CN103936590B - 大戟属中的二萜类化合物及其药物组合物和其在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从高山大戟中分离获得的1个新的巨大戟烷型二萜(1)和1个惕各烷型二萜(2)以及从大果大戟中分离获得的2个巨大戟烷型二萜(3,4)及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。体外抗肿瘤活性筛选表明，本发明化合物具有明显的抑制肿瘤细胞增殖活性，可以和药学上可接受的载体结合制成临床上可接受的药物剂型，用于治疗各类癌症。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供先导化合物，对开发利用药用植物资源具有重要价值。

Description

大戟属中的二萜类化合物及其药物组合物和其在制药中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及大戟属植物高山大戟和大果大戟中分离得到的3个巨大戟烷型二萜和1个惕各烷型二萜类化合物及其制备方法和用途。上述化合物对肿瘤细胞株具有明显的抑制作用，可作为研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可以作为研制治疗各种临床常见多发癌症的药物。

技术背景

肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。近年来手术切除和放射治疗效果大有驻足不前之势，因此作用于全身的化学药物治疗得到人们越来越多的重视。然而，化疗药物在杀灭癌细胞的同时，对人体正常细胞也产生毒副作用，这种无法回避的有时是十分严重的毒副作用，大大限制它的广泛应用和疗效的发挥，更何况占肿瘤绝大部分的实体癌，迄今化疗效果尚多不理想，因此，在抗恶性肿瘤药物的研究中，研究和开发毒副作用低、选择性高的抗恶性肿瘤药物已成为亟待解决的问题。

大戟属(Euphorbia)是大戟科中最大的一个属，该属植物具有重要的药用价值，其中不少种在国内外都有着悠久的药用历史。《中华本草》藏药卷记载高山大戟(E.stracheyi)的块根具有缓泻、解毒等作用，主治胆病、肠胃积滞等症。《西藏经济植物》记载大果大戟(E.wallichii)全草入药，具有泻水、消肿、散结、杀虫之效，可退热、祛寒、破瘀、利胆、催吐等。现代研究表明大戟属植物中含有结构丰富多样的萜类代谢产物。然而现有技术中未见有可从大戟属植物中提取上述具有明显的抑制肿瘤细胞增殖活性的3个巨大戟烷型和1个惕各烷型二萜类化合物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从大戟属植物中，具体是从藏药高山大戟和大果大戟中提取得到二萜类化合物，并将其用于制备抗肿瘤药物。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

如下结构式所示的二萜类化合物，

制备所述的二萜类化合物的方法，步骤依次如下：

(1)提取：干燥的大戟属植物地上部分用醇溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏，粗浸膏加水混悬均匀后用乙酸乙酯萃取，所得萃取液浓缩后得到乙酸乙酯浸膏；

(2)分离：上述浸膏经MCI柱色谱脱色处理后，采用硅胶或RP–18柱层析梯度洗脱进行粗分，所得极性较小的部分再分别采用硅胶、SephadexLH–20、RP–18柱色谱和HPLC制备等色谱技术反复分离纯化，薄层层析检测，得化合物纯品。

所述的制备方法，其中步骤(1)所用的大戟属植物为高山大戟、大果大戟，也可以采用其他大戟属植物。

所述的制备方法，其中步骤(2)中脱色、粗分、进一步纯化中所采用的色谱填料为MCI、硅胶、SephadexLH–20、RP–18，也可以为其他色谱填料；所用的洗脱溶剂为乙醇-水、甲醇-水、石油醚-乙酸乙酯、氯仿-乙酸乙酯、氯仿-甲醇，或其他溶剂组合。

本发明更具体的制备方法为：高山大戟干燥全草粉碎后用90％乙醇室温下冷浸24h，过滤，合并提取液，减压回收乙醇得粗浸膏，加水混悬均匀后用乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯浸膏，浸膏经聚酰胺、MCI串联20:80－100:0的甲醇–水梯度洗脱，合并相同流分，得5部分F1–F5；取F4经硅胶柱10:1－3:2的氯仿–乙酸乙酯梯度洗脱得到4小部分F4a–F4d，取F4c经SephadexLH-20柱色谱氯仿:甲醇＝1:1纯化后经HPLC甲醇:水＝82:18半制备得化合物1；取F5经硅胶柱10:1－2:3的石油醚–乙酸乙酯梯度洗脱得到3小部分F5a–F5c，取F5a经HPLC甲醇:水＝92:8半制备得化合物2；

大果大戟的干燥地上部分，粉碎后用90％乙醇室温下冷浸24h，过滤，合并提取液，减压回收乙醇得粗浸膏，加水混悬均匀，用乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯浸膏，浸膏经MCI脱色即95％乙醇洗脱后，用硅胶柱1:0－1:1的氯仿–丙酮梯度洗脱进行粗分，合并相同流分，得8部分F1–F8；F1经SephadexLH-20柱色谱氯仿:甲醇＝1:1纯化后经RP–18柱色谱3:7－10:0的甲醇–水梯度洗脱得到5小部分F1a–F1e，取F1d经硅胶柱氯仿:乙酸乙酯＝6:1纯化后经HPLC甲醇:水＝9:1半制备得化合物3和4。

本发明同时提供了含有治疗有效量的上述化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

所述的二萜类化合物在制备治疗癌症或肿瘤药物中的应用。

所述的药物组合物在制备治疗癌症或肿瘤药物中的应用。

所述的应用，其中所述的癌症为宫颈癌、肝癌、肺腺癌。

所述的二萜类化合物在制备治疗宫颈癌、肝癌、肺腺癌药物中的应用。

本发明从产自青藏高原的两种大戟属藏药材中发现了4个文献和专利中未报道过具有明显的抑制肿瘤细胞增殖活性的二萜，可以用在治疗癌症或肿瘤的药物中。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1–99％，优选为0.5–90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、超填料以及药物制品辅剂。将所述的有效提取物或有效部位以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和口腔喷雾两种形式给药。

口服可用其固体或液体制剂，如粉剂、片剂、糖衣片剂、胶囊、酊剂、糖浆、滴丸剂等。

口腔喷雾可用其固体或液体制剂。

具体实施方式：

下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

二萜化合物的制备：

高山大戟干燥全草(1.5kg)粉碎后用90％乙醇(4×6L)室温下冷浸24h，过滤，合并提取液，减压回收乙醇得粗浸膏，加水混悬均匀后用乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯浸膏103g，浸膏经聚酰胺、MCI串联甲醇–水(20:80至100:0)梯度洗脱，合并相同流分，得5部分(F1–F5)。取F4经硅胶柱氯仿–乙酸乙酯(10:1至3:2)梯度洗脱得到4小部分(F4a–F4d)，取F4c经SephadexLH-20柱色谱(氯仿：甲醇＝1:1)纯化后经HPLC(甲醇：水＝82:18)半制备得化合物1(1.3mg)。取F5经硅胶柱石油醚–乙酸乙酯(10:1至2:3)梯度洗脱得到3小部分(F5a–F5c)，取F5a经HPLC(甲醇：水＝92:8)半制备得化合物2(32.7mg)。

大果大戟的干燥地上部分10.6kg，粉碎后用90％乙醇(3×25L)室温下冷浸24h，过滤，合并提取液，减压回收乙醇得粗浸膏，加水混悬均匀，用乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯浸膏938g,浸膏经MCI脱色(95％乙醇洗脱)后，用硅胶柱氯仿–丙酮(1:0至1:1)梯度洗脱进行粗分，合并相同流分，得8部分(F1–F8)。F1经SephadexLH-20柱色谱(氯仿：甲醇＝1:1)纯化后经RP-18柱色谱甲醇–水(3:7至10:0)梯度洗脱得到5小部分(F1a–F1e)，取F1d经硅胶柱(氯仿：乙酸乙酯＝6:1)纯化后经HPLC(甲醇：水＝9:1)半制备得化合物3(35.3mg)和4(8.5mg)。

本发明的3个巨大戟烷型二萜(1：StracheyioidC；3：3-O-tetradecanoylingenol；4：20-O-tetradecanoylingenol)和1个惕各烷型二萜(2：12-O-tetradecanoyl-13,20-O-diacetylphorbol)结构式如下：

上述化合物1–4具有以下理化特性：

化合物1：无色油状液体；positiveESIMSm/z605[M+Na]⁺,1187[2M+Na]⁺；HREIMSm/z582.3182[M]⁺(calcdforC₃₄H₄₆O₈,582.3193)；EIMSm/z414(13),354(52),312(97),294(100),151(53),123(52)；[α]+48.0(c0.12,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.46)nm；IR(KBr)ν_max3440,2956,2927,2871,1729,1642,1461,1380,1234,1156,1025,987cm^-1；¹H-NMR(CDCl₃,600MHz)δ:6.07(1H,brs,H-1),4.98(1H,s,H-3),5.43(1H,s,H-5),6.20(1H,d,J＝4.0Hz,H-7),4.26(1H,m,H-8),2.51(1H,m,H-11),2.28(1H,m,H-12a),1.73(1H,m,H-12b),0.69(1H,q,J＝8.4Hz,H-13),0.94(1H,dd,J＝11.8,8.4Hz,H-14),1.04(3H,s,H-16),1.07(3H,s,H-17),0.98(3H,d,J＝7.1Hz,H-18),1.75(3H,d,J＝1.0Hz,H-19),4.47,4.22(2H,ABq,J＝12.5Hz,H-20),2.09(3H,s,H-2'),5.80(1H,d,J＝11.4Hz,C-2"),7.05(1H,t,J＝11.4Hz,C-3"),7.21(1H,t,J＝11.4Hz,C-4"),5.94(1H,m,C-5"),2.23(2H,q,J＝7.7Hz,C-6"),1.39(2H,quint,J＝7.7Hz,C-7"),1.27(2H,m,C-8"),1.28(2H,m,C-9"),0.86(3H,t,J＝6.9Hz,C-10"),1.93(3H,s,H-2"')；¹³C-NMR(CDCl₃,150MHz)δ:132.2(d,C-1),135.7(s,C-2),82.4(d,C-3),85.9(s,C-4),77.0(d,C-5),133.5(s,C-6),131.4(d,C-7),43.6(d,C-8),205.7(s,C-9),71.9(s,C-10),38.6(d,C-11),31.1(t,C-12),23.0(d,C-13),22.9(d,C-14),24.4(s,C-15),28.4(q,C-16),15.6(q,C-17),17.1(q,C-18),15.5(q,C-19),66.3(t,C-20),172.6(s,C-1'),21.2(q,C-2'),165.8(s,C-1"),115.5(d,C-2"),141.4(d,C-3"),124.2(d,C-4"),143.2(d,C-5"),27.6(t,C-6"),29.0(t,C-7"),31.4(t,C-8"),22.5(t,C-9"),14.0(q,C-10"),170.7(s,C-1"'),20.9(q,C-2"').

化合物2：无色油状液体；positiveESIMSm/z681[M+Na]⁺,1339[2M+Na]⁺；¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:7.57(1H,s,H-1),2.52,2.38(2H,ABq,J＝19.1Hz,H-5),5.68(1H,d,J＝4.7Hz,H-7),3.22(1H,s,H-10),5.37(1H,d,J＝10.4Hz,H-12),1.20(3H,s,H-16),1.18(3H,s,H-17),1.04(3H,d,J＝5.1Hz,H-18),1.74(3H,d,J＝1.0Hz,H-19),4.44,4.40(2H,ABq,J＝12.8Hz,H-20),2.29(2H,dd,J＝11.9,7.3Hz,H-2'),0.84(3H,t,J＝7.0Hz,H-14'),2.02(3H,s,C-2"),2.06(3H,s,H-2"')；¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz)δ:161.3(d,C-1),133.1(s,C-2),209.3(s,C-3),73.9(s,C-4),39.3(t,C-5),135.9(s,C-6),133.3(d,C-7),39.7(d,C-8),78.5(s,C-9),56.5(d,C-10),43.3(d,C-11),76.8(d,C-12),65.9(s,C-13),36.4(d,C-14),26.0(s,C-15),24.2(q,C-16),14.5(q,C-17),17.2(q,C-18),10.5(q,C-19),69.8(t,C-20),171.2(s,C-1'),35.0(t,C-2'),25.6(t,C-3'),30.1(t,C-4'),30.0(t,C-5'),30.0(t,C-6'),29.9(t,C-7'),29.8(t,C-8'),29.7(t,C-9'),29.4(t,C-10'),30.0(t,C-11'),32.3(t,C-12'),23.1(t,C-13'),14.8(q,C-14'),174.2(s,C-1"),21.4(q,C-2"),174.2(s,C-1"'),21.5(q,C-2"').

化合物3：淡黄色油状液体；positiveESIMSm/z581[M+Na]⁺,1139[M+Na]⁺；¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:6.04(1H,d,J＝1.4Hz,H-1),5.51(1H,s,H-3),4.04(1H,s,H-5),6.06(1H,d,J＝4.2Hz,H-7),4.19(1H,m,H-8),2.52(1H,m,H-11),2.28(1H,m,H-12a),1.73(1H,m,H-12b),0.71(1H,q,J＝7.4Hz,H-13),0.94(1H,m,H-14),1.07(3H,s,H-16),1.10(3H,s,H-17),0.99(3H,d,J＝7.1Hz,H-18),1.79(3H,s,H-19),4.17,4.11(2H,ABq,J＝12.0Hz,H-20),2.42(2H,td,J＝7.5,2.4Hz,H-2'),1.67(2H,quint,J＝7.5Hz,H-3'),1.27(20H,s,H-4'–13'),0.90(3H,t,J＝6.7Hz,H-14').¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz)δ:132.1(d,C-1),135.8(s,C-2),82.6(d,C-3),84.8(s,C-4),76.4(d,C-5),139.1(s,C-6),128.4(d,C-7),43.4(d,C-8),206.9(s,C-9),71.7(s,C-10),38.4(d,C-11),31.9(t,C-12),23.1(d,C-13),22.9(d,C-14),24.0(s,C-15),28.5(q,C-16),15.5(q,C-17),17.1(q,C-18),15.5(q,C-19),67.2(t,C-20),174.8(s,C-1'),34.5(t,C-2'),25.1(t,C-3'),29.6(t,C-4'),29.5(t,C-5'),29.5(t,C-6'),29.3(t,C-7'),29.3(t,C-8'),29.3(t,C-9'),29.0(t,C-10'),29.5(t,C-11'),30.9(t,C-12'),22.7(t,C-13'),14.1(q,C-14').

化合物4：淡黄色油状液体；positiveESIMSm/z581[M+Na]⁺,1139[M+Na]⁺；EIMSm/z540(12),522(14),330(28),312(37),294(33),211(31)；¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:5.91(1H,d,J＝1.2Hz,H-1),4.41(1H,s,H-3),3.64(1H,s,H-5),6.06(1H,d,J＝4.1Hz,H-7),4.08(1H,dd,J＝7.8,4.1Hz,H-8),2.32(1H,m,H-11),2.27(1H,m,H-12a),1.75(1H,m,H-12b),0.70(1H,q,J＝6.5Hz,H-13),0.92(1H,m,H-14),1.05(3H,s,H-16),1.10(3H,s,H-17),0.96(3H,d,J＝7.1Hz,H-18),1.84(3H,s,H-19),4.69,4.53(2H,ABq,J＝12.8Hz,H-20),2.30(2H,t,J＝7.5Hz,H-2'),1.58(2H,quint,J＝7.0Hz,H-3'),1.25(20H,s,H-4'–13'),0.87(3H,t,J＝6.6Hz,H-14').¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz)δ:129.6(d,C-1),138.8(s,C-2),80.4(d,C-3),84.2(s,C-4),73.7(d,C-5),136.7(s,C-6),127.8(d,C-7),44.0(d,C-8),207.0(s,C-9),72.5(s,C-10),39.6(d,C-11),31.9(t,C-12),23.1(d,C-13),22.9(d,C-14),24.0(s,C-15),28.5(q,C-16),15.4(q,C-17),17.3(q,C-18),15.4(q,C-19),67.3(t,C-20),174.3(s,C-1'),34.3(t,C-2'),24.9(t,C-3'),29.7(t,C-4'),29.7(t,C-5'),29.7(t,C-6'),29.4(t,C-7'),29.3(t,C-8'),29.2(t,C-9'),29.1(t,C-10'),29.6(t,C-11'),30.9(t,C-12'),22.7(t,C-13'),14.1(q,C-14').

实施例2：

本发明二萜类化合物(1–4)的药理试验：

实验材料：DMEM培养基、新生牛血清、胰蛋白酶、MTT、DMSO、人肺腺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2、人宫颈癌细胞株Hela、CO₂培养箱、超净工作台、酶标仪、倒置显微镜、细胞培养瓶、96孔细胞培养板。

实验方法：

1.培养基配制：GIBCODMEM液体培养基，4℃冷藏备用。

2.小牛血清灭活：200mL超级新生牛血清，–40℃冰箱取出后室温融化，56℃水浴30min。冷却后分装于15mL离心管，–40℃冰箱冷冻备用。

3.完全培养液：DMEM培养基95mL，加入5mL灭活新生牛血清，混匀。

4.样品贮备液：精确量取各样品提取物10.0mg，加入灭菌的1.5mL离心管中，加入1mLDMSO溶解，冷冻备用。

5.含药培养液：完全培养液1mL加于灭菌西林瓶，加入各样品贮备液20μL,即为200μg/mL待测药液。

6.0.25％胰酶：灭菌D-Hanks缓冲液100mL，加胰酶0.25g，轻轻搅拌使完全溶解，调节pH值至7.2，以0.22μm孔径除菌滤膜过滤除菌，分装于15mL离心管，冷冻保存备用。

7.MTT，以DMEM培养基配成5mg/mL溶液，0.22μm孔径除菌滤膜过滤除菌，分装于1.5mL离心管，–40℃冰箱冷冻保存备用。

8.冻存细胞的复苏：取出液氮罐内冻存细胞冻存管，迅速加于37℃温水中振荡使完全融化，将冻存管内细胞转移至灭菌的15mL带盖塑料离心管中，加入10mL完全培养液，吹打均匀，1000转/min离心10min。弃上清液，以5mL完全培养液重悬细胞，将细胞悬液转入培养瓶，于37℃、5％CO₂、饱合湿度下培养。

9.细胞传代：细胞长满瓶底后用灭菌D-hanks液洗两次，加0.25％胰蛋白酶消化细胞2分钟，倒掉胰蛋白酶，待轻摇细胞能完全脱落后，加完全培养液15mL后，用移液管吹散细胞，分装于3个新的细胞培养瓶中，或调整细胞浓度后，加入96孔培养板，继续培养。

10.药物处理及结果测定：取刚刚长满的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液台盼蓝染色，于显微镜下计数活细胞数目，并确定死细胞数<5％，否则弃之不用。用完全培养液调整细胞数目至1×10⁵个细胞/mL。于96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，将培养板置于CO₂培养箱中培养24h，取出培养板后于每孔中补加100μL含不同浓度样品的完全培养液，得到不同浓度的药物溶液。每个浓度设4个平行孔，另设4孔细胞加入不含药完全培养液作阴性对照孔，4孔细胞加入含5-氟尿嘧啶的完全培养液作阳性对照，5-氟尿嘧啶终浓度为20μg/mL。加完药后培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于CO₂培养箱中继续培养48h。取出培养板，每孔加入10μL5mg/mL的MTT液，振荡混匀，继续培养4h。弃去每孔中培养液，加150μL的DMSO溶解formazan结晶，振荡使完全溶解。于BioRad酶标仪测定各孔光吸收，测定波长570nm，参考波长630nm。

11、结果处理：根据各孔OD值计算药物对细胞增殖的抑制率

实验结果：

表1不同样品对人宫颈癌细胞株Hela的半数抑制浓度(IC₅₀)

表2不同样品对肝癌细胞株HepG2的半数抑制浓度(IC₅₀)

表3不同样品对肺腺癌细胞A549的半数抑制浓度(IC₅₀)

由上述实验结果可看出本发明所涉及的二萜类化合物1和4对人宫颈癌细胞的增殖具有较强的抑制作用；化合物2和3对肝癌细胞的增殖具有较强的抑制作用；化合物3对肺腺癌细胞的增殖具有较强的抑制作用。

二萜类化合物1–4对其他肿瘤细胞也具有较好的抑制作用，可用于开发抗肿瘤、抗癌类药物，尤其针对临床化疗阶段的药物。

实施例3：

注射剂的制备

按实施例1的方法先制得二萜化合物，将其与20％聚氧乙烯醚蓖麻油混合，溶解到含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、尼泊金酯和羧甲基纤维素钠的水中，制成的混悬型注射剂。

也可将实施例1的方法制得的二萜化合物各用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封、灭菌制成注射液。

实施例4：

片剂或胶囊剂的制备

按实施例1的方法先制得二萜化合物，将其与药剂学意义上的填充剂、崩解剂组成的常规片剂或胶囊剂；或者是将其与填充剂和羟丙甲基纤维素组成的缓释片剂或胶囊剂；其中填充剂可选乳糖、微晶纤维素，糊精，淀粉，磷酸钙；崩解剂可选用羟丙纤维素，羧甲基淀粉钠、交联聚维酮，交联羧甲基纤维素钠；亦可选加粘合剂、润滑剂或湿润剂。

例如按照重量比，本发明中的二萜化合物1份：乳糖或微晶纤维素0.05～0.2：羟丙纤维素或羧甲基淀粉钠0.05～0.2；或者，本发明中的二萜化合物1份：乳糖或微晶纤维素0.03～0.08：羟丙甲基纤维素K4M0.15～0.4。所述药物更为理想的配方为：按照重量比，本发明中的二萜化合物1份：乳糖或微晶纤维素0.08～0.12：羟丙纤维素或羧甲基淀粉钠0.08～0.12；或者，本发明中的二萜化合物1份：乳糖或微晶纤维素0.05～0.07：羟丙甲基纤维素K4M0.2～0.3。

实施例5：

粉针剂的制备

按实施例1的方法先制得二萜化合物，将其用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装与安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封的粉针剂。

实施例6：

粉剂的制备

按实施例1的方法先制得二萜化合物，将其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例7：

口服剂的制备

按实施例1的方法先制得二萜化合物，将其按常规口服液制法制成口服液。

Claims (1)

1.如下结构式所示的二萜类化合物1在制备治疗宫颈癌的药物中的应用，