛奶菜苷K 0.1428mg，异通关藤苷A 0.0281mg，通关藤苷元B 0.0206mg，通关藤苷G 0.1676mg。
实施例3
取通关藤药材10Kg，置于80Kg的75%乙醇溶液中，浸泡过夜，加热至回流温度进行提取，提取的次数为3次，每次2小时。提取液过滤，滤液减压浓缩回收乙醇后，冷冻干燥得到通关藤粗提取物约720g。
将ZTC-1大孔吸附树脂以2倍体积的丙酮浸泡过夜，置于层析柱中，以丙酮淋洗至无白色沉淀，再用乙醇淋洗，至乙醇液加水无白色浑浊后，以蒸馏水淋洗至无醇味。
MCI Gel反相树脂作相同处理。
将通关藤粗提取物用14.4Kg蒸馏水溶解，离心，取上清液缓慢加入ZTC-1大孔吸附树脂柱，流速控制在20ml/min，依次用蒸馏水和50%乙醇淋洗树脂柱至淋洗液无色后，用75%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥得到通关藤粗皂苷约135g。
以1.35Kg的40%乙醇溶解通关藤粗皂苷，缓慢加入粒径50～75μm的MCI Gel反相树脂柱，流速控制在20ml/min，用45%乙醇洗至淋洗液吸光度恒定，以75%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥得到通关藤总皂苷约100g。
经检测，每mg通关藤总皂苷中含有通关藤苷A 0.3501mg，牛奶菜苷K 0.1736mg，异通关藤苷A 0.0221mg，通关藤苷元B 0.0259mg，通关藤苷G 0.1455mg。
应用例1：通关藤总皂苷体外抗肿瘤作用研究
1．试剂与材料
1.1 药品与试剂
PBS，DMEM（高糖型）培养基购自Neuronbc公司产品；4%多聚甲醛固定液：博士德生物工程有限公司；青链霉素混合液，胰酶消化液，MTT，DMSO均购自Solarbio公司；特级胎牛血清购自北京元亨生物制品科技责任有限公司；Annexin-V-FITC试剂盒：BECKMAN COULTER；Hoechst-33258：南京凯基生物科技发展公司；顺铂注射液（6ml:30mg）江苏豪森药业股份有限公司。
1.2 细胞株
人肝癌细胞株Hepg2，由山西医科大学惠赠。
1.3 实验仪器
CelMate®系列CO2培养箱，ESCO贸易有限公司；YZQ-B恒温摇床，上海双舜实业发展有限公司；Eppendorf Research移液枪，北京博仪恒业科技公司；WD-2102A自动酶标仪，北京市六一仪器厂；XDS-500C倒置荧光显微镜，上海蔡康光学仪器有限公司；Cell Lab QuantaSC流式细胞仪，BECKMAN-COULTER公司。
2．实验方法
2.1 细胞培养
人肝癌细胞株Hepg2在37℃，5%CO2培养箱中培养，培养液DMEM（高糖型）含10%特级胎牛血清，100U/ml青链霉素混合液。
2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率
取对数生长期的细胞，加入适量胰酶消化液，使贴壁细胞脱落，用15ml 含10%胎牛血清的DMEM培养基配置成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔板，每孔100μl，空白孔加100μl无血清DMEM培养基，加细胞过程控制在3h内完成。用台盼蓝染色后在计数板上作细胞计数，不着色的活细胞在97%以上。将培养板移入CO2培养箱，在37℃，5%CO2条件下，继续培养24h。
将受试药物通关藤粗提取物（Ma）和通关藤总皂苷（MaT）分别配置成由高到低四个浓度，阳性对照药物顺铂注射液配制成浓度为0.014和0.007 mg/ml，每孔加药10μl，每个浓度3个复孔。将培养板移入CO2培养箱，在37℃，5%CO2条件下，继续培养48h。同时与实验孔平行设置不加细胞，只加DMEM培养基的空白孔作为对照。
孵育培养48h后，用PBS小心清洗培养板，加入用DMEM培养基配置成1mg/ml的MTT溶液，在37℃，5%CO2条件下，继续培养4h，使MTT还原。小心吸取孔内上清液，弃去，每孔加入150μl DMSO，震荡10min，使结晶物溶解。
以空白孔调零，采用自动酶标仪在490nm波长下检测各孔吸光度A值。
按照下述公式计算抑制率：
细胞增殖抑制率=[1-(A给药组-A空白孔)/(A阴性对照组-A空白孔)]×100%。
以LOGIT法计算半数抑制浓度IC50。
2.3 Hoechst-33258染色观察Hepg2细胞凋亡形态
取对数生长期的人肝癌细胞Hepg2细胞制成细胞悬液，按照细胞浓度为5×104/ml接种于铺好盖玻片的24孔板，每孔500μl。将培养板移入CO2培养箱，在37℃，5%CO2条件下，继续培养24h。
孵育培养24h后，加入浓度分别为2.125mg/ml，1.153mg/ml，0.576mg/ml，0.288mg/ml的通关藤总皂苷（MaT）溶液，空白对照组加等体积无血清DMEM培养基，继续培养48h，吸尽孔内培养液，4%多聚甲醛固定细胞，4℃，固定10分钟，用PBS小心清洗培养板2～3次，吸尽液体。PBS清洗后，加Hochest-33258，避光染色10min，取出，爬片，然后用水冲净，晾干，以350nm波长激发，荧光显微镜下观察Hepg2细胞凋亡形态的改变。
2.4 流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率
取对数生长期的人肝癌细胞Hepg2制成细胞悬液，按照每孔5×105的细胞数接种于6孔板，活细胞计数大于97%，将培养板移入CO2培养箱，在37℃，5%CO2条件下，继续培养24h。孵育培养24h后，加入浓度分别为2.125mg/ml，1.153 mg/ml，0.576mg/ml，0.288 mg/ml的通关藤总皂苷（MaT）溶液，阴性组加入相等体积且无血清的DMEM培养基，于37℃，5%CO2的培养箱中继续培养48h，胰酶消化细胞后收集于离心管中，用PBS洗涤一次，离心，弃去上清，将Hepg2细胞悬浮于100μl PBS溶液中，每管加Annexin-V-FITC 5μl，PI 2.5μl，轻轻震荡，混匀，置于冰上避光染色10min，加400μl Buffer，于流式细胞仪上检测细胞凋亡率。实验结果采用SPSS13.0统计软件进行分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。
3．实验结果
3.1 MTT检测细胞增殖抑制率
实验发现，通关藤总皂苷对人肝癌细胞Hepg2的抑制作用高于通关藤粗提取物，高浓度组与空白对照组差异显著，当提取物浓度大于0.312mg/ml时，人肝癌细胞Hepg2的增殖即受到抑制，且随着药物剂量的增大其差异更为显著。通关藤总皂苷（MaT）和通关藤粗提取物（Ma）的IC50值分别为0.7528mg/ml和0.8400mg/ml。具体结果见表2，图11。
3.2 Hoechst-33258染色观察Hepg2细胞凋亡形态
通关藤总皂苷处理组荧光染色后可以看见典型的细胞凋亡特征，比如明显的核浓缩引起的强荧光块等，且随着通关藤总皂苷浓度的增加，凋亡细胞数越来越多，凋亡形态改变愈明显，通关藤总皂苷高浓度组可明显观察到核碎裂形成的凋亡小体。因此，Hepg2细胞凋亡随着通关藤总皂苷浓度的增加呈现出一定的量效关系。阴性对照组细胞大小均一，成弥散均匀的淡蓝色弱荧光，见图12。
3.3 流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率
不同浓度的通关藤总皂苷（MaT）均可诱导Hepg-2细胞凋亡，且凋亡率随总皂苷浓度的增加而增加，而与阴性对照组比较差异无统计学意义，结果见图13，表3。
本应用例结果表明，通关藤粗提取物和总皂苷对体外培养的人肝癌Hepg-2细胞的增殖具有抑制作用，且呈现出良好的量效关系。不同浓度的通关藤总皂苷处理Hepg-2细胞后，Hoechst-33258荧光染色均可见核浓缩致密的强荧光团块的细胞凋亡特征，且随药物浓度增加，凋亡形态学改变愈明显。流式细胞仪检测结果显示，0.288～2.125mg/ml通关藤总皂苷均可诱导人肝癌Hepg-2细胞凋亡，且凋亡率随通关藤总皂苷浓度的增加而增加，在2.125mg/ml时细胞凋亡率达45.64±4.37%。上述结果揭示通关藤总皂苷抗肿瘤作用的机制之一为诱导肿瘤细胞凋亡。
应用例2：通关藤总皂苷体内抗肿瘤作用研究
1．试剂与材料
1.1 受试药物及配制
通关藤总皂苷（MaT），实验室自制，顺铂注射液（6ml:30mg），江苏豪森药业股份有限公司。生理盐水溶液配制成所需浓度。
1.2 实验动物及细胞株
昆明种小鼠，普通级，体重19±3g，雌雄各半，购自医学科学院动物研究所，许可证编号：SCXK（京）2009-0008。领回后饲养于清洁恒温环境中，自由饮水进食。
瘤株：小鼠肉瘤S180瘤株，小鼠肝癌细胞H22，小鼠艾氏腹水癌细胞EAC，由山西省肿瘤医院提供。
2．实验方法
2.1 MaT对小鼠肉瘤S180抑制实验
无菌条件下抽取第二代荷S180小鼠腹水，NS调整细胞密度为1.5×107个/ml，接种于小鼠右侧腋窝下，0.2ml/只，共接种50只。接种次日，将小鼠随机分为模型组、阳性（顺铂）组(5mg/kg，ip，10ml/kg)，MaT高、中、低剂量组(50，25，12.5mg/kg，iv，10ml/kg)，另设一正常组，每组10只小鼠。阳性对照组给药一次；模型组、给药组分别给予生理盐水和MaT溶液，连续给药10d。末次给药后称体重，颈椎脱臼处死小鼠后剥离瘤块，取肝脏、脾脏、胸腺并称质量。按下列公式计算抑瘤率和脏器指数。
抑瘤率=(对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%，
脏器指数=相应脏器质量(mg)/小鼠体重(g)。
2.2 MaT对小鼠肝癌细胞H22抑制实验
无菌条件下抽取第二代H22荷瘤小鼠腹水，NS调整细胞密度为1.5×107个/ml，接种于小鼠右侧腋窝下，0.2ml/只，共接种50只。接种次日，将小鼠随机分为模型组、阳性（顺铂）组(5mg/kg，ip，10ml/kg)，MaT高、中、低剂量组(50，25，12.5mg/kg，iv，10ml/kg)，另设一正常组，每组10只小鼠。阳性对照组给药一次；模型组、给药组分别给予生理盐水和MaT溶液，连续给药10d。末次给药后称体重，颈椎脱臼处死小鼠后剥离瘤块，取肝脏、脾脏、胸腺并称质量，计算抑瘤率和脏器指数。
2.3 MaT对小鼠艾氏腹水癌细胞抑制实验
将EAC细胞浓度调整为1×106个/ml，于小鼠左下腹腔进行接种，每只小鼠接种0.2ml细胞悬液，细胞总数为2×105个。接种后24h称重分组，将小鼠随机分为模型组、阳性（顺铂）组(5mg/kg，ip，10ml/kg)，MaT高、中、低剂量组(50，25，12.5mg/kg，iv，10ml/kg)，另设一正常组，每组10只小鼠。阳性对照组给药一次；模型组、给药组分别给予生理盐水和MaT溶液，连续给药10d。停药后观察荷瘤小鼠生存状态和生存延长时间。
3．实验结果
3.1.1 MaT对小鼠肉瘤S180的抑制率
表4实验结果表明，MaT大、中剂量均对S180小鼠肿瘤有抑制作用，其中大剂量与模型组相比有显著性差异（P<0.01），对S180肿瘤抑制作用较好。
3.1.2 MaT对小鼠肉瘤S180抑制的脏器指数影响
表5结果显示，各给药组脾脏指数、胸腺指数和体重与阳性组相比，均有显著增加的趋势，各脏器指数与给药剂量的相关趋势不明显。
3.2.1 MaT对小鼠肝癌细胞H22的抑制率
由表6数据可知，MaT大剂量组的瘤重与模型组有显著性差异，MaT大剂量组对H22肿瘤有抑制作用，中、小剂量组无显著性差异。
3.2.2 MaT对小鼠肝癌细胞H22抑制的脏器指数影响
由表7数据结果可知，MAT大、中剂量组的脏器指数和体重与阳性组相比，均有显著性差异，说明MAT大中剂量组均能明显增加小鼠的脏器指数，而小剂量给药组则在此方面无显著效果；阳性组与大剂量组与模型组的体重有显著性差异，能明显减轻模型小鼠的体重。
3.3 MaT对小鼠艾氏腹水癌细胞延长生命时间的影响
由表8结果可知，大剂量给药组及中剂量给药组的生存时间与模型组相比有显著性差异，说明大、中剂量组能够有效延长EAC小鼠的生存时间；而小剂量组及阳性组与模型组相比则无显著差异。

Claims (8)

1.一种通关藤化合物，具有下述式（Ⅰ）所述的结构，
所述通关藤化合物为白色粉末，熔点218.2℃，分子式C48H74O19，分子量954，为化合物通关藤苷A的同分异构体，结构式中18位为反式构型，命名为异通关藤苷A。
2.一种通关藤总皂苷，所述每mg通关藤总皂苷中含有下述活性组分：0.3～0.4mg通关藤苷A，0.1～0.2mg牛奶菜苷K，0.02～0.03mg异通关藤苷A，0.02～0.03mg通关藤苷元B，以及0.1～0.2mg通关藤苷G。
3.根据权利要求2所述的通关藤总皂苷，其特征是每mg通关藤总皂苷中含有0.32～0.36mg通关藤苷A，0.12～0.18mg牛奶菜苷K，0.02～0.03mg异通关藤苷A，0.02～0.03mg通关藤苷元B， 0.12～0.18mg通关藤苷G。
4.权利要求2所述通关藤总皂苷的提取方法，所述方法包括：
1)将通关藤药材以相当于药材8～12倍重量的70～75%乙醇浸泡过夜，加热至回流温度进行提取，提取液过滤并减压浓缩回收乙醇后，干燥得到通关藤粗提取物；
2)将通关藤粗提取物以相当于粗提取物10～20倍重量的蒸馏水溶解，离心，取上清液上ZTC-1大孔吸附树脂柱，依次用蒸馏水和50～55%乙醇淋洗树脂柱至淋洗液无色，用70～75%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，干燥得到通关藤粗皂苷；
3)取通关藤粗皂苷，以相当于粗皂苷8～15倍重量的40～50%乙醇溶解，上MCI Gel反相树脂柱，用40～50%乙醇淋洗树脂柱至淋洗液吸光度恒定，以75～80%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，干燥得到通关藤总皂苷；
其中，所述各乙醇溶液的浓度均为体积百分浓度。
5.根据权利要求4所述的通关藤总皂苷的提取方法，其特征是将所述浸泡过夜的通关藤药材加热回流提取3次，每次2～3小时。
6.根据权利要求4所述的通关藤总皂苷的提取方法，其特征是所述MCI Gel反相树脂的粒径为50～75μm。
7.根据权利要求4所述的通关藤总皂苷的提取方法，其特征是所述ZTC-1大孔吸附树脂和MCI Gel反相树脂在使用前以2～4倍体积的丙酮浸泡过夜，置于层析柱中，先以丙酮淋洗至溶液无白色沉淀，再用乙醇淋洗至乙醇液加水无白色浑浊，最后以蒸馏水淋洗至无醇味。
8.根据权利要求4所述的通关藤总皂苷的提取方法，其特征是所述的干燥为冷冻干燥。
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