CN101019891B

CN101019891B - 蟾皮总碱及其制备和分析方法以及其制剂

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Publication number: CN101019891B
Application number: CN2007100203398A
Authority: CN
Inventors: 周亚球; 刘金旗
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-02-14
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2027-02-14
Also published as: CN101019891A

Abstract

本发明提供了一种蟾皮总碱的制备方法，蟾皮总碱中吲哚类总生物碱含量为50％～95％，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为0.02％～0.08％，蟾蜍噻宁含量为20％～50％。同时提供了所述蟾皮总碱中有效成份蟾蜍噻宁的含量测定方法，还提供了所述蟾皮总碱作为有效成分，加入药用辅料后制成的注射剂、输液剂、粉针剂、滴丸、胶囊剂、片剂、软胶囊、颗粒剂、口服液等及其制备方法。

Description

蟾皮总碱及其制备和分析方法以及其制剂

一、技术领域

本发明涉及一种蟾皮总碱，该提取物的制备方法、所述蟾皮总碱加入药用辅料后制成的治疗慢性乙型肝炎和抗肿瘤的各种中药制剂、同时涉及蟾皮总碱及其制剂中蟾蜍噻宁的含量测定方法。

二、背景技术

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufomelanostictus Schneider的干燥全皮。蟾皮的化学成分主要有华蟾酥毒基，脂蟾毒配基，蟾毒灵等，以及由它们与琥珀酸，丁二酸，精氨酸等形成的酯类，如蟾毒灵-3-丁二酰精氨酸酯，蟾毒它灵-3-丁二酰精氨酸酯，华蟾毒精-3-丁二酰精氨酸酯，脂蟾毒配基-3-丁二酰精氨酸酯等。还含有吲哚类生物碱，如5-羟色胺，蟾蜍色胺，蟾蜍季胺，蟾蜍噻宁和脱氢蟾蜍色胺等，另外尚含氨基酸、多肽及甾醇类化合物。蟾皮具有清热解毒，利水清胀功效，用于治疗痈疽、肿毒、瘰疬、肿瘤，疳积腹胀，慢性气管炎等。目前，蟾皮提取物制剂主要有华蟾素注射液、华蟾素片剂、华蟾素口服液等，，其中华蟾素注射液更是一种传统的生物药制剂、广泛用于临床，具有解毒、消肿、止痛的功效，临床上主要用于治疗中晚期肿瘤、慢性乙型肝炎，还用于治疗顽固性呃逆、扁平疣及银屑病等症。

目前相关的报导有：“一种华蟾素胶囊及其制备方法”(专利申请号98103562)其蟾皮提取工艺为水提醇沉法，工艺简单，杂质较多，有效成分含量低。“一种纳米华蟾素制剂药物及其制备方法”(专利申请号00136668)该法虽用微波萃取，但未经分离，仍然杂质较多，有效成分含量低。同时该方法对于工艺设备要求严格，目前难以实施。还有一种“华蟾素冻干粉针剂及其制备方法”(专利申请号200410083994.4)，工艺中蟾皮虽经乙醇提取，大孔吸附树脂纯化，其出膏率仍比较高，1.20％～1.38％(w/w)，所含杂质量仍比较多，“一种新的华蟾素冻干粉针及其制备方法和质量控制方法”(专利申请号200510061288.4)，其中蟾皮提取物为水提醇沉法，出膏率大，杂质含量多，有效成分含量低。“一种华蟾素冻干粉针的制备方法”(专利申请号200510115451.0)，其中蟾皮提取物仍为水提醇沉法，有效成分提取不完全，出膏率大，杂质含量多，有效成分含量低。

作为目前市场上蟾皮的主要产品，华蟾素注射液，其蟾皮提取物为水提醇沉，出膏率大，杂质含量高，其中吲哚类总生物碱含量仅为7.0％～10.0％，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量仅为0.001％～0.005％。

三、发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，旨在提供一种蟾皮总碱制备方法、蟾皮总碱药物制剂及含量测定方法。所要解决的技术问题是在保证药效的前提下，尽可能提高蟾皮总碱中吲哚类总生物碱含量，并使其中的一种生物碱含量较高。

本发明所称的蟾皮总碱，是自干蟾皮中提取得到的提取物，其特征是所述提取物中吲哚类总生物碱的含量为50％～95％，生物碱有效成分之一的蟾蜍噻宁含量为20％～50％。

本发明蟾皮总碱中药制剂，其特征是以所述蟾皮总碱为有效成分，加入药用辅料后制成的注射剂或输液剂或粉针剂或滴丸或胶囊剂或片剂或软胶囊或颗粒剂或口服液等。

本发明蟾皮总碱的制备方法，以干蟾皮为原料，包括浸泡、提取、分离、纯化，与现有技术的区别在于首先将洗净的蟾皮用80～90％体积比的甲醇或乙醇或丙酮浸泡2～3小时，然后回流提取至少一次，分离得到滤液或合并的滤液；将滤液减压脱溶至无溶剂味，加入1～3倍量的水搅拌溶解，静置、分离，得到水溶液；水溶液上大孔吸附树脂柱，先水洗脱，后用50％～60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩得到浸膏；将浸膏与柱用氧化铝粉混合均匀后干燥得到粉末；将粉末上中性或碱性氧化铝柱，用不同配比的混合有机溶剂分段洗脱并分段收集；将前段和中段洗脱液合并，经脱溶、干燥后得到吲哚总生物碱含量80％～95％、其中蟾蜍噻宁含量≥35％的蟾皮总碱，将前、中、后三段洗脱液合并，经脱溶干燥后得到吲哚总生物碱含量50％～80％、其中蟾蜍噻宁含量≥25％的蟾皮总碱；所述的混合有机溶剂为氯仿-甲醇，体积比为10∶1～1∶10，或者氯仿-乙酸乙酯-甲醇，体积比为7∶3∶1～1∶3∶7，或者乙酸乙酯-甲醇，体积比为15∶1～1∶10。

所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯型或交联丙烯树脂类的中极性或极性大孔吸附树脂，包括HPD-400或HPD-600或DM301，粒度为0.3mm～1.25mm。

具体操作步骤如下：

a、取干蟾皮，洗净，加6～7倍量85％(v/v)甲醇或乙醇或丙酮，浸泡2小时，回流提取1小时，冷却，过滤，残渣加5～6倍85％(v/v)甲醇或乙醇或丙酮回流提取50分钟，冷却，过滤，合并滤液；

b、步骤a所得滤液经减压浓缩至无溶剂味，加入相当于药材量1-2倍量的水溶解，静置24小时后过滤；

c、步骤b所得滤液上大孔吸附树脂柱，采用中极性或极性大孔吸附树脂，先用2～4倍柱体积水洗脱，再用3～5倍柱体积50％～65％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，至60℃时比重为1.10～1.25的浸膏。

d、步骤c所得浸膏加入10～30倍量中性或碱性氧化铝(100～200目)，拌匀，60℃以下干燥，加入填充好的中性或碱性氧化铝(100～200目)柱上，用氯仿-甲醇(10∶1～1∶10)或氯仿-乙酸乙酯-甲醇(7∶3∶1～1∶3∶7)或乙酸乙酯-甲醇(15∶1～1∶10)洗脱，分段收集，分别得到前段洗脱液、中段洗脱液和后段洗脱液。将所述前段洗脱液和中段洗脱液合并浓缩后，在低于60℃条件下真空干燥，得吲哚类总生物碱含量达80％～95％(重量百分比，下同)的蟾皮总碱，其中蟾蜍噻宁的含量≥35％。将所述前段洗脱液、中段洗脱液和后段洗脱液合并浓缩后，得吲哚类总生物碱含量达50％～80％的蟾皮总碱，其中蟾蜍噻宁含量≥25％。

分析表明，在上述得到的提取物中，除吲哚类总生物碱外还含有华蟾酥毒基和脂蟾毒配基，总含量为0.06～0.08％。

吲哚类总生物碱的含量测定按照华蟾素注射液部颁标准(WS₃-B-3045)进行。以5-羟色胺为对照品，对二甲氨基苯甲醛为显色剂，用紫外分光光度法进行测定。

华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量按照中国药典2005年版一部蟾酥项下，以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为对照品，用高效液相色谱法进行测定。

为有效控制中药制剂中蟾蜍噻宁的含量，申请人建立了反相高效液相色谱法，使用C₈或C₁₈色谱柱为固定相，以乙腈-水体积比90∶10～10∶90，或甲醇-水体积比50∶50～10∶90，为流动相，并以磷酸二氢钠或磷酸二氢钾及磷酸调至pH 2～4，检测波长225nm或293nm，对照品为蟾蜍噻宁，测定蟾皮总碱及其制剂中蟾蜍噻宁的含量。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明蟾皮总碱采用85％甲醇或乙醇或丙酮为溶剂提取，经大孔吸附树脂初步分离后，采用中性或碱性氧化铝柱色谱分离，使吲哚类总生物碱含量达到50％～95％。其中蟾蜍噻宁含量20～50％，提高了蟾皮总碱及其制剂的质量标准。

2、本发明在使用反相高效液相色谱法测定了蟾皮总碱及其不同制剂中指标性有效成分蟾蜍噻宁的含量，为蟾皮总碱及其制剂的质量制定提供了可靠、实用的测定方法。

3、本发明可以满足肿瘤和乙肝患者对不同剂型的需求。

以下药理实验结果阐明其药效作用

1、抗乙型肝炎病毒实验研究

1日龄雄性麻鸭，体重45g±5g；鸭乙型肝炎病毒DHBV-DNA强阳性血清，采自上海麻鸭，-70℃保存。

取1日龄麻鸭，经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性血清，每只0.2ml。DHBV感染第13天，将雏鸭随机分成3组：对照组、华蟾素注射液组、蟾皮总碱组，每组10只。每日自麻鸭腿胫按2ml/kg体重静脉注射给药，每日1次，连续10天，阳性对照组给与等量生理盐水。以上各组分别在给药前(即感染第13天)、给药后第5天、给药后第10天、停药后第2天自鸭腿静脉采血，分离血清，-70℃保存备用。

取上述血清点于NC膜，按缺口翻译试剂盒说明书操作，用³²P标记DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标仪上测定D值(滤光片波长为490nm)，计算血清DHBV-DNA光密度。结果如下：

表1蟾皮总碱在鸭体内对DHBV-DNA的抑制作用(x±s)

与自身给药前比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01；与对照组相比：^ΔP＜0.05。

2、对小鼠移植性肿瘤S₁₈₀的生长抑制作用

选取接种S₁₈₀瘤细胞后7天的小鼠，脱颈处死，无菌抽取腹水，用生理盐水调细胞浓度至1×10⁷个/mL。以每只小鼠0.2mL接种于小鼠有腋下皮下，制备荷瘤小鼠模型。将荷瘤小鼠随机分成3组：对照组、华蟾素注射液组、蟾皮总碱组，每组8只。每日小鼠尾静脉注射给药一次，按0.2ml/只给药，每日1次，连续10天，阳性对照组给与等量生理盐水。于第11日处死小鼠，小心剥离瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。结果见表2。

表2蟾皮总碱对S₁₈₀荷瘤小鼠瘤重的影响(x±s)

与对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

四、附图说明

图1蟾蜍噻宁¹³C-NMR图谱。

图2蟾蜍噻宁¹H-NMR图谱。

图3蟾蜍噻宁对照品HPLC图谱。

图4蟾蜍总碱HPLC图谱。

五、具体实施方式

对于蟾皮总碱的制备，具体操作过程如下：

1、取干蟾皮，洗净，加6～7倍量85％甲醇或乙醇或丙酮浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加5～6倍量85％甲醇或乙醇或丙酮回流提取50分钟，放冷，过滤，合并滤液。

2、滤液减压浓缩至无溶剂味。加入相当于药材量1～3倍量水溶解，放置24小时，过滤。

3、滤液上大孔树吸附树脂柱，先用2～4倍柱体积水洗脱，再用3～5倍柱体积50％～60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液减压浓缩至60℃时比重1.10～1.25的浸膏。

4、步骤3所得浸膏加入10～30倍量中极性或碱性氧化铝(100～200目)，拌匀，60℃以下干燥，加入填充好的中性或碱性氧化铝(100～200目)柱上，用氯仿-甲醇(10∶1～1∶10)或氯仿-乙酸乙酯-甲醇(7∶3∶1～1∶3∶7)或乙酸乙酯-甲醇(15∶1～1∶10)洗脱，分段收集，分别得到前段洗脱液、中段洗脱液和后段洗脱液。将所述前段洗脱液和中段洗脱液合并浓缩后，在低于60℃条件下真空干燥，得吲哚类总生物碱含量达80％～95％的蟾皮提取物。将所述前段洗脱液、中段洗脱液和后段洗脱液合并浓缩后，在低于60℃条件下真空干燥，得吲哚类总生物碱含量达50％～80％的蟾皮总碱。

实施例1：

取干蟾皮1kg，洗净，加6倍量85％乙醇浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加5倍量85％乙醇回流提取50分钟，放冷过滤，合并滤液。滤液减压浓缩至无醇味，加入相当于药材2倍量水溶解，放置24小时，过滤。滤液加于HPD-400型大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积水洗脱，再用4倍柱体积50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩至60℃时比重1.15的浸膏。加入10倍量色谱用中性氧化铝，拌匀，60℃以下干燥，加于填充好的色谱用中性氧化铝柱上，用氯仿-甲醇(6∶1)洗脱收集8个柱体积，再用氯仿-甲醇(2∶1)洗脱，收集6个柱体积，氯仿-甲醇(1∶3)洗脱，收集5个柱体积，将氯仿-甲醇(6∶1)、(2∶1)洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱A。将氯仿-甲醇(6∶1)、(2∶1)、(1∶3)洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱B。

蟾皮总碱A收得率为0.12％。A中吲哚类总生物碱的含量为92.7％。其中蟾蜍噻宁含量为46.3％。蟾皮总碱B收得率为0.21％，B中吲哚类总生物碱的含量为71.3％，其中蟾蜍噻宁含量为35.5％。

实施例2：

取干蟾皮1kg，洗净，加7倍量85％甲醇浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加6倍量85％甲醇回流提取50分钟，放冷，过滤，合并滤液。滤液减压浓缩至无醇味，加入相当于药材1.5倍量水，溶解，放置24小时，过滤。滤液加于HPD-600型大孔吸附树脂柱，先用2.5倍柱体积水洗脱，再用3.5倍柱体积55％乙醇洗脱，收集55％乙醇洗脱液，减压浓缩至60℃时比重为1.20的浸膏，加入15倍量色谱用碱性氧化铝，拌匀，60℃以下干燥，加于填充好的色谱用碱性氧化铝柱上，用氯仿-乙酸乙酯-甲醇(3∶1∶1)洗脱，收集7个柱体积，再用氯仿-乙酸乙酯-甲醇(1∶0.5∶1.5)洗脱，收集5个柱体积，改用氯仿-乙酸乙酯-甲醇(0.5∶0.5∶3)洗脱，收集6个柱体积。将氯仿-乙酸乙酯-甲醇(3∶1∶1)、(1∶0.5∶1.5)洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱A。将氯仿-乙酸乙酯-甲醇(3∶1∶1)、(1∶0.5∶1.5)、(0.5∶0.5∶3)洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱B。

蟾皮总碱A收得率为0.11％，A中吲哚类总生物碱含量为95.1％，其中蟾蜍噻宁含量为37.8％。蟾皮总碱B收得率为0.23％，B中吲哚类总生物碱含量为66.5％，其中蟾蜍噻宁含量为26.7％。

实施例3：

取干蟾皮1kg，洗净，加6倍量85％丙酮浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷过滤，残渣加5倍量85％丙酮回流提取50分钟，放冷过滤，合并滤液。

滤液减压浓缩至无丙酮味，加入相当于药材2.5倍量水溶解，放置24小时，过滤。滤液加于DM-301大孔吸附树脂柱，先用2.5倍柱体积水洗脱，再用3倍柱体积60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至60℃时比重为1.25的浸膏。加入18倍量色谱用碱性氧化铝，拌匀，60℃以下干燥，加于填充好的色谱用碱性氧化铝柱上，用乙酸乙酯-甲醇(7∶1)洗脱，收集6个柱体积，改用乙酸乙酯-甲醇(1∶1)洗脱，收集5个柱体积。再用乙酸乙酯-甲醇(0.5∶2.5)洗脱，收集6个柱体积。将乙酸乙酯-甲醇(7∶1)、(1∶1)洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱A。将乙酸乙酯-甲醇(7∶1)、(1∶1)、(0.5∶2.5)洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱B。

蟾皮总碱A收得率为0.15％，A中吲哚类总生物碱含量为90.5％，其中蟾蜍噻宁含量为47.7％。蟾皮总碱B收得率为0.25％，B中吲哚类总生物碱含量为64.8％，其中蟾蜍噻宁含量为28.4％。

实施例4：蟾皮总碱注射液

组成：蟾皮总碱A 1.0～5.0g

氯化钠 9g

注射用水 1000ml

制备过程：取上述蟾皮总碱A及药用辅料，加新煮沸过的注射用水溶解，并稀释至规定体积，调节pH5.0～8.0，用3号垂熔玻璃漏斗过滤，灌封，每安瓿装2ml，灭菌，即得。

实施例5：蟾皮总碱输液

组成：蟾皮总碱A 1.0～5.0g

氯化钠 45g

注射用水 5000ml

制备过程：取上述蟾皮总碱A及药用辅料，加新煮沸过的注射用水溶解，并稀释至规定体积，调节pH5.0～8.0，用0.20～0.80μm微孔滤膜过滤，灌装，每瓶装100ml，灭菌，即得。

实施例6：蟾皮总碱冻干粉针

组成：蟾皮总碱A 1.0～5.0g

甘露醇 100～200g

泊络沙姆 2～8g

制备过程：取上述蟾皮总碱A及药用辅料，加新煮沸过的注射用水溶解，并稀释至2000ml，调节pH5.0～8.0，用0.20～0.80μm微孔滤膜过滤，灌装500个西林瓶中，冷冻干燥，即得。

实施例7：蟾皮总碱片

组成：蟾皮总碱 1.0～5.0g

糊精 90g

微晶纤维素 105g

低取代羟丙甲纤维素 15g

70％的乙醇溶液 15ml

硬脂酸镁 1g

制备过程：蟾皮总碱、糊精、硬脂酸镁、低取代羟丙甲纤维素分别粉碎过80目筛；将蟾皮总碱与糊精、2/3量的低取代羟丙甲纤维素及70％的乙醇溶液混合研磨，使均匀，制软材；再20目筛制颗粒，干燥，整粒后加入剩余的低取代羟丙甲纤维素，混匀，再加入硬脂酸镁混匀，压1000片；检验合格后包装。

实施例8：蟾皮总碱滴丸

组成：蟾皮总碱 1.0～5.0g

PEG4000 15～25g

PEG6000 15～25g

制备过程：将PEG4000、PEG6000加热，再将熔融蟾皮总碱加入其中，充分搅拌，使药物充分分散于介质中；将上述药液转移至滴丸机上，70℃～80℃密闭保温10～20分钟，用无水甲基硅油作冷却剂，10℃～20℃梯度冷却，用30～60滴/分速度进行滴制，即得成型丸粒。再收集滴丸，用无水石油醚洗涤2次，晾干，包装即可。

实施例9：蟾皮总碱软胶囊

组成：蟾皮总碱 1.0～5.0g

蜂腊 10g

食用植物油 150g

明胶 10g

甘油 3g

水 13g

制备过程：称取蟾皮总碱与经过加热灭菌、澄清的食用植物油及蜂腊熔融物混合，充分搅匀即得囊心物。取明胶加入适量水使其膨胀；另将甘油及余下的水置煮胶锅中加热至70℃～80℃，混合均匀，加入膨胀的明胶搅拌，熔化，保温1～2小时，静置，使泡沫上浮，出去上浮的泡沫，用洁净白布滤过，保温待用。将已制好的明胶液，置明胶液贮槽中控制温度在60℃左右，将蟾皮总碱放入药液贮槽内；液体石腊温度以10℃～25℃为宜，室温10℃～20℃，滴头温度30℃～60℃，开始滴丸。滴出的胶丸先均匀地摊于纱网上，在10℃以下低温吹风4小时以上，再用擦丸机擦去表面的石腊，然后再低温(10℃以下)吹风20小时以上，于40℃～50℃干燥约24小时。取出干燥的胶丸，灯检，除去废丸后，用95％乙醇洗涤，再在40℃～50℃以下吹干，经质量检查合格后，即可包装。

实施例10：蟾皮总碱胶囊

组成：蟾皮总碱 1.0～5.0g

淀粉 50g

糊精 50g

15％PVP乙醇溶液适量

制备过程：将淀粉、蟾皮总碱混匀，过80目筛，加入适量的70％乙醇，制软材，再用20目筛制颗粒，干燥，整粒，装胶囊，共制成1000粒，每粒含蟾皮总碱5～100mg即可。

实施例11：蟾皮总碱颗粒剂

组成：蟾皮总碱 1.0～5.0g

糊精 50～100g

糖粉 10g

50％乙醇(体积分数)适量

制备过程：将蟾皮总碱、糊精、糖粉分别过100目筛，按等体积递增混研法将蟾皮总碱与辅料混匀，再将酒石酸溶于50％乙醇(体积分数)中，一次加入上述混合物中，混匀，制软材，过16目尼龙筛，60℃以下干燥，整粒后用塑料袋包装，每袋2g，含蟾皮总碱50～500mg。

实施例12：蟾皮总碱口服液

组成：蟾皮总碱 1.0～5.0g

炼蜜 30g

山梨酸 5g

香精 1ml

水适量

制备过程：将蟾皮总碱溶于水中，加入炼蜜、山梨酸、香精混匀，制成1000ml，封装，即得。

以上实施例仅为了对本发明作进一步说明，而本发明范围不受所举实施例的局限。

Claims

1.一种蟾皮总碱的制备方法，以干蟾皮为原料，包括浸泡、提取、分离、纯化，其特征在于：将洗净的蟾皮先加6倍量85％乙醇浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加5倍量85％乙醇回流提取50分钟，放冷过滤，合并滤液；滤液减压浓缩至无醇味，加入相当于药材2倍量水溶解，放置24小时，过滤；滤液加于HPD-400型大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积水洗脱，再用4倍柱体积50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩至60℃时比重1.15的浸膏；加入10倍量色谱用中性氧化铝，拌匀，60℃以下干燥，加于填充好的色谱用中性氧化铝柱上，用氯仿-甲醇6∶1洗脱收集8个柱体积，再用氯仿-甲醇2∶1洗脱，收集6个柱体积，氯仿-甲醇1∶3洗脱，收集5个柱体积，将氯仿-甲醇6∶1、2∶1洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱A；将氯仿-甲醇6∶1、2∶1、1∶3洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱B。

2.一种蟾皮总碱的制备方法，以干蟾皮为原料，包括浸泡、提取、分离、纯化，其特征在于：将洗净的蟾皮先加7倍量85％甲醇浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加6倍量85％甲醇回流提取50分钟，放冷，过滤，合并滤液；滤液减压浓缩至无醇味，加入相当于药材1.5倍量水，溶解，放置24小时，过滤；滤液加于HPD-600型大孔吸附树脂柱，先用2.5倍柱体积水洗脱，再用3.5倍柱体积55％乙醇洗脱，收集55％乙醇洗脱液，减压浓缩至60℃时比重为1.20的浸膏，加入15倍量色谱用碱性氧化铝，拌匀，60℃以下干燥，加于填充好的色谱用碱性氧化铝柱上，用氯仿-乙酸乙酯-甲醇3∶1∶1洗脱，收集7个柱体积，再用氯仿-乙酸乙酯-甲醇1∶0.5∶1.5洗脱，收集5个柱体积，改用氯仿-乙酸乙酯-甲醇0.5∶0.5∶3洗脱，收集6个柱体积；将氯仿-乙酸乙酯-甲醇3∶1∶1、1∶0.5∶1.5洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱A；将氯仿-乙酸乙酯-甲醇3∶1∶1、1∶0.5∶1.5、0.5∶0.5∶3洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱B。

3.一种蟾皮总碱的制备方法，以干蟾皮为原料，包括浸泡、提取、分离、纯化，其特征在于：将洗净的蟾皮先加6倍量85％丙酮浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷过滤，残渣加5倍量85％丙酮回流提取50分钟，放冷过滤，合并滤液；滤液减压浓缩至无丙酮味，加入相当于药材2.5倍量水溶解，放置24小时，过滤；滤液加于DM-301大孔吸附树脂柱，先用2.5倍柱体积水洗脱，再用3倍柱体积60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至60℃时比重为1.25的浸膏；加入18倍量色谱用碱性氧化铝，拌匀，60℃以下干燥，加于填充好的色谱用碱性氧化铝柱上，用乙酸乙酯-甲醇7∶1洗脱，收集6个柱体积，改用乙酸乙酯-甲醇1∶1洗脱，收集5个柱体积；再用乙酸乙酯-甲醇0.5∶2.5洗脱，收集6个柱体积；将乙酸乙酯-甲醇7∶1、1∶1洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱A；将乙酸乙酯-甲醇7∶1、1∶1、0.5∶2.5洗脱液合并，浓缩，于60℃以下真空干燥，得蟾皮总碱B。