CN101385748A - 黄蜀葵花提取物、提取和分析方法以及提取物制剂和用途 - Google Patents

Abstract

一种黄蜀葵花提取物，其总黄酮含量以金丝桃苷计为50－75wt％；其中金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素－3′－葡萄糖苷含量依次为10.0－15.0wt％、7.0－12.0wt％和8.0－12.0wt％，且有总黄酮指纹图谱。该提取物由黄蜀葵花乙醇提取液的浓缩液通过HPD400或HPD700大孔吸附树脂柱层析得到粗提物，或由浓缩液用正丁醇萃取得到粗提物，并用醋酸乙酯－乙醇共沸点混合液或醋酸乙酯－甲醇共沸点混合液回流提取得到精提液，精提液减压脱溶、干燥后而制得。并构建了相应的含量和指纹图谱测定方法。该提取物制剂，是以提取物为活性成分和药用辅料加工制成的滴丸或片剂或胶囊剂或软胶囊剂。该提取物的用途是在制备治疗心脑缺血疾病药物中的应用。

Description

黄蜀葵花提取物、提取和分析方法以及提取物制剂和用途

一、技术领域

本发明涉及中草药中的活性成分及其提取和分析方法以及提取物的制剂和用途，具体地说是黄蜀葵花提取物、提取和分析方法以及提取物制剂和用途。

二、背景技术

黄蜀葵花为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵Abelmoschus Manihot(L.)Medic的干燥花，该药材收载于江苏省中药材标(1989年版)增补本。

关于黄蜀葵花化学成分，王先荣等人于1981年，在植物学报，23(3)：222-226(1981)报导了“黄蜀葵花的化学成分研究”，从黄蜀葵花中分离到槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷、槲皮素-3＇-葡萄糖苷、杨梅素、槲皮素等5种黄酮成分。王先荣等人又于2004年，在中国天然药物，2(2)：91-93(2004)报导了“黄蜀葵花黄酮成分的研究”.从黄蜀葵花总黄酮中分离到棉皮素-3＇-葡萄糖苷、异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素-3＇-葡萄糖苷等4种黄酮成分，其中棉皮素-3＇-葡萄糖苷为一新化合物。

药理研究表明，黄蜀葵花中黄酮类化合物是其主要生物活性成分。进一步的化学研究表明，黄蜀葵花黄酮类化合物(或谓总黄酮)中以金丝桃苷，异槲皮苷、槲皮素-3＇-葡萄糖苷、棉皮素-3＇-葡萄糖苷、杨梅素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-洋槐糖苷、棉皮素、杨梅素、槲皮素九种成分含量较多，该九种化合物有以下化学式：

        

         

金丝桃苷                   异槲皮苷                槲皮素-3＇-葡萄糖苷

           

棉皮素-3＇-葡萄糖苷   杨梅素-3-葡萄糖苷            槲皮素-3-洋槐糖苷

      

         

棉皮素                     杨梅素                  槲皮素。

不同方法提取得到的提取物中所含黄酮类化合物的种类及其含量均不相同，或者说含有不同的总黄酮，导致其药理、药性的差异也很大，这就意味着每一种提取方法得到的都是一种新的物质(组合物)。比如：

1、申请号200410035741.X公开了一种“治疗口腔溃疡、胃溃疡、烧烫伤、外伤感染的药物及制备方法”。该方法是“取黄蜀葵花20kg，用20倍量-14倍量60-90％乙醇水回流提取2次，每次1hr，合并提取液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.13-1.16(60℃)的浓缩液；加适量水稀释，通过大孔吸附树脂柱或通过聚酰胺柱，用醇水溶液梯度洗脱，水洗脱3个柱体积，10％及30％乙醇各洗脱3个柱体积，70％乙醇洗脱1个柱体积，洗脱液浓缩，干燥，粉碎后得总黄酮提取物，其总黄酮含量为5-95％(重量比)”。该技术方案的缺点是：其一，因六羟基黄酮杨梅素、棉皮素及其苷类成分在30％乙醇中不稳定，其二，没有具体明确所提供的有效部位由哪些黄酮成分组成及其含量。

2、申请号200610097615.6公开了一种“黄蜀葵花总黄酮提取物、其制备及其应用”。将提取分离后的滤液通过AB-8，DM301等弱极性和中极性大孔吸附树脂，或聚酰胺柱层析富集总黄酮，聚酰胺柱层析虽能得高纯度总黄酮，但因聚酰胺柱每次层析后均需要碱-酸再生，故，该法成本高，工时长，不适用于制备口服用二类原料药。

黄蜀葵花总黄酮及其制剂目前只见到用于治疗口腔溃疡的临床药理报道。

三、发明内容

本发明旨在提供一种黄蜀葵花总黄酮含量较高的且有其确定指纹图谱的黄蜀葵花提取物及其提取和分析方法。

本发明另一目的是将黄蜀葵花提取物作为原料药、加工成口服制剂。

本发明目的还在于通过黄蜀葵花提取物抗心脑缺血机制的研究以确认其在制备治疗心脑缺血性药物中的应用。

本发明所称的黄蜀葵花提取物中总黄酮指纹图谱就是指提取物中含有上述九种黄酮类化合物，此外还有若干未知成分。

本提取物的特征就是提取物中含有槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷，异槲皮苷、槲皮素-3＇-葡萄糖苷、棉皮素-3＇-葡萄糖苷、杨梅素-3-葡萄糖苷、棉皮素、杨梅素、槲皮素黄酮类化合物；提取物中总黄酮含量以金丝桃苷计为50％-75％(重量百分比，下同)其中，金丝桃苷含量为10.0-15.0％、异槲皮苷含量为7.0-12.0％、槲皮素-3＇-葡萄糖苷含量为8.0-12.0％。

本提取物的提取方法以黄蜀葵花为原料，包括粗提物的制备和精制，所述粗提物的制备是黄蜀葵花用至少5倍量(重量与体积比w/v，如10g黄蜀葵花加入至少50ml75％乙醇)浓度为75％乙醇溶液(体积百分比，下同)回流提取至少两次，分离得到乙醇提取液并合并，或者将乙醇提取液减压浓缩至1/5体积后分离得到浓缩液(I)，浓缩液(I)用HPD400或HPD700大孔吸附树脂层析柱制备粗提物，其方法是浓缩液(I)上柱后先用水洗脱5-8柱体积，次用10％乙醇洗脱1-2个柱体积，最后用65％乙醇或65％甲醇(体积百分比)洗脱至无AlCl₃反应，收集65％乙醇或65％甲醇洗脱液，经减压脱溶、干燥后得到粗提物；或者将乙醇提取液减压浓缩至浓缩液体积与生药重之比为0.5-1：1时分离得到浓缩液(II)，浓缩液(II)用水饱和的正丁醇溶液萃取至少5次，合并萃取液，经减压脱溶、干燥后得到粗提物。

所述的精制是对粗提进行精制。粗提物用醋酸乙酯-乙醇共沸点混合液或醋酸乙酯-甲醇共沸点混合液回流提取至少两次，分离得到精提液，合并精提液，经减压脱溶、干燥后得到黄蜀葵花提取物，该提取物中有确定的总黄酮指纹图谱，总黄酮的含量以金丝桃苷计为50-75％(重量百分比，下同)。

提取物中总黄酮指纹图谱采用高效液相色谱法进行测定：指纹图谱见图1。色谱分析条件为：

(1)色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mm x 4.6mm，5μm；(2)流动相采用线性梯度洗脱，其中A相为乙腈一甲醇(10:1)，B相为0.4％磷酸溶液.流动相梯度：

时间(min)         A(％)     B(％)      时间(min)     A(％)     B(％)

0-32              16        84         32-35         27        73

35-52             27        73         52-53         16        84

53-60             16        84

(3)检测波长为360nm：(4)柱温为27℃；(5)流速1.0ml/min。

提取物中总黄酮含量测定以金丝桃苷为对照品、采用AlCl₃络合比色法进行测定，总黄酮含量为50-75％。

提取物中三种黄酮成分：金丝桃苷、异槲皮苷以及槲皮素-3＇-葡萄糖苷含量测定均采用高效液相色谱法测定，色谱分析条件为：

色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mm x 6mm，5μm；(2)流动相：水-乙腈-磷酸(825:175:1)。(3)检测波长为365nm：(4)柱温为27℃；(5)流速1.0ml/min。

本发明所述的黄蜀葵花提取物制剂是指以提取物为活性成分的口服制剂，其特征是由提取物和药用辅料加工的滴丸或片剂或胶囊剂或软胶囊剂。

心脑缺血是心脑血管疾病，心脑缺血会导致心脑损伤，若不及时救治会留下后遗症。本发明所称的黄蜀葵花提取物的用途就是该提取物在制备治疗心脑缺血疾病药物中的应用。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明黄蜀葵花提取物由槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3＇-葡萄糖苷、棉皮素-3＇-葡萄糖苷、杨梅素-3-葡萄糖苷、棉皮素、杨梅素、槲皮素等黄酮类成分组成；并以总黄酮含量、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3＇-葡萄糖苷的含量对其进行确切的表征，以这一表征方式进行表征的黄酮类物质以及口服黄蜀葵花总黄酮提取物的药剂具有显著的治疗心脑缺血性疾病作用及其作用机理，均未见相关文献的报道。

2、本发明采用高效液相色谱法，可以对提取物中金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3＇-葡萄糖苷的黄酮成分进行明确定性和定量。

3、本发明口服黄蜀葵花总黄酮提取物的药剂治疗心脑缺血疾病有可靠的疗效。

4、本发明可以满足广大心脑缺血患者对不同剂型的要求。

四、附图说明

图1是黄蜀葵花提取物液相色谱指纹图谱。图中：

3、槲皮素-3-洋槐糖苷、5.金丝桃苷、6.异槲皮苷、7.杨梅素3-葡萄糖苷、9.棉皮素、10.杨梅素、11.棉皮素-3＇-葡萄糖苷、12.槲皮素-3＇-葡萄糖苷、13.槲皮素。1、2、4、8为未知物。

五、具体实施方式

下面通过实施例对黄蜀葵花提取物提取方法，提取物制剂的制备方法及药理实验进一步详述。

(一)、提取物的制备

实施例1：

取黄蜀葵花生药粗粉1kg，加10000ml 75％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至1/5体积，静置12小时过滤；滤液通过HPD400大孔吸附树脂柱层析，首先用水冲洗5—8个柱体积，用10％乙醇洗脱1-2个柱体积，再用65％乙醇洗脱至无AlCl₃反应，收集65％乙醇洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得黄蜀葵花提取物粗品；取提取物粗品，用10倍量(W/V)共沸点醋酸乙酯—乙醇回流提取3次，每次1-2小时，回收溶剂，80℃减压干燥得到黄蜀葵花提取物产品。按重量百分比提取物收得率为3.5％，提取物中按重量百分比总黄酮(以金丝桃苷计)含量为70.0％，其中以下黄酮成分含量为:金丝桃苷14.0％、异槲皮苷11.5％、槲皮素-3＇-葡萄糖苷10.0％、其它黄酮类成分余量。

实施例2：

取黄蜀葵花生药粗粉1kg，加10000ml75％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至1/5体积，静置12小时过滤；滤液通过HPD700大孔吸附树脂柱层析，首先用水冲洗5—8个柱体积，用10％乙醇洗脱1-2个柱体积，再用65％乙醇或洗脱至无AlCl₃反应，收集65％乙醇或洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得黄蜀葵花提取物粗品；取提取物粗品，用10倍量(W/V)共沸点醋酸乙酯—甲醇回流提取3次，每次1-2小时，回收溶剂，60℃减压干燥得到黄蜀葵花提取物产品。按重量百分比提取物收得率为3.7％，提取物中按重量百分比总黄酮(以金丝桃苷计)含量为65.0％，其中以下黄酮成分含量为:金丝桃苷13.2％、异槲皮苷10.5％、槲皮素-3＇-葡萄糖苷9.5％、其它黄酮类成分余量。

实施例3：

取黄蜀葵花生药粗粉1kg，加8000ml60％乙醇加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，放冷，过滤，滤液，将该滤液在低于60℃条件下减压浓缩至浓缩液体积与生药重之比为0.5-1：1，用1:1(V/V)水饱和的正丁醇卒取8-10次，合并正丁醇卒取液，用无水硫酸钠干燥、过滤，在低于80℃条件下减压浓缩，真空干燥得黄蜀葵花提取物粗品；取提取物粗品，用10倍量(W/V)共沸点醋酸乙酯—乙醇回流提取3次，每次1-2小时，回收溶剂，80℃减压干燥得黄蜀葵花提取物产品。按重量百分比提取物收得率为3.2％，其总黄酮(以金丝桃苷计)含量为56.0％，其中以下黄酮成分含量为:金丝桃苷11.5％、异槲皮苷10.5％、槲皮素-3＇-葡萄糖苷9.0％，其它黄酮类成分余量。

(二)、提取物制剂的制备

实施例4：黄蜀葵花总黄酮片

组分                     量

黄蜀葵花提取物           5-100g

糊精                     90g

微晶纤维素               105g

低取代羟丙甲纤维素       15g

70％的乙醇溶液           15ml

硬脂酸镁                 1g

制备过程：黄蜀葵花提取物、糊精、硬脂酸镁、低取代羟丙甲纤维素分别粉碎过80目筛；将黄蜀葵花与糊精、2/3量的低取代羟丙甲纤维素及70％的乙醇溶液混合研磨，使均匀，制软材；再20目筛制颗粒，干燥，整粒后加入剩余的低取代羟丙甲纤维素，混匀，再加入硬脂酸镁混匀，压1000片；检验合格后包装。

实施例5：黄蜀葵花总黄酮滴丸

组分                        量

黄蜀葵花提取物              1-50g

PEG4000                     15g

PEG6000                     22g

制备过程：将聚乙二醇4000、聚乙二醇6000加热，再将黄蜀葵花提取物加入其中，充分搅拌，使药物充分分散于基质中；将上述药液转移至滴丸机上，70℃～80℃密闭保温10～20分钟，用无水甲基硅油作冷却剂，10℃～20℃梯度冷却，用30～60滴/分速度进行滴制，即得成型丸粒。再收集滴丸，用无水石油醚洗涤2次，凉干，包装即可。

实施例6：黄蜀葵花总黄酮软胶囊

组分                         量

黄蜀葵花提取物               5—100g

蜂蜡                         10g

食用植物油                   150g

明胶                         13g

制备过程：称取黄蜀葵花提取物与经过加热灭菌、澄清的食用植物油及蜂蜡熔融物混合，充分搅匀即得囊心物。取明胶加入适量水使其膨胀；另将甘油及余下的水置煮胶锅中加热至70℃～80℃，混合均匀，加入膨胀的明胶搅拌，熔化，保温1-2小时，静置，使泡沫上浮，除去上浮的泡沫，以洁净白布滤过，保温待用。将已制好的明胶液，置明胶液贮槽中控制温度在60℃左右，将黄蜀葵花提取物放入药液贮槽内；液状石蜡温度以10-25℃为宜，室温10-20℃，滴头温度30-60℃，开始滴丸。滴出的胶丸先均匀地摊于纱网上，在10℃以下低温吹风4小时以上，再用擦丸机擦去表面的石蜡，然后再低温(10℃以下)吹风20小时以上，于40-50℃干燥约24小时。取出干燥的胶丸，灯检，除去废丸后，用95％乙醇洗涤，再在40-50℃以下吹干，经质量检查合格后，即可包装。

实施例7：黄蜀葵花总黄酮胶囊剂

组分                量

黄蜀葵花提取物      5—100g

淀粉                125g

70％乙醇                  适量

制备过程：将淀粉、黄蜀葵花提取物混匀，过80目筛，加入适量的70％乙醇，制软材，再用20目筛制颗粒，干燥，整粒，装胶囊，共制成1000粒，每粒含黄蜀葵花总黄酮提取物5—100mg，即可。

(三)、提取物中总黄酮含量及其指纹图谱的分析测定

实施例8：黄蜀葵花提取物、制剂中总黄酮含量测定，主要组成成分含量测定方法为：

(1)、黄蜀葵花提取物的总黄酮含量测定以金丝桃苷为对照品采用AlCl₃络合比色法进行测定，本品含总黄酮(以金丝桃苷计)为50-75％。

(2)、黄蜀葵花提取物的主要组成成分:金丝桃苷、异槲皮苷、以及槲皮素-3＇-葡萄糖苷的含量测定均采用高效液相色谱法测定，各成分含量见实施例1-3。色谱分析条件为：

色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mm x 6mm，5μm；(2)流动相：水-乙腈-磷酸(825:175:1)。(3)检测波长为365nm：(4)柱温为27℃；(5)流速1.0ml/min。

实施例9：黄蜀葵花提取物中总黄酮指纹图谱测定方法：

色谱分析条件为：

(1)色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mm x 4.6mm，5μm；

(2)流动相采用线性梯度洗脱，其中A相为乙腈一甲醇(10:1)，B相为0.4％磷酸溶液.

流动相梯度；

时间(min)          A(％)     B(％)     时间(min)      A(％)     B(％)

0-32               16        84        32-35          27        73

35-52              27        73        52-53          16        84

53-60              16        84

(3)检测波长为360nm：(4)柱温为27℃；(5)流速1.0ml/min。

(四)、下面用药理实验结果阐明其药效作用

一、黄蜀葵花总黄酮(TFA)对缺血性心肌损伤有保护作用

1 TFA对犬心脏血流动力学及心肌耗氧量的影响

1.1 对血压、心率及心电图的影响

结果如表1所示，与给药前及NS对照组比较，TFA各剂量组对麻醉犬血压、心率无明显影响(P>0.05)。

表1  黄蜀葵花总黄酮对犬血压(mmHg)、心率(beat/min)的影响(x±s；n＝6)

与用药前及NS对照组比较，P>0.05。

1.2 对犬左室内压、左室舒张末期压的影响

结果如表2所示，与NS对照组比较，TFA大、中剂量组在给药后60min，120min时能降低犬左室内压；与用药前及NS对照组比较，TFA 60，30mg·kg^-1 2个剂量组在给药后60min，120min时能降低犬左室舒张末期压，且疗效优于阳性对照药。

表2  黄蜀葵花总黄酮对左室内压(mmHg)、左室舒张末期压(mmHg)的影响(x±s；n＝6)

与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与用药前比较，^△P<0.05，^△△P<0.01。

1.3 对犬冠脉流量、心输出量的影响

结果如表3所示，TFA60，30，15mg·kg^-1 3个剂量组给药后30min时均可增加冠脉流量及心输出量，并一直持续至120min，与用药前及NS对照组比较均有显著性差异。

表3  黄蜀葵花总黄酮对犬冠脉流量(ml/min)、心输出量(L/min)的影响(x±s；n＝6)

与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与用药前比较，^△P<0.05，^△△P<0.01。

1.4 犬冠脉阻力、总外周阻力的影响

结果如表4所示，TFA 60，30mg·kg^-1 2个剂量组给药后30min时即可降低冠脉阻力及总外周阻力，并一直持续至120min，产生与阳性药相似的效应，与NS对照组比较差异显著。

表4 黄蜀葵花总黄酮对犬冠脉阻力(mmHg/ml/100g/min)、总外周阻力(达因.s.cm³)的影响(x±s；n＝6)

与NS对照组比较：^*P<0.05；与用药前比较，^△P<0.05。

1.5 对犬心搏出量、心搏指数的影响

结果如表5所示，TFA 60，30mg·kg^-1 2个剂量组在给药后30~120min内能增加心搏出量并提高心搏指数，与NS对照组比较差异显著。

表5 黄蜀葵花总黄酮对犬心搏出量(ml/beat)、心搏指数(L/beat/m²)的影响(x±s；n＝6)

与NS对照组比较：^*P<0.05；与用药前比较，^△P<0.05。

1.6 对犬心脏指数、左室作功的影响

结果如表6所示，与NS对照组比较，TFA 60，30mg·kg^-1 2个剂量组给药后30~120min内能提高心脏指数(P<0.05)，但对左室作功无明显影响(P>0.05)。

表6 黄蜀葵花总黄酮对犬心脏指数(L/min/m²)、左室作功(kg.m/min/m²)的影响(x±s；n＝6)

与NS对照组比较：^*P<0.05。

1.7 对犬每分钟百克心肌血流量、心肌耗氧指数的影响

结果如表7所示，与用药前及NS对照组比较，TFA 60，30mg·kg^-1 2个剂量组在给药后30~120min内能增加每100克心肌血流量(P<0.05)，但对心肌耗氧指数无明显影响(P>0.05)。

表7 黄蜀葵花总黄酮对犬每分钟百克心肌血流量(ml/100g/min)、心肌耗氧指数的影响(x±s；n＝6)

与对照组比较：^*P<0.05；与用药前比较，^△P<0.05。

1.8 对犬心肌耗氧量、心肌氧利用率的影响：

结果如表8所示，与阳性药一样，TFA各剂量组对麻醉犬心肌耗氧量、心肌氧利用率无明显影响(P>0.05)。

表8 黄蜀葵花总黄酮对犬心肌耗氧量(ml/100g/min)、心肌氧利用率(％)的影响(x±s；n＝6)

与对照组比较无显著性差异。

2 TFA对大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用

2.1 对急性心肌缺血心肌梗死范围的影响

用NBT染色法显示心肌梗死范围的大小，结果如表9所示，模型组大鼠冠脉结扎30min，其心肌梗死范围可达58.99％±8.94％，而TFA 3个剂量组均不同程度地减小了心肌的梗死范围，均优于EGB阳性药对照组，其中TFA100mg·kg^-1组大鼠其心肌梗死范围仅为41.69％±9.96％，较模型组显著降低，抑制率达29％。提示，TFA具有减小心肌梗死范围的作用。

表9 TFA对急性心肌缺血大鼠心肌梗死面积的影响(x±s，n＝10)

与Sham组比较，^△△P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

2.2 对血浆中LDH及CK活力的影响

结果如表10所示，模型组大鼠血浆中LDH及CK的活力均显著升高，表明冠脉结扎损伤了大鼠的心肌细胞膜，LDH及CK从细胞中外漏，使其在细胞中活性降低，而在血浆中活性明显升高。TFA100，50，25mg·kg^-1 3个剂量组均可显著抑制LDH活力的异常增高，同时，TFA100mg·kg^-1剂量组还可抑制CK活力的异常升高。

表10 TFA对急性心肌缺血大鼠血浆中LDH含量及CK活力的影响(x±s，n＝10)

与Sham组比较，^△△P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

3 TFA对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

3.1 对心肌组织匀浆中CPK、LDH含量的影响

如表11所示，缺血再灌后，大鼠心肌组织匀浆中LDH、CPK的含量均明显低于正常非缺血组，分别为正常非缺血组的84.22％和59.40％。而TFA(100，50，25mg·L^-1)3个剂量组与缺血组相比，均使LDH的漏出显著减少。对CPK的漏出，TFA100mg·L^-1，50mg·L^-1 2个剂量也使其显著性的降低(P<0.05)。

表11 TFA对缺血再灌注离体大鼠心肌组织匀浆中LDH及CPK活力的影响(X±S，n＝8)

组别        剂量(·L^-1)            LDH(U/g·prot)           CPK(U/L)

非缺血组    -                      1639.8±206.4            16057.5±2359.4

IR组        -                      1381.0±170.3^△          9537.5±2907.3^△△

TFA         100mg                  1698.7±132.6^*           13385.0±2746.7^*

            50mg                   1612.4±169.4^*           14560.0±4229.2^*

            25mg                   1714.5±69.7^**           11982.5±2487.3

Ver         6.7μmol                1868.9±184.9^**          15065.0±2843.7^**

与非缺血组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与IR组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

3.2 对心肌组织匀浆中MDA含量及SOD活性的影响

结果如表12所示，缺血再灌后，大鼠心肌组织匀浆中MDA生成量明显高于正常非缺血组，达正常非缺血组的1.47倍，TFA(100，50，25mg·L^-1)3个剂量组与缺血组相比，均使MDA生成量明显减少，接近于正常非缺血组。与之相反，缺血组SOD活力经缺血再灌后明显低于正常非缺血组，是其81.76％，而采用TFA及Ver灌流，SOD活力均得到明显提高(P<0.05，P<0.01)，最高可达正常非缺血组的99.92％。

表12 TFA对缺血再灌注离体大鼠心肌组织匀浆中SOD活力、MDA含量的影响(X±S，n＝8)

组别           剂量(·L^-1)               SOD(NU/mg·prot)      MDA(nmol/mg·prot)

非缺血组       -                         35.8±4.1             8.4±2.6

IR组           -                         29.3±4.1^△△         12.4±3.0^△△

TFA            100mg                     34.4±3.4^*            4.5±1.5^**

               50mg                      34.0±3.7^*            7.7±4.1^*

               25mg                      35.8±1.8^**           4.6±3.2^**

Ver            6.7μmol                   35.2±3.4^**           7.6±4.6^*

与非缺血组比较，^△△P<0.01；与IR组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

3.3 对心肌组织匀浆中NO含量、NOS活力的影响

结果如表13所示，缺血组大鼠心肌组织匀浆中NO、NOS均低于正常非缺血组。与缺血组相比，TFA 100mg·L^-1与Ver可显著性地增加NO的生成量，TFA(100mg·L^-1、25mg·L^-1)和Ver还同时使NOS活力得到显著性的提高。

表13 TFA对缺血再灌注离体大鼠心肌组织匀浆中NOS活力、NO含量的影响(X±S，n＝8)

组别           剂量(·L^-1)            NO(μmol/g·prot)          NOS(U/g·prot)

非缺血组       -                      1.016±0.339             395.876±261.997

IR组           -                      0.751±0.412             336.385±241.652

TFA            100mg                  1.363±0.690^*            923.481±140.465^**

               50mg                   0.644±0.324             443.476±254.041

               25mg                   1.214±0.794             659.432±345.595^*

Ver            6.7μmol                1.526±0.373^**           694.229±351.887^*

与IR组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

4 TFA对缺氧缺糖损伤的体外培养大鼠乳鼠心肌细胞的保护作用

结果如表14所示，TFA对体外缺氧缺糖所造成的心肌细胞损伤有显著保护作用，在6h及9h两个不同的时间段均可显著降低培养液中LDH的活力。

表14 TFA对体外培养的乳鼠心肌细胞培养液中LDH活力的影响(X±S，n＝8)

                                                        LDH(U/L)

组别              剂量(·L^-1)

                                          6h                        9h

对照组            -                       37.2±10.4                43.8±8.0

模型组            -                       112.5±17.3^△△           137.6±28.4^△△

TFA               100mg                   52.1±7.7^**               64.7±9.0^**

                  30mg                    65.8±9.1^**               85.5±11.3^**

                  10mg                    76.6±11.8^**              109.8±20.4^*

Nif               5μmol                   60.8±10.5^**              85.7±8.9^**

与对照组比较，^△△P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

5 TFA对胶原致血小板聚集率的影响

结果如表15所示，与0.10mg.ml^-1 EGB一样，在0.025～0.10mg.ml^-1浓度范围内，TFA可明显抑制加入Coll(100mg·ml^-1)后2min和5min时的血小板聚集反应，最大抑制率均达到78％。

表15 TFA对胶原致血小板聚集率的影响(x±s，n＝8)

与对照组比较，^**P<0.01

6 TFA对血栓形成的影响

结果如表16所示，大鼠颈总动脉-静脉环路可致血栓形成。与100mg.kg^-1 EGB结果相似，100，50，25mg·kg^-1 TFA可明显降低血栓的湿重；100，50mg.kg^-1 TFA有降低血栓干重的趋势，但差异尚无统计学意义。

表16 TFA对大鼠颈总动脉-静脉环路致血栓形成的影响(x±s)

与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

由于大剂量组样本数较少，经补充实验，结果如下表。

从下表中可以看出，TFA 100mg.kg^-1组除可显著降低血栓的湿重，尚可明显降低血栓的干重，与NS组比较，差异显著。

TFA对大鼠颈总动脉-静脉环路致血栓形成的影响(x±s，＝10)

与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

讨论与结论

1.犬血流动力学实验是研究抗实验性心肌缺血缺氧药物必不可少的实验内容，其各项指标的测定客观、直接，是反映药物对心血管机能影响的重要手段。本研究通过测定麻醉状态下犬的血流动力学各项指标，发现TFA 60，30mg·kg^-1，能增加犬冠状动脉和主动脉的血流量、增加每分钟100克心肌血流量及心搏出量；提高心搏指数及心脏指数；降低左室内压、左室舒张末期压、总外周血管阻力和冠脉阻力。

2.在冠脉结扎致大鼠急性心肌缺血损伤模型上，TFA 100，50，25mg.kg^-1可显著减小时心肌的梗死面积，同时显著抑制LDH从受损心肌细胞中漏出；在离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型上，TFA 0.100，0.050，0.025mg·ml^-1抑制心肌组织中MDA产生，提高SOD活力，减少LDH及CPK的漏出，TFA 100mg·L^-1还可提高NOS活力，促进NO生成；在缺氧缺糖致体外培养大鼠乳鼠心肌细胞损伤模型上，TFA 100，30，10mg·L^-1可显著降低缺氧缺糖6h及9h时培养液中LDH的活力，减轻缺氧缺糖所致损伤，提示TFA对心肌缺血损伤有良好的保护作用。

3.与EGB一样，TFA在0.100～0.025mg·ml^-1范围内，能显著抑制Coll诱发的体外血小板聚集反应，表明TFA有明显的抗血小板聚集作用。

4.在大鼠颈总动脉-静脉旁路血栓形成模型上，TFA100，50，25mg.kg^-1可明显降低血栓的湿重。由于在第一次实验进行过程中，部分实验标本在烘烤过程中因操作不慎被污染而被剔除，以至各组动物数不一致，后经补充实验，发现TFA 100mg.kg^-1组除可显著降低血栓的湿重，尚可明显降低血栓的干重，与NS组比较，抑制率达40％和45％，提示TFA可明显抑制血栓的形成。

综上所述，TFA对缺血性心肌损伤有良好的保护作用，其作用可能与增加冠脉和心肌的血流量、降低血管射血阻力、抑制血小板聚集和血栓形成等有关。

二.黄蜀葵花总黄酮(TFA)对缺血性脑损伤有保护作用

1.TFA对脑缺血损伤的影响

1.1 TFA对小鼠断头后张口喘气时间的影响

结果如表1所示，20、40、80mg.kg^-1 TFA可明显延长小鼠断头后张口喘气时间，并呈一定的量效关系。

表1 TFA对小鼠断头后张口喘气时间的影响(x±s)

与对照比较，^*P<0.05。

1.2 TFA对夹闭气管致小鼠ECG时间的影响

结果如表2所示，与60mg.kg^-1 EGB一样，在20—80mg.kg^-范围内，TFA可明显延长夹闭气管致小鼠ECG持续时间，并呈一定的量效关系。

表2 TFA对夹闭气管致小鼠ECG时间的影响(x±s)

与对照组比较，^*P<0.05。

1.3 TFA对MCAO致大鼠脑缺血损伤的影响

1.3.1 TFA对脑梗塞组织重量的的影响

结果如表3所示，大鼠MCAO后有明显的脑梗塞发生，与EGB一样，TFA可显著降低脑梗塞组织重量百分比，在25～100mg.kg^-1范围内呈一定的量效关系。

表3 TFA对MCAO致大鼠脑梗塞组织重量的影响(x±s)

与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

1.3.2 TFA对MCAO大鼠脑组织中LDH活性和NO含量的的影响

结果如表4所示，与EGB一样，100mg.kg^-1 TFA可明显抑制MCAO大鼠脑组织中LDH活性的降低，25、50mg.kg^-1 TFA对MCAO大鼠脑组织中LDH活性的降低也有抑制趋势，但差异无统计学意义；25、50、100mg.kg^-1 TFA还能显著抑制MCAO大鼠脑组织中NO含量的降低。

表4 TFA对MCAO致大鼠脑组织中LDH活性和NO含量的影响(x±s)

与对照比较，^**P<0.01。

1.4 TFA对不完全性脑缺血的影响

1.4.1 对脑含水量和血管通透性的影响

结果如表5所示，与100mg.kg^-1 EGB一样，50、100mg.kg^-1 TFA可抑制大鼠双侧CCA结扎致脑水肿的发生；TFA和EGB对CCA结扎致脑大鼠组织血管通透性(伊文思蓝OD值)的升高虽有降低趋势，但差异无统计学意义。

表5 TFA对双侧颈总动脉结扎致大鼠脑缺血的影响(x±s)

与对照比较，^*P<0.05，^**P<0.01；括号内数字为样本数。

2.TFA对狗脑血流量等指标的影响

2.1TFA对狗颈内动脉血流量的影响

结果如表7所示，与50mg.kg^-1 EGB一样，用药45min时，25、50mg.kg^-1 TFA可明显增加狗颈内动脉血流量(与对照组比较)，60mg.kg^-1 TFA虽有增加的趋势，但差异无统计学意义。

表7 TFA对狗颈内动脉血流量(ml/min)的影响(x±s，n＝6)

与用药前比较，^*P<0.05，与对照组比较，^△P<0.05。

2.2 TFA对狗脑血管外周阻力的影响

结果如表8所示，用药45min时，与50mg.kg^-1 EGB一样，30mg.kg^-1 TFA可明显降低狗脑血管外周阻力(与对照组及用药前比较)，且其作用可持续到90min时(与对照组比较)，15、60mg.kg^-1 TFA也有增加的趋势，但差异无统计学意义。

表8 TFA对狗脑血管外周阻力(mmHg/ml/min)的影响(x±s，n＝6)

与用药前比较，^△P<0.05，与对照组比较，^*P<0.05。

2.3 TFA对狗动脉血压、ECG和心率的影响

与对照组及用药前比较，15、30、60mg.kg^-1 TFA对狗平均动脉血压和心率均无明显的影响；除15mg.kg^-1 TFA组的ST段在用药前与对照组比较有明显的抬高外，各组ECG的其它指标均未见明显的变化(表9、表10)。

3.TFA对胶原致血小板聚集率的影响

结果如表11所示，与0.10mg.ml^-1 EGB一样，在0.025—0.10mg.ml^-1浓度范围内，TFA可明显抑制加入胶原液(100mg.ml^-1)后2min和5min时诱导的血小板聚集反应。

表9 TFA对狗动脉平均血压的影响(x±s，n＝6)

与用药前比较，P>0.05，与对照组比较，P>0.05。

表10 TFA对狗心率ECG和的影响(x±s，n＝6)

与对照组比较，^**P<0.01。

4.TFA对血栓形成的影响

结果如表12所示，大鼠颈总动脉-静脉环路可致血栓的形成，与100mg.kg^-1 EGB一样，25、50、100mg.kg^-1 TFA可明显降低血栓的湿重；50、100mg.kg^-1 TFA有降低血栓的干重的趋势，但差异无统计学意义。

表11 TFA对胶原致血小板聚集率的影响(x±s，n＝8)

与对照组比较，^**P<0.01。

表12 TFA对大鼠颈总动脉-静脉环路致血栓形成的影响(x±s)

与对照比较，^*P<0.05，^*P<0.01。

讨论与结论

1.小鼠断头后张口喘气模型是一筛选研究抗脑缺血、缺氧药物较好的实验方法，其特点为重复性好、快速简便。在该模型上，本研究发现20、40、80mg.kg^-1 TFA可明显延长小鼠断头后张口喘气时间；大鼠MCAO是一常用的研究脑缺血损伤的动物模型，与人脑梗塞损伤较为接近。本研究在该模型上发现，与100mg.kg^-1 EGB一样，在25—100mg.kg^-1范围内，TFA能显著减轻脑组织梗塞重量，并呈一定的量效关系，100mg.kg^-1 TFA可显著抑制缺血脑组织中LDH活性的下降，25、50、100mg.kg^-1 TFA还能显著抑制MCAO大鼠脑组织中NO含量的降低；在双侧颈总动脉结扎致大鼠不完全性脑缺血模型上，50、100mg.kg^-1 TFA与50mg.kg^-1 EGB一样可显著抑制脑水肿的发生，并显著地改善缺血致脑组织的病理形态学的变化。这些结果表明TFA对脑缺血、缺氧性损伤有保护作用，其作用可能与提高脑组织中NO含量有关；另外20、40、80mg.kg^-1 TFA可明显延长夹闭气管致小鼠ECG的持续时间，此结果也提示着TFA对缺血、缺氧性损伤有保护作用。

2.通过电磁流量计等方法发现15、30mg.kg^-1 TFA能显著增加给药45min时狗颈内动脉血流量；30mg.kg^-1 TFA可明显降低狗脑血管外周阻力，其作用可持续到90min时；15、30、60mg.kg^-1 TFA对狗平均动脉血压和心率均无明显的影响，实验中仅见15mg.kg^-1 TFA组的ST段在用药前时与对照组比较有明显的抬高，但由于系发生在用药前，并且用药后45和90min也恢复正常，推测可能是麻醉引起的暂时性神经反射所致，与药物本身无关。结果表明TFA在不明显影响全身动脉血压和心脏功能的情况下可显著增加脑血流量和降低狗脑血管外周阻力，其作用有一定的选择性。

3.与EGB一样，TFA在0.025—0.100mg.ml^-1范围内，能显著抑制Coll诱发的家兔血小板聚集反应，表明TFA有明显的抗血小板聚集作用。

4.在大鼠颈总动脉-静脉旁路血栓形成模型上，25、50、100mg.kg^-1 TFA可明显降低血栓的湿重，提示TFA对血栓形成有抑制作用。

综上所述，与EGB一样，TFA对缺血性脑损伤有保护作用，其作用可能与增加脑血流量及降低脑血管外周阻力、抗血小板聚集和抑制血栓形成有关。

Claims (6)

1、一种黄蜀葵花提取物，是自黄蜀葵花中提取的主要含黄酮类活性成分的提取物，其特征在于：提取物中含有槲皮素-3-洋槐糖苷、金丝桃苷，异槲皮苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、杨梅素-3-葡萄糖苷、棉皮素、杨梅素、槲皮素黄酮类化合物；提取物中总黄酮含量以金丝桃苷计为50-75wt％；其中金丝桃苷含量为10.0-15.0wt％，异槲皮苷含量为7.0-12.0wt％、槲皮素-3′-葡萄糖苷含量为8.0-12.0wt％。

2、由权利要求1所述的黄蜀葵花提取物的提取方法包括粗提取物的制备和精制，所述的粗提取物的制备是黄蜀葵花用至少5倍量(w/v)浓度为75％乙醇溶液回流提取至少两次，得到乙醇提取液，将乙醇提取液减压浓缩至1/5体积后分离得到浓缩液(I)，浓缩液(I)上HPD400或HPD700大孔吸附树脂层析柱，先水洗脱5-8柱体积，次用10％乙醇洗脱1-2柱体积，最后用65％乙醇或65％甲醇洗脱至无AlCl₃反应，收集65％乙醇或65％甲醇洗脱液，减压、脱溶、干燥后得到粗提物；粗提物用醋酸乙酯-乙醇共沸点混合液或醋酸乙酯-甲醇共沸点混合液回流提取至少两次，得到精提液，精提液减压脱溶、干燥后得到黄蜀葵花提取物。

3、根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：乙醇提取液减压浓缩至浓缩液体积与生药之比为0.5-1：1时分离得到浓缩液(II)，浓缩液(II)用水饱和的正丁醇溶液萃取至少5次，得到萃取液，萃取液减压脱溶、干燥后得到粗提物。

4、由权利要求1所述的黄蜀葵花提取物的分析方法，是指提取物中总黄酮指纹图谱分析方法，其特征在于：采用液相色谱及以下条件测定指纹图谱

(1)色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mm x 4.6mm，5μm；(2)流动相采用线性梯度洗脱，其中A相为乙腈一甲醇(10:1)，B相为0.4％磷酸溶液.流动相梯度；

时间(min)    A(％)    B(％)       时间(min)      A(％)        B(％)

0-32         16       84          32-35          27           73

35-52        27       73          52-53          16           84

53-60        16       84

(3)检测波长为360nm：(4)柱温为27℃；(5)流速1.0ml/min。

5、由权利要求1所述的黄蜀葵花提取物制剂，是以提取物为活性成分的口服制剂，其特征在于：由提取物和药用辅料加工的滴丸或片剂或胶囊剂或软胶囊剂。

6、由权利要求1所述的黄蜀葵花提取物的用途，其特征在于：该提取物在制备治疗心脑缺血疾病药物中的应用。

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