CN115671122A - 棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷在制备降嘌呤药物中的应用 - Google Patents
棉皮素-8-o-葡萄糖醛酸苷在制备降嘌呤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及棉皮素‑8‑O‑葡萄糖醛酸苷在制备降嘌呤药物中的应用，属于医药技术领域。本发明提供了棉皮素‑8‑O‑葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素‑3’‑O‑葡萄糖苷或含有棉皮素‑8‑O‑葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素‑3’‑O‑葡萄糖苷中的至少一种的组合物在制备降嘌呤药物中的应用，研究发现棉皮素‑8‑O‑葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素‑3’‑O‑葡萄糖苷和黄蜀葵提取物均可有效提高高嘌呤血症造模小鼠对嘌呤类物质的代谢能力，说明棉皮素‑8‑O‑葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素‑3’‑O‑葡萄糖苷和黄蜀葵提取物均可有效降嘌呤，具有预防和/或治疗高嘌呤血症的作用。
Description
技术领域
本发明涉及棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷在制备降嘌呤药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
统计数据显示，2000～2014年间我国高尿酸血症和痛风的发病率分别为13.3％和1.1％。虽然患病人群数量庞大，但是高尿酸血症和痛风患者可以选择的药物仍然很少。目前，最为常见的用于治疗高尿酸血症和痛风的药物为别嘌醇和非布司他等XOD抑制剂。
其中，别嘌醇自1963年用于临床以来，一直为治疗慢性痛风的首选药物。别嘌醇及其代谢产物氧嘌呤醇均可抑制黄嘌呤氧化酶，有效减少尿酸生成，降低血中及尿中的尿酸含量到溶解度以下，从而防止尿酸形成结晶沉积在关节及其他组织内。该药也有助于痛风结节及尿酸结晶的重新溶解，是2006年欧洲抗风湿联盟推荐的降尿酸药物。但是，由于别嘌醇是嘌呤类似物，不可避免的会影响嘌呤或嘧啶代谢中的其他酶，从而影响人体其他器官的代谢，副作用多。服用别嘌醇治疗慢性痛风的副作用包括：1、皮疹，发生率为3～10％，可呈瘙痒性丘疹或荨麻疹，也可为水疱性反应，重症还可能发生其他过敏性反应，如剥脱性和紫癜性病变、多形性红斑等，一旦出现皮肤病变，应即停药；2、腹泻、恶心、呕吐、胃痛或阵发性腹痛等胃肠道疾病，发生率为3～10％，重症或持续存在时应作适当的对症处理；3、头痛、头晕，罕见手脚麻木感、刺痛或疼痛、乏力等末梢神经炎症状。
非布司他2008年在欧洲上市，2009年在美国上市，2013年起在中国上市，上市之初非布司他凭借其降尿酸的速度更快、副作用更少、适用于长期治疗等特点，迅速抢占了全球抗痛风药市场份额，其具有强效、安全、轻中度肾功能不全者不需要调整剂量等优势，适用于高尿酸血症合并痛风的长期治疗，包括尿酸生成增多和肾清除率下降的痛风患者，尤其适合别嘌醇不能耐受或有禁忌、别嘌醇治疗后尿酸不能达标的痛风患者。但是，随着使用人群的不断扩大，非布司他的各种不良反应也相继被报道。服用非布司他治疗慢性痛风的不良反应包括肝功能异常(3.5％)、腹泻(2.7％)、头痛(1.8％)、恶心(1.7％)和皮疹(1.5％)等。2017年，FDA发布非布司他心脏相关性死亡风险警告，与别嘌醇相比，非布司他可能增加心脏相关性死亡的风险。
此外，别嘌醇和非布司他等XOD抑制剂在抑制尿酸合成的同时，会显著增高患者体内合成尿酸的上游物质嘌呤的含量，而嘌呤类物质在肾脏中沉积也进一步加剧肾损伤。因此，急需开发一种副作用少且可有效预防和/或治疗XOD抑制剂导致的高嘌呤血症的药物，或者，急需开发一种副作用少、可有效预防和/或治疗高嘌呤血症，同时，可有效预防和/或治疗高尿酸血症的药物。
黄蜀葵为锦葵科植物黄蜀葵Abelmoschus manihot(L.)Medic.的干燥花冠，具有治疗慢性肾病、镇痛、降糖等作用，以黄蜀葵为原料生产的“黄葵胶囊”、“黄蜀葵花颗粒剂”和“花甲片”具有减轻肾小球免疫反应性炎症、降低尿蛋白、消肿、减轻腰痛等作用，主治糖尿病肾炎、慢性肾炎和类风湿性关节炎等疾病。服用黄蜀葵并不会对人体造成任何毒副作用。目前，关于黄蜀葵或其提取物在制备预防和/或治疗高嘌呤血症的药物中的应用尚无报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物具有如下至少一种用途：
(a)降嘌呤；
(b)降尿酸；和/或，
(c)预防和/或治疗肾损伤。
在本发明的一种实施方式中，所述降嘌呤是指预防和/或治疗高嘌呤血症；所述降尿酸是指预防和/或治疗高尿酸血症。
在本发明的一种实施方式中，所述高嘌呤血症是指XOD抑制剂导致的高嘌呤血症。
在本发明的一种实施方式中，所述高尿酸血症是指嘌呤代谢紊乱导致的高尿酸血症。
在本发明的一种实施方式中，所述肾损伤是指嘌呤蓄积导致的肾损伤。
在本发明的一种实施方式中，所述药物为棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂和缓控释制剂中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物为黄蜀葵提取物或黄葵胶囊。
在本发明的一种实施方式中，所述黄蜀葵提取物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷。
在本发明的一种实施方式中，所述黄蜀葵提取物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、芦丁、杨梅素和槲皮素，或者，所述黄蜀葵提取物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、芦丁和杨梅素。
在本发明的一种实施方式中，以重量百分比计，所述黄蜀葵提取物含有4.95～13.39％棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、3.16～9.61％金丝桃苷、2.93～9.09％异槲皮苷、1.68～6.59％槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、0.87～2.88％芦丁、0.63～1.32％杨梅素和0～1.35％槲皮素。
在本发明的一种实施方式中，所述黄蜀葵提取物的制备方法包括如下步骤：以黄蜀葵为原料，以有机溶剂和/或水为提取溶剂进行提取，得到黄蜀葵提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述提取溶剂为50～80vt％的醇水溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述黄蜀葵提取物的制备方法包括如下步骤：取黄蜀葵加入5～15倍重量的50～80vt％的醇水溶液于45～75℃进行浸泡提取，提取1～3次，每次提取1～3h，合并提取液，浓缩，得到黄蜀葵浸膏，干燥，得到黄蜀葵提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述黄蜀葵提取物的制备方法还包括取所述黄蜀葵浸膏进行大孔树脂层析的步骤。
在本发明的一种实施方式中，所述大孔树脂层析包括如下步骤：取黄蜀葵浸膏采用10～95vt％的醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液。
在本发明的一种实施方式中，在所述大孔树脂层析步骤中，控制洗脱流速为2～5BV/h，每种洗脱试剂的洗脱体积为2～5BV。
在本发明的一种实施方式中，所述大孔树脂吸附步骤采用的大孔树脂柱为HP20大孔树脂柱。
在本发明的一种实施方式中，所述黄蜀葵提取物的制备方法还包括取所述洗脱液进行浓缩的步骤。
在本发明的一种实施方式中，所述醇水溶液为乙醇与水的混合液。
本发明还提供了一种制备黄蜀葵提取物的方法，所述方法包括如下步骤：以黄蜀葵为原料，以有机溶剂和/或水为提取溶剂进行提取，得到黄蜀葵提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述提取溶剂为50～80vt％的醇水溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：取黄蜀葵加入5～15倍重量的50～80vt％的醇水溶液于45～75℃进行浸泡提取，提取1～3次，每次提取1～3h，合并提取液，浓缩，得到黄蜀葵浸膏，干燥，得到黄蜀葵提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括取所述黄蜀葵浸膏进行大孔树脂层析的步骤。
在本发明的一种实施方式中，所述大孔树脂层析包括如下步骤：取黄蜀葵浸膏采用10～95vt％的醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液。
在本发明的一种实施方式中，在所述大孔树脂层析步骤中，控制洗脱流速为2～5BV/h，每种洗脱试剂的洗脱体积为2～5BV。
在本发明的一种实施方式中，所述大孔树脂吸附步骤采用的大孔树脂柱为HP20大孔树脂柱。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括取所述洗脱液进行浓缩的步骤。
本发明还提供了一种黄蜀葵提取物，所述黄蜀葵提取物采用上述方法制得。
在本发明的一种实施方式中，所述黄蜀葵提取物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷。
在本发明的一种实施方式中，所述黄蜀葵提取物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、芦丁、杨梅素和槲皮素，或者，所述黄蜀葵提取物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、芦丁和杨梅素。
在本发明的一种实施方式中，以重量百分比计，所述黄蜀葵提取物含有4.95～13.39％棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、3.16～9.61％金丝桃苷、2.93～9.09％异槲皮苷、1.68～6.59％槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、0.87～2.88％芦丁、0.63～1.32％杨梅素和0～1.35％槲皮素。
本发明还提供了一种用于降嘌呤的药物，所述药物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述降嘌呤是指预防和/或治疗高嘌呤血症。
在本发明的一种实施方式中，所述高嘌呤血症是指XOD抑制剂导致的高嘌呤血症。
在本发明的一种实施方式中，所述药物为棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂和缓控释制剂中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物为上述黄蜀葵提取物或黄葵胶囊。
本发明还提供了一种用于降尿酸的药物，所述药物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述降尿酸是指预防和/或治疗高尿酸血症。
在本发明的一种实施方式中，所述高尿酸血症是指嘌呤代谢紊乱导致的高尿酸血症。
在本发明的一种实施方式中，所述药物为棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂和缓控释制剂中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物为上述黄蜀葵提取物或黄葵胶囊。
本发明还提供了一种用于治疗和/或预防肾损伤的药物，所述药物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述肾损伤是指嘌呤蓄积导致的肾损伤。
在本发明的一种实施方式中，所述药物为棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂和缓控释制剂中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物为上述黄蜀葵提取物或黄葵胶囊。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物在制备药物中的应用，其中：
研究发现棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷和黄蜀葵提取物均可有效提高高嘌呤血症造模小鼠对嘌呤类物质的代谢能力，说明棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷和黄蜀葵提取物均可有效降嘌呤，具有预防和/或治疗高嘌呤血症的作用；
研究发现棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷和黄蜀葵提取物均可有效降低高尿酸血症造模小鼠体内尿酸的含量，说明棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷和黄蜀葵提取物均可有效降尿酸，具有预防和/或治疗高尿酸血症的作用；
研究发现棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷和黄蜀葵提取物均可有效降低高嘌呤血症造模小鼠血浆的CRE值以及有效缓解高嘌呤血症造模小鼠肾脏的炎症情况，说明棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷和黄蜀葵提取物均可有效缓解嘌呤蓄积导致的肾损伤，具有预防和/或治疗肾损伤的作用，
因此，棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物既可单独施用以达到治疗高尿酸血症，同时，避免高嘌呤血症和肾损伤的目的，又可与别嘌醇和非布司他等XOD抑制剂联用以达到治疗高尿酸血症，同时，避免高嘌呤血症和肾损伤的目的。
进一步地，本发明提供的棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物在制备药物中的应用，通过选择50～80vt％的醇水溶液为提取溶剂提取黄蜀葵，提取得到的提取物具有更好地降嘌呤、降尿酸以及预防肝损伤的能力。
进一步地，本发明提供的棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物在制备药物中的应用，通过取黄蜀葵浸膏经采用10～95vt％的醇水溶液进行洗脱的大孔树脂吸附步骤有效富集了黄蜀葵中的有效成本，收集到的洗脱液具有更好地降嘌呤、降尿酸以及预防肝损伤的能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为黄蜀葵提取物E70的液相色谱图。
图2为空白组小鼠的肾脏解剖结果。
图3为模型组小鼠的肾脏解剖结果。
图4为受试药组8小鼠的肾脏解剖结果。
图5为空白组小鼠的肾脏病理切片结果(间质炎性细胞浸润情况)。
图6为模型组小鼠的肾脏病理切片结果(间质炎性细胞浸润情况)。
图7为受试药组8小鼠的肾脏病理切片结果(间质炎性细胞浸润情况)。
图8为模型组小鼠的肾脏病理切片结果(肾小球囊周围纤维化情况)。
图9为受试药组8小鼠的肾脏病理切片结果(肾小球囊周围纤维化情况)。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：黄蜀葵提取物的制备
具体步骤如下：
在2kg黄蜀葵花药材(购自安徽亳州药材市场)中加入20L 70vt％的乙醇水溶液于65℃进行浸泡提取，提取两次，每次提取2h，合并提取液；将提取液60℃减压浓缩至无醇味，得到黄蜀葵浸膏；将黄蜀葵浸膏60℃减压浓缩、干燥至粉末状，得到黄蜀葵提取物E70。
对黄蜀葵提取物E70进行HPLC分析，测得黄蜀葵提取物E70中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷这几种黄酮类化合物的含量分别为0.87％、3.16％、2.93％、4.95％、0.63％、0.61％和1.68％，这几种黄酮类化合物的合计总含量为14.83％；
其中，HPLC的条件如下：
流动相配制：
D相：0.1％(v/v)磷酸水溶液
B相：乙腈
色谱柱：C18柱，4.6×150mm，3μm，购自YMC公司
仪器：Agilent 1260
流速：0.8mL/min
进样量：10μL
柱温：35℃
检测波长：254nm
方法梯度：见表1。
表1HPLC的检测过程
| Time(min) | B％ | D％ |
| 0.00 | 10 | 90 |
| 3.00 | 10 | 90 |
| 33.00 | 35 | 65 |
| 52.00 | 90 | 10 |
| 52.10 | 95 | 5 |
| 55.00 | 95 | 5 |
实施例2：黄蜀葵提取物的制备
具体步骤如下：
在2kg黄蜀葵花药材(购自安徽亳州药材市场)中加入20L 70vt％的乙醇水溶液于65℃进行浸泡提取，提取两次，每次提取2h，合并提取液；将提取液60℃减压浓缩至无醇味，得到黄蜀葵浸膏1；将黄蜀葵浸膏1经HP20大孔树脂柱(HP20大孔树脂柱的直径为8cm，高度80cm，柱体积为4L)进行层析纯化后，依次用10vt％、30vt％、60vt％、95vt％的乙醇水溶液进行洗脱，控制洗脱流速为3BV/h，每种洗脱试剂的洗脱体积为3BV，收集并合并60vt％乙醇水溶液的前两个柱体积洗脱液，60℃减压浓缩、干燥至粉末状，得到黄蜀葵提取物Fr60-2，收集并合并60vt％乙醇水溶液的第三个柱体积洗脱液和95vt％乙醇水溶液的的第一个柱体积洗脱液，60℃减压浓缩、干燥至粉末状，得到黄蜀葵提取物Fr60/95。
对黄蜀葵提取物Fr60-2进行HPLC分析(HPLC的条件参见实施例1)，测得黄蜀葵提取物Fr60-2中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷这几种黄酮类化合物的含量分别为2.88％、9.38％、8.94％、13.39％、1.32％和6.59％，这几种黄酮类化合物的合计总含量为42.50％。
对黄蜀葵提取物Fr60/95进行HPLC分析(HPLC的条件参见实施例1)，测得黄蜀葵提取物Fr60/95中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷这几种黄酮类化合物的含量分别为2.62％、9.61％、9.09％、12.20％、1.20％、1.35％和4.45％，这几种黄酮类化合物的合计总含量为40.53％。
实验例1：黄蜀葵提取物对高嘌呤血症造模小鼠的影响
具体步骤如下：
1、实验材料
黄葵胶囊：购自苏中药业
金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷(纯度≥98％)：购自西安天广源生物科技有限公司公司。
昆明小鼠(SPF级，6-8周龄，雄性，体重17～19g)：购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
质量分数为0.5％的CMC-Na水溶液：称取羧甲基纤维素钠(CMC-Na，购自国药集团化学试剂有限公司)，加入蒸馏水配制成质量分数为0.5％的CMC-Na水溶液。
浓度为0.4mg/mL的非布司他溶液：称取非布司他(购自万邦医药公司)，加入质量分数为0.5％的CMC-Na水溶液配制成浓度为0.4mg/mL的非布司他溶液。
浓度为0.4mg/mL的受试物溶液：称取受试物，加入质量分数为0.5％的CMC-Na水溶液配制成浓度为0.4mg/mL的受试物溶液。
2、试验方法
取小鼠50只，随机分为10组，每组5只，10组分别为：空白组、模型组、分别给药受试物1～8的受试物组1～8，其中，受试物1为黄葵胶囊，受试物2～5分别金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷，受试物6～8分别为实施例1～2制备的黄蜀葵提取物E70、黄蜀葵提取物Fr60/95和黄蜀葵提取物Fr60-2。
实验开始后，对小鼠进行灌胃给药，每天上午灌胃造模1次，连续造模11天，下午给药1次，连续给药14天，其中，受试物组1～9小鼠每天上午以8mg/kg的计量灌胃浓度为0.4mg/mL的非布司他溶液，下午以600mg/kg的计量灌胃浓度为0.4mg/mL的受试物溶液；模型组小鼠每天上午以8mg/kg的计量灌胃浓度为0.4mg/mL的非布司他溶液，下午给予等剂量(和受试物组等剂量)的质量分数为0.5％的CMC-Na水溶液；空白组小鼠每天上午和下午均给予等剂量(和受试物组等剂量)的质量分数为0.5％的CMC-Na水溶液。
给药第13天，将各组小鼠转至代谢笼，收集各组小鼠24小时尿液，给药第14天，对各组小鼠摘除眼球进行采血，采血容量不低于0.5mL，随后处死各组小鼠，摘取肾脏，称取肾脏重量，拍照，切取一小块肾脏组织匀浆处理，另一小块置于福尔马林固定液中固定，4℃保存，用于切片观察。其余肾脏组织迅速置于-20℃保持。
使用全自动生化分析仪测定各组小鼠血浆的CRE值，使用高效液相色谱测定各组小鼠血浆中次黄嘌呤(HX)和黄嘌呤(X)的含量，检测结果见表4；
其中，高效液相色谱的条件如下：
流动相配制：
D相：10mM乙酸铵-0.03％(v/v)冰醋酸
C相：甲醇
色谱柱：C18柱，4.6×250mm，5um，购自YMC公司
仪器：Agilent 1260
流速：1mL/min
进样量：5μL
柱温：35℃
检测波长：0～6min：230nm，6～30min：270nm
方法梯度：见表2。
使用全自动生化分析仪测定各组小鼠尿液的CRE值，使用高效液相色谱测定各组小鼠尿液中次黄嘌呤(HX)和黄嘌呤(X)的含量，并且，计算各组小鼠尿液的HX/CRE值和X/CRE值(尿液的HX/CRE值和X/CRE值可有效表征小鼠对次黄嘌呤和黄嘌呤的代谢能力)，检测结果见表5；
其中，高效液相色谱的条件如下：
流动相配制：
D相：10mM乙酸铵-0.03％(v/v)冰醋酸
C相：甲醇
色谱柱：C18柱，4.6×250mm，5um，购自YMC公司
仪器：Agilent 1260
流速：1mL/min
进样量：5μL
柱温：35℃
检测波长：0～6min：230nm，6～30min：270nm
方法梯度：见表2。
使用高效液相色谱测定各组小鼠肾脏匀浆中次黄嘌呤(HX)和黄嘌呤(X)的含量，检测结果见表6；
其中，高效液相色谱的条件如下：
流动相配制：
D相：10mM KH2PO4-0.04％(v/v)磷酸
B相：80％(v/v)甲醇+20％(v/v)D相
色谱柱：C18柱，4.6×250mm，5um，购自YMC公司
仪器：Agilent 1100
流速：1mL/min
进样量：5μL
柱温：35℃
检测波长：270nm
方法梯度：见表3。
对各组小鼠的肾脏组织进行切片和HE染色后，在光学显微镜下观察各组小鼠肾脏组织的病理情况，观察结果见图1～8。
表2方法梯度
| Time(min) | C％ | D％ |
| 0 | 0 | 100 |
| 20 | 0 | 100 |
| 21 | 50 | 50 |
| 22 | 90 | 10 |
| 29 | 90 | 10 |
| 30 | 0 | 100 |
表3方法梯度
| Time(min) | C％ | D％ |
| 0 | 100 | 0 |
| 15 | 100 | 0 |
| 16 | 0 | 100 |
| 21 | 0 | 100 |
| 22 | 100 | 0 |
| 29 | 100 | 0 |
3、试验结果
由表4可知，造模后，小鼠血浆中CRE、HX和X显著增加，给药后，小鼠血浆中CRE、HX与X均有不同程度的降低，其中，受试物4、6、7、8降低血浆中次黄嘌呤和黄嘌呤效果显著，优于受试物1。
由表5可知，与空白组相比，模型组小鼠对嘌呤的代谢能力并无明显提高，而受试物组1～8小鼠尿液中的HX/CRE值和X/CRE值显著提升，说明受试物1～8均有较强的促嘌呤类代谢作用，其中，受试物4、6、7、8效果尤为显著，优于受试物1。
由表6可知，造模后，小鼠肾脏中HX含量并未增加，而X含量增幅显著，说明HX并未显著在肾脏中蓄积，而X在肾脏中蓄积显著，给药后，小鼠肾脏中的X含量大幅降低，蓄积得到显著改善，其中，受试物4、6、7、8效果显著，优于受试物1。
由图1～3可知，灌胃非布司他后，小鼠肾脏会出现嘌呤类结晶导致的肉眼可见的肾脏病变，灌胃受试物8后，小鼠肾脏出现嘌呤类结晶导致的肉眼病变的比例降低，病变部位减少，说明受试物8对非布司他导致的肾损伤有一定的恢复作用。
由图4～8可知，灌胃非布司他后，小鼠肾脏会出现局灶性炎症病灶，间质炎性细胞浸润，部分肾小球囊纤维化，肾小管扩张，官腔内出现管型，灌胃受试物8后，小鼠肾脏间质炎性细胞浸润显著降低，且受试物8对小鼠肾小管管型有一定的恢复作用。
表4不同组小鼠血浆的CRE值、HX含量和X含量
注：*表示与模型组相比，P<0.05(t-test检验)；**表示与模型组相比，P<0.01(t-test检验)；***表示与模型组相比，P<0.001(t-test检验)。
表5不同组小鼠尿液的HX/CRE值和X/CRE值
| 组别 | HX/CRE(umol/mmol) | X/CRE(umol/mmol) |
| 空白组 | 303.90±58.76 | 181.33±173.33 |
| 模型组 | 307.79±62.60 | 185.2±173.37 |
| 受试物组1 | 368.60±66.57* | 217.58±213.56** |
| 受试物组2 | 415.97±80.89** | 248.43±236.93*** |
| 受试物组3 | 430.80±83.04** | 256.92±245.9*** |
| 受试物组4 | 496.21±52.63*** | 274.42±313.66*** |
| 受试物组5 | 382.11±72.87* | 227.49±218.65** |
| 受试物组6 | 620.17±120.70*** | 370.43±353.17*** |
| 受试物组7 | 545.46±120.12*** | 332.79±300.76*** |
| 受试物组8 | 579.17±52.33*** | 479.87±60.93*** |
注：*表示与模型组相比，P<0.05(t-test检验)；**表示与模型组相比，P<0.01(t-test检验)；***表示与模型组相比，P<0.001(t-test检验)。
表6不同组小鼠肾脏匀浆的HX含量和X含量
注：*表示与模型组相比，P<0.05(t-test检验)；**表示与模型组相比，P<0.01(t-test检验)；***表示与模型组相比，P<0.001(t-test检验)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物具有如下至少一种用途：
(a)降嘌呤；
(b)降尿酸；和/或，
(c)预防和/或治疗肾损伤。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述降嘌呤是指预防和/或治疗高嘌呤血症；所述降尿酸是指预防和/或治疗高尿酸血症。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物为黄蜀葵提取物或黄葵胶囊。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述黄蜀葵提取物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述黄蜀葵提取物的制备方法包括如下步骤：以黄蜀葵为原料，以有机溶剂和/或水为提取溶剂进行提取，得到黄蜀葵提取物；
优选地，所述提取溶剂为50～80vt％的醇水溶液。
6.一种制备黄蜀葵提取物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以黄蜀葵为原料，以有机溶剂和/或水为提取溶剂进行提取，得到黄蜀葵提取物；
优选地，所述提取溶剂为50～80vt％的醇水溶液。
7.一种黄蜀葵提取物，其特征在于，所述黄蜀葵提取物采用权利要求6所述的方法制得。
8.一种用于降嘌呤的药物，其特征在于，所述药物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物。
9.一种用于降尿酸的药物，其特征在于，所述药物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物。
10.一种用于治疗和/或预防肾损伤的药物，其特征在于，所述药物含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素-3’-O-葡萄糖苷或含有棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素-3’-O-葡萄糖苷中的至少一种的组合物。
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