CN114588187B - 一种治疗白内障的中药总黄酮提取物及其组合物、制备方法和医药用途 - Google Patents

一种治疗白内障的中药总黄酮提取物及其组合物、制备方法和医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗白内障的中药总黄酮提取物及其组合物、制备方法和医药用途，所述中药总黄酮为木蝴蝶总黄酮，本发明进一步提供木蝴蝶总黄酮的质量控制方法，其中，所述木蝴蝶总黄酮含有黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素‑7‑O‑葡萄糖醛酸苷，并且以上6个黄酮类化合物总含量大于20％。

Description

一种治疗白内障的中药总黄酮提取物及其组合物、制备方法 和医药用途
技术领域
本发明具体涉及公开了一种治疗白内障的中药木蝴蝶总黄酮提取物及其组合物和他们的制备方法，公开了木蝴蝶总黄酮提取物治疗白内障的医药用途及其质量控制方法。
背景技术
中药木蝴蝶为紫薇科木蝴蝶(Oroxylum indicum(Linn.)Kurz)的干燥成熟种子，是我国传统医学中常用药物之一，有清肺利咽、舒肝和胃之功效。常用于肺热咳嗽、喉痹、音哑、肝胃气痛，也用于治疗百日咳、干性气管炎。其化学成分主要包含4大类化学成分：黄酮类、1(2H)-萘酮(1-3)及其二聚体类(4)、芦荟大黄素等蒽醌类(5)、紫檀烷类(6)和苯基吡喃酮类化合物(7)。
我们在筛选了600多种中药基础上，意外发现木蝴蝶提取物可治疗白内障，虽然在文献中有报道木蝴蝶在复方和单独使用有一定的治疗白内障的效果，但是，并未发现木蝴蝶中治疗白内障的有效成分。因此，我们分别制备了木蝴蝶中的黄酮类、Catalponol和Palmarumycin CP1等1(2H)-萘酮及其二聚体类、芦荟大黄素等蒽醌类、紫檀烷类4类成分的提取物，即：木蝴蝶总黄酮、木蝴蝶总1(2H)-萘酮、木蝴蝶总蒽醌、木蝴蝶总紫檀烷。利用半乳糖血症引起的大鼠白内障模型筛选，意外地发现：只有木蝴蝶总黄酮具有显著的治疗白内障的作用，并且具有量效关系；而木蝴蝶总1(2H)-萘酮、木蝴蝶总蒽醌、木蝴蝶总紫檀烷没有治疗白内障的作用，有关试验结果如下：
因此，我们进一步通过提取工艺研究，建立了木蝴蝶总黄酮提取物的提取工艺，并对其中的黄酮类化合物建立了含量测定方法，以提高提取物工艺参数的优化和标定提取物的质量。制备了木蝴蝶总黄酮提取物的多种组合物，并对木蝴蝶总黄酮提取物及其组合物进行了系统的治疗和预防白内障的活性评价研究，发现其可治疗多种原因引起的白内障，对白内障患者提供了一种有效治疗药物的前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，发明治疗白内障的中药提取物，建立制备该活性提取物的方法，并制备其组合物，进而评价其预防和治疗白内障的作用，建立其质量控制方法。
我们以D-半乳糖所致大鼠白内障模型，筛选了600多种中药提取物，意外发现中药木蝴蝶总黄酮提取物可治疗白内障。因此，我们分离、分析发现其中的黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷等黄酮类成分为其主要成分。
我们进一步，以黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷为对照品，建立了HPLC同时测定以上6种黄酮类成分的方法。利用水提取、70％乙醇提取、70％乙醇提取后正丁醇萃取，制备得到了3种不同黄酮类成分含量的中药木蝴蝶总黄酮提取物。利用所建立的HPLC同时测定以上6种黄酮类成分的方法，测定了他们的含量分别为：20.6％、43.9％和65.9％。利用以上3种不同黄酮类成分含量的中药木蝴蝶总黄酮提取物为实验样品，以D-半乳糖所致大鼠白内障模型为评价方法，测试了不同黄酮类成分含量的中药木蝴蝶总黄酮提取物治疗白内障的活性强弱，发现：木蝴蝶总黄酮提取物中6种黄酮类成分总含量与治疗白内障活性成正相关(结果见下表)。
表：木蝴蝶总黄酮提取物对晶体浑浊度的影响(动物数n＝20)
注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01
因此，后续制备工艺研究均以黄酮类成分的总含量为指标，建立了治疗白内障活性木蝴蝶总黄酮提取物的有效制备方法。所用方法为：利用所建立的HPLC同时测定以上6种黄酮类成分的方法，考察了不同提取溶剂提取、不同有机溶剂萃取、大孔树脂吸附树脂纯化等条件，所能得到的黄酮类成分的含量差异明显，因此，制备得到了系列不同黄酮类成分含量的中药木蝴蝶总黄酮提取物。因为，我们发现黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷以上6个黄酮类化合物总含量大于20％的中药木蝴蝶总黄酮提取物就具备治疗作用，因此，我们把能够制备出20％以上含量的中药提取物的制备方法，均考察发现了。在实际应用过程中，可以根据需要，采用不同的提取物方法，得到不同含量的提取物。具体考察的指标如下：
1、中药木蝴蝶总黄酮提取物的提取方法研究：考察发现用水或者有机溶剂，或者含水的有机溶剂回流提取，回收溶剂，干燥，意外地得到了大于20％的高黄酮含量的提取物，甚至高达50％以上的中药木蝴蝶总黄酮提取物的提取溶剂的发现，为我们的发现提供了极大的惊喜。
2、鉴于黄酮类成分为中药木蝴蝶总黄酮提取物治疗白内障的有效成分，我们进一步追求高黄酮含量的中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备，因此，系统考察了溶剂萃取和大孔树脂色谱工艺。意外地发现：
1)正丁醇萃取工艺可以得到总黄酮含量大于65％的中药木蝴蝶总黄酮提取物，而不是一般天然药物化学家经验使用的乙酸乙酯萃取工艺；
2)大孔树脂工艺甚至可以得到总黄酮含量高于95％的中药木蝴蝶总黄酮提取物，这是一般利用大孔树脂工艺制备中药提取物没法达到的高含量。
3、研究建立了中药木蝴蝶总黄酮提取物的片剂、胶囊剂和颗粒剂的处方和工艺，并意外地发现了Vc可以保护中药木蝴蝶总黄酮提取物制剂中的黄酮类成分的稳定性。
4、为了进一步发现中药木蝴蝶总黄酮提取物预防和治疗白内障的应用范围，我们利用所制备的中药木蝴蝶总黄酮提取物开展了系统地药理学评价，发现：中药木蝴蝶总黄酮提取物预防和治疗各种原因引起的白内障，如：半乳糖血症引起的白内障、老年性白内障、外伤所致白内障和糖尿病并发性白内障、甲状腺功能减退引起的白内障、重金属中毒或其他原因一起的晶状体混浊。
本发明公开的具有预防和治疗白内障作用的中药木蝴蝶总黄酮提取物的发现，及其制备工艺、药物制剂等组合物、医药用途和质量控制方法，对于目前缺少医药治疗的广大白内障患者提供了希望，具有深远社会意义。
为此，本发明提供木蝴蝶总黄酮提取物在制备治疗白内障的药物中的应用，其中所述木蝴蝶总黄酮提取物含有黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷，并且这6个黄酮类化合物的总含量在提取物中的重量比例大于20％，优选大于50％，最优选大于95％。
本发明所述的应用，其中所述白内障，为含半乳糖血症引起的白内障、老年性白内障、外伤所致白内障和糖尿病并发性白内障，甲状腺功能减退引起的白内障，重金属中毒或其他原因引起的晶状体混浊。
本发明进一步提供本发明所述木蝴蝶总黄酮提取物中黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷6个黄酮类化合物总含量的测定方法如下：
1)对照品溶液：分别配制黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品甲醇混合溶剂，使浓度在1-100μg/ml范围内；2)供试品溶液：称取木蝴蝶总黄酮提取物5-50mg，甲醇溶解，定容到100μg/ml；3)将对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱色谱仪，得到色谱图，根据色谱图峰面积计算供试品溶液中黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷的含量；
其中，所述高效液相色谱条件如下：ODS色谱柱(4.6×150mm)，检测波长：柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；
流速mL/min 时间min 甲醇 0.3％磷酸水
1 0 20 80
1 10 35 65
1 25 45 55
1 30 98 2
1 35 98 2
1 40 20 80
1 50 20 80
。
本发明所述的应用，其中所述木蝴蝶总黄酮提取物，制备方法如下：
取中药木蝴蝶，用20％-95％的乙醇提取，提取物除去乙醇后悬浮于水中，用正丁醇或者乙酸乙酯正丁醇混合溶剂萃取；
或者，取中药木蝴蝶，用20％-95％的乙醇提取，提取物除去乙醇后悬浮于水中，上样到空白大孔吸附树脂上，先用水或者低浓度含水乙醇洗脱去除杂质，再用大于50％乙醇洗脱，得到大于60％乙醇洗脱物，回收乙醇，干燥，即得；其中，大孔吸附树脂可以是具有一定极性或者氢键缔合能力的大孔树脂(如HPD500等)；低浓度含水乙醇洗脱去除杂质的乙醇浓度最高不超过30％，最优为10％；洗脱有效提取物的乙醇浓度大于50％，最优为大于60％；
或者
取中药木蝴蝶，用20％-95％的乙醇提取，提取物除去乙醇后用含水乙醇溶解吸附到大孔吸附树脂上，挥干乙醇，上样到空白大孔吸附树脂上，先用水或者低浓度含水乙醇洗脱去除杂质，再用大于50％乙醇洗脱，得到大于60％乙醇洗脱物，回收乙醇，干燥，即得。其中，大孔吸附树脂可以是具有一定极性或者氢键缔合能力的大孔树脂(如HPD500等)；含水乙醇溶解提取物吸附到大孔吸附树脂上所用的乙醇浓度在10％-80％之间；低浓度含水乙醇洗脱去除杂质的乙醇浓度最高不超过30％，最优为10％；洗脱有效提取物的乙醇浓度大于50％，最优为大于60％。
优选的，本发明所述木蝴蝶总黄酮提取物，制备方法如下：
取中药木蝴蝶，加40％乙醇10倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶40％乙醇提取物。
或者
取中药木蝴蝶，加8倍量水，室温浸泡2小时，然后煎煮提取2小时，分离第一次提取液，再加4倍量水，煎煮提取1.5小时，分离第二次提取液，合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质，提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶水提取物。
或者
取中药木蝴蝶，加70％乙醇6倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再70％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。提取液回收溶剂，干燥，即得。
最优选的，本发明所述木蝴蝶总黄酮提取物，制备方法如下：
取中药木蝴蝶，加8倍量水，室温浸泡2小时，然后煎煮提取2小时，分离第一次提取液，再加4倍量水，煎煮提取1.5小时，分离第二次提取液，合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质，提取液回收溶剂，干燥，得木蝴蝶水提取物，将水提取物溶解悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯，干燥，即得；
或者
取中药木蝴蝶，加70％乙醇6倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再70％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。提取液回收溶剂，干燥，即得提取物，提取物溶解悬浮于水中，用正丁醇萃取3次，回收正丁醇，干燥，即得；
或者
取中药木蝴蝶，加40％乙醇10倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶40％乙醇提取物，取提取物，溶解悬浮于水中，上样到空白中等极性大孔吸附树脂HPD500上，先用10％乙醇洗脱去除杂质，再用80％乙醇洗脱，得到80％乙醇洗脱物，80％乙醇洗脱物回收乙醇，干燥，即得；
或者
取中药木蝴蝶，加70％乙醇6倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再70％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。提取液回收溶剂，干燥，即得提取物，取提取物，溶解悬浮于水中，上样到空白非极性大孔吸附树脂HPD100上，先用30％乙醇洗脱去除杂质，再用60％乙醇洗脱，得到60％乙醇洗脱物，60％乙醇洗脱物回收乙醇，干燥，即得；或者取中药木蝴蝶，加8倍量水，室温浸泡2小时，然后煎煮提取2小时，分离第一次提取液，再加4倍量水，煎煮提取1.5小时，分离第二次提取液，合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质，提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶水提取物，取提取物，溶解悬浮于水中，上样到空白极性大孔吸附树脂HPD750上，先用水洗脱去除杂质，再用95％乙醇洗脱，得到95％乙醇洗脱物，95％乙醇洗脱物回收乙醇，干燥，即得。
附图说明
图1、中药木蝴蝶总黄酮提取物治疗前中后期的大鼠白内障裂隙灯观察的眼球照片，D-半乳糖所致大鼠白内障模型
图2、同时测定黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷6种黄酮类成分的HPLC色谱图
具体实施方式
以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。
实施例1：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
取中药木蝴蝶，加40％乙醇10倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶40％乙醇提取物。按照以下测定方法，测定其中总黄酮含量30.5％，其中各单体含量：黄芩素(6.7％)、黄芩苷(0.2％)、木蝴蝶苷A(10.8％)、木蝴蝶苷B(8.6％)、白杨素(3.7％)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(0.5％)。
中药木蝴蝶总黄酮提取物中黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷以上6个黄酮类化合物总含量测定方法，其特征为：
1)对照品溶液：分别配制黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品甲醇混合溶剂(浓度在1-100μg/ml范围内)。
2)供试品溶液：精密称取所述治疗白内障的中药木蝴蝶总黄酮提取物5-50mg，甲醇溶解，定容到约100μg/ml，即得。
3)色谱条件：ODS色谱柱(4.6×150mm)，检测波长：柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸水为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱。
表1木蝴蝶含量测定色谱流动项梯度条件
流速mL/min 时间min 甲醇 0.3％磷酸水
1 0 20 80
1 10 35 65
1 25 45 55
1 30 98 2
1 35 98 2
实施例2：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
与实施例1基本相同，所不同的是，水为提取溶剂，具体方法如下：
取中药木蝴蝶，加8倍量水，室温浸泡2小时，然后煎煮提取2小时，分离第一次提取液，再加4倍量水，煎煮提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶水提取物。按照以下测定方法，测定其中总黄酮含量20.6％，其中各单体含量(测定方法同实施例1)：黄芩素(3.4％)、黄芩苷(0.1％)、木蝴蝶苷A(8.1％)、木蝴蝶苷B(7.7％)、白杨素(1.3％)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(0％)。
实施例3：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
与实施例1基本相同，所不同的是，70％乙醇为提取溶剂，具体方法如下：取中药木蝴蝶，加70％乙醇6倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再70％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶70％乙醇提取物。测定其中总黄酮含量43.9％，其中各单体含量(测定方法同实施例1)：黄芩素(6.8％)、黄芩苷(3.9％)、木蝴蝶苷A(12.1％)、木蝴蝶苷B(10.7％)、白杨素(2.9％)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(7.5％)。
实施例4：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
与实施例1基本相同，所不同的是，95％乙醇为提取溶剂，具体方法如下：取中药木蝴蝶，加95％乙醇12倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再95％乙醇10倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液。合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质。提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶95％乙醇提取物。测定其中总黄酮含量52.7％，其中各单体含量(测定方法同实施例1)：黄芩素(2.3％)、黄芩苷(10.1％)、木蝴蝶苷A(12.6％)、木蝴蝶苷B(10.6％)、白杨素(1.2％)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(15.9％)。
实施例5：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
取实施例2得到的中药木蝴蝶总黄酮提取物，溶解悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯，干燥，即得。测定其中总黄酮含量41.9％，其中各单体含量(测定方法同实施例1)：黄芩素(7.1％)、黄芩苷(0.0％)、木蝴蝶苷A(16.9％)、木蝴蝶苷B(15.1％)、白杨素(2.8％)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(0％)。
实施例6：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
取实施例3得到的中药木蝴蝶总黄酮提取物，溶解悬浮于水中，用正丁醇萃取3次，回收正丁醇，干燥，即得。测定其中总黄酮含量65.9％，其中各单体含量(测定方法同实施例1)：黄芩素(14.2％)、黄芩苷(5.4％)、木蝴蝶苷A(22.8％)、木蝴蝶苷B(16.2％)、白杨素(7.3％)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(10.1％)。
实施例7：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
取实施例1得到的中药木蝴蝶总黄酮提取物，溶解悬浮于水中，上样到空白中等极性大孔吸附树脂HPD500上，先用10％乙醇洗脱去除杂质，再用80％乙醇洗脱，得到80％乙醇洗脱物，80％乙醇洗脱物回收乙醇，干燥，即得。测定其中总黄酮含量69.6％，其中各单体含量(测定方法同实施例1)：黄芩素(18.0％)、黄芩苷(1.4％)、木蝴蝶苷A(24.1％)、木蝴蝶苷B(18.4％)、白杨素(6.9％)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(0.8％)。
实施例8：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
取实施例3得到的中药木蝴蝶总黄酮提取物，溶解悬浮于水中，上样到空白非极性大孔吸附树脂HPD100上，先用30％乙醇洗脱去除杂质，再用60％乙醇洗脱，得到60％乙醇洗脱物，60％乙醇洗脱物回收乙醇，干燥，即得。测定其中总黄酮含量95.2％，其中各单体含量(测定方法同实施例1)：黄芩素(22.3％)、黄芩苷(7.1％)、木蝴蝶苷A(25.2％)、木蝴蝶苷B(21.9％)、白杨素(10.5％)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(8.2％)。
实施例9：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
取实施例2得到的中药木蝴蝶总黄酮提取物，溶解悬浮于水中，上样到空白极性大孔吸附树脂HPD750上，先用水洗脱去除杂质，再用95％乙醇洗脱，得到95％乙醇洗脱物，95％乙醇洗脱物回收乙醇，干燥，即得。测定其中总黄酮含量52.6％，其中各单体含量(测定方法同实施例1)：黄芩素(8.7％)、黄芩苷(0.1％)、木蝴蝶苷A(21.9％)、木蝴蝶苷B(18.3％)、白杨素(3.6％)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(0％)。
实施例10：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
与实施例1基本相同，所不同的是，提取溶剂为甲醇，测定提取物中总黄酮含量46.8％。
实施例11：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
与实施例1基本相同，所不同的是，提取溶剂为丙酮，测定提取物中总黄酮含量37.2％。
实施例12：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
与实施例5基本相同，所不同的是，萃取溶剂为乙酸乙酯-正丁醇混合溶剂(正丁醇-乙酸乙酯-水比例为4：1：5)，测定提取物中总黄酮含量48.9％。
实施例13：中药木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法
与实施例6基本相同，所不同的是，萃取溶剂为乙酸乙酯-正丁醇混合溶剂(正丁醇-乙酸乙酯-水比例为2：3：5)，测定提取物中总黄酮含量39.6％。
实施例14：组合物-中药木蝴蝶总黄酮提取物片的制备
取实施例8得到的中药木蝴蝶总黄酮提取物粉末与淀粉、微晶纤维素等辅料分别过100目筛后，按各处方比例称取混匀，加入适量80％乙醇制软材，16目筛制粒，50℃热风干燥90min。14目筛整粒后，加入适量滑石粉和硬脂酸镁，打片，即得。
处方组成：每片500mg，含中药木蝴蝶总黄酮提取物200mg。
处方如下：
实施例15：组合物-中药木蝴蝶总黄酮提取物胶囊的制备
取实施例6得到的中药木蝴蝶总黄酮提取物粉末与淀粉、微晶纤维素等辅料分别过100目筛后，按各处方比例称取混匀，加入适量80％乙醇制软材，16目筛制粒，50℃热风干燥90min。14目筛整粒后，加入适量滑石粉和硬脂酸镁，填充胶囊，即得。
处方组成：每粒250mg，含中药木蝴蝶总黄酮提取物150mg。
处方如下：
实施例16：组合物-中药木蝴蝶总黄酮提取物颗粒剂的制备
取实施例1得到的中药木蝴蝶总黄酮提取物粉末与淀粉、微晶纤维素等辅料分别过100目筛后，按各处方比例称取混匀，加入适量80％乙醇制软材，16目筛制粒，50℃热风干燥90min。14目筛整粒后，加入适量滑石粉和硬脂酸镁，装袋，即得。
处方组成：每袋2g，含中药木蝴蝶总黄酮提取物300mg。
处方如下：
实施例17：中药木蝴蝶总黄酮提取物治疗半乳糖血症引起的白内障
选取健康大鼠180只，雌雄兼用，体重180－220g。从中取出20只作为空白对照组，其余动物按10g/kg剂量腹腔注射50％的D-半乳糖水溶液，每天一次，连续15天，同时供给5％ D-半乳糖溶液自由饮用12天，空白对照组动物腹腔注射等容量0.9％氯化钠注射液，供给自来水饮用。注射D-半乳糖结束时，在裂隙灯显微镜下检查晶体浑浊程度，剔除晶体全部混浊及没有明显变化的大鼠，选用浑浊程度相近的大鼠100只，按性别和晶体浑浊程度随机分为5组，每组20只。雌雄兼用。5组分别为模型组、阳性药对照组(障眼明片组)、木蝴蝶总黄酮提取物160mg/kg剂量组、木蝴蝶总黄酮提取物80mg/kg剂量组和木蝴蝶总黄酮提取物40mg/kg剂量组。
给药：正常对照组和模型组给予蒸馏水，阳性药对照组给予障眼明片2片/kg剂量，木蝴蝶总黄酮提取物(实施例3方法所得提取物)三组剂量分别为160mg/kg、80mg/kg和40mg/kg。给药途径为经灌胃给药。给药容量均为10ml/kg体重。每天9－11时给药一次，连续30天。分别于给药5天、10天、15天、20天、30天检查晶体浑浊度，并按晶体浑浊度评分标准，打出分值。
大鼠晶体浑浊度评分标准，见表2。
表2大鼠晶体浑浊度评分标准
/>
结果表明，正常对照组动物晶体澄清，无任何病变发生。模型组停止注射D-半乳糖后，晶体浑浊度仍能缓慢上升，使晶体浑浊度维持在较高水平。木蝴蝶总黄酮提取物各组与模型组比较，晶体浑浊度有明显降低，160mg/kg剂量组在给药治疗10、15、20、30天时，有极显著差异；80mg/kg剂量组在给药治疗20、30天时也有极显著差异,1 0、15天时，有显著差异；40mg/kg剂量组在给药15、20、30天时有显著差异。有较好的量效关系，高剂量见效早，且明显，初见疗效的时间分别为160mg/kg剂量组10天时，有极显著差异；80mg/kg剂量组10天时，有显著差异；40mg/kg剂量组15天时，有显著差异；阳性药障眼明片20天时，有显著差异；综合分析认为木蝴蝶总黄酮提取物对大鼠D-半乳糖性白内障有明显的治疗作用，作用强度强于等效量的障眼明片。见表3。
表3木蝴蝶总黄酮提取物对晶体浑浊度的影响
注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01
实施例18：中药木蝴蝶总黄酮提取物治疗糖尿病并发性白内障
选取自发性糖尿病大鼠180只，雌雄兼用，体重180－200g。从中取出20只作为空白对照组，其余动物按8g/kg剂量腹腔注射50％D-半乳糖，每天一次，连续15天，同时供给5％D-半乳糖溶液自由饮用12天，空白对照组动物腹腔注射等容量0.9％氯化钠注射液，供给自来水饮用。注射D-半乳糖结束时，在裂隙灯显微镜下检查晶体浑浊程度，剔除晶体全部混浊及没有明显变化的大鼠，选用浑浊程度相近的大鼠100只，按性别和晶体浑浊程度随机分为5组，每组20只。雌雄兼用。5组分别为模型组、阳性药对照组(障眼明片组)、木蝴蝶总黄酮提取物200mg/kg剂量组、木蝴蝶总黄酮提取物100mg/kg剂量组和木蝴蝶总黄酮提取物50mg/kg剂量组。
给药：正常对照组和模型组给予蒸馏水，阳性药对照组给予障眼明片2片/kg剂量，木蝴蝶总黄酮提取物(实施例4方法所得提取物)三组剂量分别为200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg。给药途径为经灌胃给药。给药容量均为10ml/kg体重。每天9－11时给药一次，连续30天。分别于给药5天、10天、15天、20天、30天检查晶体浑浊度，并按晶体浑浊度评分标准，打出分值。
大鼠晶体浑浊度评分标准，见表2。
结果表明，正常对照组动物晶体澄清，无任何病变发生。模型组停止注射D-半乳糖后，晶体浑浊度仍能缓慢上升，使晶体浑浊度维持在较高水平。木蝴蝶总黄酮提取物各组与模型组比较，晶体浑浊度有明显降低，200mg/kg剂量组在给药治疗10、15、20、30天时，有极显著差异；100mg/kg剂量组在给药治疗15、20、30天时，有极显著差异,10天时，有极显著差异；50mg/kg剂量组在给药15、20、30天时有显著差异。有较好的量效关系，高剂量见效早，且明显，初见疗效的时间分别为200mg/kg剂量组10天时，有极显著差异；100mg/kg剂量组15天时，有显著差异；50mg/kg剂量组15天时，有显著差异；阳性药障眼明片20天时，有显著差异；综合分析认为木蝴蝶总黄酮提取物对糖尿病大鼠D-半乳糖性白内障有明显的治疗作用，作用强度强于等效量的障眼明片。见表4。
表4木蝴蝶总黄酮提取物对晶体浑浊度的影响
注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01
实施例19：中药木蝴蝶总黄酮提取物治疗老年性白内障
选取1岁龄大鼠180只，雌雄兼用，体重450－550g。从中取出20只作为空白对照组，其余动物按10g/kg剂量腹腔注射50％D-半乳糖，每天一次，连续15天，同时供给5％ D-半乳糖溶液自由饮用12天，空白对照组动物腹腔注射等容量0.9％氯化钠注射液，供给自来水饮用。注射D-半乳糖结束时，在裂隙灯显微镜下检查晶体浑浊程度，剔除晶体全部混浊及没有明显变化的大鼠，选用浑浊程度相近的大鼠100只，按性别和晶体浑浊程度随机分为5组，每组20只。雌雄兼用。5组分别为模型组、阳性药对照组(障眼明片组)、木蝴蝶总黄酮提取物200mg/kg剂量组、木蝴蝶总黄酮提取物100mg/kg剂量组和木蝴蝶总黄酮提取物50mg/kg剂量组。
给药：正常对照组和模型组给予蒸馏水，阳性药对照组给予障眼明片2片/kg剂量，木蝴蝶总黄酮提取物(实施例3方法所得提取物)三组剂量分别为200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg。给药途径为经灌胃给药。给药容量均为10ml/kg体重。每天9－11时给药一次，连续30天。分别于给药5天、10天、15天、20天、30天检查晶体浑浊度，并按晶体浑浊度评分标准，打出分值。
大鼠晶体浑浊度评分标准，见表2。
结果表明，正常对照组动物晶体澄清，无任何病变发生。模型组停止注射D-半乳糖后，晶体浑浊度仍能缓慢上升，使晶体浑浊度维持在较高水平。木蝴蝶总黄酮提取物各组与模型组比较，晶体浑浊度有明显降低，200mg/kg剂量组在给药治疗10、15、20、30天时，有极显著差异；100mg/kg剂量组在给药治疗15、20、30天时，有极显著差异,10天时，有极显著差异；50mg/kg剂量组在给药15、20、30天时有显著差异。有较好的量效关系，高剂量见效早，且明显，初见疗效的时间分别为200mg/kg剂量组10天时，有极显著差异；100mg/kg剂量组15天时，有显著差异；50mg/kg剂量组15天时，有显著差异；阳性药障眼明片20天时，有显著差异；综合分析认为木蝴蝶总黄酮提取物对糖尿病大鼠D-半乳糖性白内障有明显的治疗作用，作用强度强于等效量的障眼明片。见表5。
表5木蝴蝶总黄酮提取物对晶体浑浊度的影响
/>
注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01
实施例20：中药木蝴蝶总黄酮提取物治疗外伤所致白内障
选取大鼠180只，雌雄兼用，体重180－220g。从中取出20只作为空白对照组，其余动物，使用20g铁球20cm高度拍打眼球100次，每周一次。第一次拍打后，在裂隙灯显微镜下检查晶体浑浊程度，剔除晶体全部混浊及没有明显变化的大鼠，选用浑浊程度相近的大鼠100只，按性别和晶体浑浊程度随机分为5组，每组20只。雌雄兼用。5组分别为模型组、阳性药对照组(障眼明片组)、木蝴蝶总黄酮提取物200mg/kg剂量组、木蝴蝶总黄酮提取物100mg/kg剂量组和木蝴蝶总黄酮提取物50mg/kg剂量组。
给药：第一次拍打后第二天给药。正常对照组和模型组给予蒸馏水，阳性药对照组给予障眼明片2片/kg剂量，木蝴蝶总黄酮提取物(实施例8方法所得提取物)三组剂量分别为200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg。给药途径为经灌胃给药。给药容量均为10ml/kg体重。每天9－11时给药一次，连续30天。分别于给药5天、10天、15天、20天、30天检查晶体浑浊度，并按晶体浑浊度评分标准，打出分值。大鼠晶体浑浊度评分标准，见表2。
结果表明，正常对照组动物晶体澄清，无任何病变发生。模型组晶体浑浊度仍能晶体浑浊度维持在较高水平。木蝴蝶总黄酮提取物各组与模型组比较，晶体浑浊度有明显降低，200mg/kg剂量组在给药治疗10、15、20、30天时，有极显著差异；100mg/kg剂量组在给药治疗15、20、30天时，有极显著差异,10天时，有极显著差异；50mg/kg剂量组在给药15、20、30天时有显著差异。有较好的量效关系，高剂量见效早，且明显，初见疗效的时间分别为200mg/kg剂量组10天时，有极显著差异；100mg/kg剂量组15天时，有显著差异；50mg/kg剂量组15天时，有显著差异；阳性药障眼明片20天时，有显著差异；综合分析认为木蝴蝶总黄酮提取物对糖尿病大鼠D-半乳糖性白内障有明显的治疗作用，作用强度强于等效量的障眼明片。见表6。
表6木蝴蝶总黄酮提取物对晶体浑浊度的影响
注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01
实施例21：中药木蝴蝶总黄酮提取物治疗甲状腺功能减退并发白内障选取自发性甲状腺功能减退大鼠180只，雌雄兼用，体重180－200g。从中取出20只作为空白对照组，其余动物按10g/kg剂量腹腔注射50％D-半乳糖，每天一次，连续15天，同时供给5％ D-半乳糖溶液自由饮用12天，空白对照组动物腹腔注射等容量0.9％氯化钠注射液，供给自来水饮用。注射D-半乳糖结束时，在裂隙灯显微镜下检查晶体浑浊程度，剔除晶体全部混浊及没有明显变化的大鼠，选用浑浊程度相近的大鼠100只，按性别和晶体浑浊程度随机分为5组，每组20只。雌雄兼用。5组分别为模型组、阳性药对照组(障眼明片组)、木蝴蝶总黄酮提取物200mg/kg剂量组、木蝴蝶总黄酮提取物100mg/kg剂量组和木蝴蝶总黄酮提取物50mg/kg剂量组。
给药：正常对照组和模型组给予蒸馏水，阳性药对照组给予障眼明片2片/kg剂量，木蝴蝶总黄酮提取物(实施例1方法所得提取物)三组剂量分别为200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg。给药途径为经灌胃给药。给药容量均为10ml/kg体重。每天9－11时给药一次，连续30天。分别于给药5天、10天、15天、20天、30天检查晶体浑浊度，并按晶体浑浊度评分标准，打出分值。
大鼠晶体浑浊度评分标准，见表2。
结果表明，正常对照组动物晶体澄清，无任何病变发生。模型组停止注射D-半乳糖后，晶体浑浊度仍能缓慢上升，使晶体浑浊度维持在较高水平。木蝴蝶总黄酮提取物各组与模型组比较，晶体浑浊度有明显降低，200mg/kg剂量组在给药治疗10、15、20、30天时，有极显著差异；100mg/kg剂量组在给药治疗15、20、30天时，有极显著差异,10天时，有极显著差异；50mg/kg剂量组在给药15、20、30天时有显著差异。有较好的量效关系，高剂量见效早，且明显，初见疗效的时间分别为200mg/kg剂量组10天时，有极显著差异；100mg/kg剂量组15天时，有显著差异；50mg/kg剂量组15天时，有显著差异；阳性药障眼明片20天时，有显著差异；综合分析认为木蝴蝶总黄酮提取物对糖尿病大鼠D-半乳糖性白内障有明显的治疗作用，作用强度强于等效量的障眼明片。见表7。
表7木蝴蝶总黄酮提取物对晶体浑浊度的影响
/>
注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01
实施例22：中药木蝴蝶总黄酮提取物治疗治疗重金属中毒诱发的白内障
选取25窝大鼠，仔鼠体重20–30g，每窝选留6–8只幼鼠，尽量雌雄各半。从中取出3窝幼鼠，雌雄兼用，作为空白对照组，其余幼鼠颈脊部皮下注射0.0173％亚硒酸钠，剂量为3.46mg/kg，容量为2ml/100g，于第1、3、5天注射亚硒酸钠，第7天在裂隙灯显微镜下检查晶体，剔除晶体全部混浊及没有明显变化的幼鼠，选用的幼鼠按性别和晶体浑浊程度随机分为5组，每组20只，雌雄兼用。5组分别为模型组、阳性药组(障眼明片)，除木蝴蝶总黄酮提取物200mg/kg剂量组、木蝴蝶总黄酮提取物100mg/kg剂量组和木蝴蝶总黄酮提取物50mg/kg剂量组。给药：正常对照组灌胃给予蒸馏水；阳性药组灌胃给予障眼明片2片/kg；木蝴蝶总黄酮提取物(实施例6方法所得提取物)三组剂量分别为200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg；模型组灌胃给予蒸馏水。灌胃溶量均为1ml/100g体重，每天8–11时给药一次，连续给药60天。分别于给药5天、10天、20天、30天、40天、50天和60天检查晶体浑浊度，并按表2大鼠晶体浑浊度评分标准打出分值。结果表明：正常对照组大鼠晶体澄明，无任何病变发生。模型组停止注射亚硒酸钠后，晶体浑浊度仍能缓慢上升，晶体浑浊度仍能维持在较高水平。木蝴蝶总黄酮提取物各组与模型组比较，晶体浑浊度有明显降低，200mg/kg剂量组在给药治疗30天、40天、50天和60天有极显著差异；100mg/kg剂量组在给药治疗50天和60天有极显著差异，30天和40天时有显著差异；50mg/kg剂量组在给药治疗40天、50天和60天时有显著差异。有较好的显效关系，高剂量见效早，且明显。初见疗效的时间分别为木蝴蝶总黄酮提取物200mg/kg剂量组给药第30天有极显著差异，100mg/kg剂量组给药第50天有极显著差异；100mg/kg剂量组给药第30天有显著差异，50mg/kg剂量组给药40天有显著差异，障眼明片组给药第30天有显著差异。说明木蝴蝶总黄酮提取物对大鼠硒性白内障有明显的治疗作用。治疗作用强度与障眼明片强。结果见表8。
表8木蝴蝶总黄酮提取物对硒性白内障大鼠晶体浑浊度的影响
注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01。
实施例23：中药木蝴蝶总黄酮提取物预防半乳糖血症引起的白内障
选取wistar大鼠120只，体重100－120g。按体重随机分成6组，每组20只，雌雄各半。六组分别为空白对照组、模型组、阳性药组、木蝴蝶总黄酮提取物160mg/kg剂量组、木蝴蝶总黄酮提取物80mg/kg剂量组和木蝴蝶总黄酮提取物40mg/kg剂量组。
给药：空白对照组，灌胃给予蒸馏水；模型组灌胃给予蒸馏水；阳性药组给予障眼明片(2片/kg)；木蝴蝶总黄酮提取物(实施例2方法所得提取物)三组剂量分别为160mg/kg、80mg/kg和40mg/kg。灌胃容量均为1ml/100g体重，每天9－11时给药一次，连续18天。
白内障造模：于给药第四天，开始造模，除空白对照组外，其余五组动物均腹腔注射50％ D-半乳糖(用注射水配制)，剂量为10g/kg，每天一次，连续15天，同时给予5％ D-半乳糖溶液(用自来配制)，自由饮用12天。
分别于给药13天(造模10天)、给药15天(造模12天)和给药18天(造模15天)，用裂隙灯显微镜检查大鼠晶体浑浊度，并依照表2晶体浑浊度评分标准得出分值。
结果表明：正常对照组大鼠晶体澄明，无任何病变发生。模型组大鼠在造模期间，晶体浑浊度明显上升。木蝴蝶总黄酮提取物各组与模型组比较，晶体浑浊上升缓慢，160mg/kg和80mg/kg剂量组在给药13天(造模10天)、给药15天(造模12天)和给药18天(造模15天)均有极显著差异；40mg/kg剂量组，在给药13天(造模10天)和给药18天(造模15天)有显著差异，在给药15天(造模12天)有极显著差异。有明显的量效关系，剂量越高大鼠晶体浑浊度分值越低。说明木蝴蝶总黄酮提取物对大鼠D-半乳糖所致的白内障有一定的预防作用，作用强度强于等效量的障眼明片。见表9。
表9木蝴蝶总黄酮提取物对D-半乳糖性白内障大鼠晶体浑浊度的影响
注：*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01。
实施例24：中药木蝴蝶总黄酮提取物的含量测定
中药木蝴蝶总黄酮提取物中黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷以上6个黄酮类化合物总含量测定方法，其特征为：
1)对照品溶液：分别配制黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品甲醇混合溶剂(浓度在1-100μg/ml范围内)。
2)供试品溶液：精密称取治疗白内障的中药木蝴蝶总黄酮提取物5-50mg，甲醇溶解，定容到约100μg/ml，即得。
3)色谱条件：ODS色谱柱(4.6×150mm)，检测波长：柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸水为流动相B，按下表10中的溶剂梯度程序进行洗脱。
表10木蝴蝶含量测定色谱流动项梯度条件
流速mL/min 时间min 甲醇 0.3％磷酸水
1 0 20 80
1 10 35 65
1 25 45 55
1 30 98 2
1 35 98 2
。

Claims (3)

1.一种治疗白内障的木蝴蝶总黄酮提取物，其中所述提取物含有黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷，并且这6个黄酮类化合物的总含量在提取物中的重量比例大于50％；其中所述提取物，制备方法如下：
取中药木蝴蝶，用20％-95％的乙醇提取，提取物除去乙醇后悬浮于水中，用正丁醇溶剂萃取；
或者，
取中药木蝴蝶，用20％-95％的乙醇提取，提取物除去乙醇后悬浮于水中，上样到空白大孔吸附树脂上，先用水或者低浓度含水乙醇洗脱去除杂质，再用大于50％乙醇洗脱，得到大于60％乙醇洗脱物，回收乙醇，干燥，即得；
或者
取中药木蝴蝶，用20％-95％的乙醇提取，提取物除去乙醇后用含水乙醇溶解吸附到大孔吸附树脂上，挥干乙醇，上样到空白大孔吸附树脂上，先用水或者低浓度含水乙醇洗脱去除杂质，再用大于50％乙醇洗脱，得到大于60％乙醇洗脱物，回收乙醇，干燥，即得。
2.权利要求1所述的木蝴蝶总黄酮提取物的制备方法，步骤如下：
取中药木蝴蝶，加70％乙醇6倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再70％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液，合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质，提取液回收溶剂，干燥，即得提取物，提取物溶解悬浮于水中，用正丁醇萃取3次，回收正丁醇，干燥，即得；
或者
取中药木蝴蝶，加40％乙醇10倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再50％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液，合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质，提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶40％乙醇提取物，取提取物，溶解悬浮于水中，上样到空白中等极性大孔吸附树脂HPD500上，先用10％乙醇洗脱去除杂质，再用80％乙醇洗脱，得到80％乙醇洗脱物，80％乙醇洗脱物回收乙醇，干燥，即得；
或者
取中药木蝴蝶，加70％乙醇6倍量，室温浸泡2小时，然后加热至80～100℃回流提取2小时，分离第一次提取液，再70％乙醇8倍量，加热至80～100℃回流提取1.5小时，分离第二次提取液，合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质，提取液回收溶剂，干燥，即得提取物，取提取物，溶解悬浮于水中，上样到空白非极性大孔吸附树脂HPD100上，先用30％乙醇洗脱去除杂质，再用60％乙醇洗脱，得到60％乙醇洗脱物，60％乙醇洗脱物回收乙醇，干燥，即得；或者
取中药木蝴蝶，加8倍量水，室温浸泡2小时，然后煎煮提取2小时，分离第一次提取液，再加4倍量水，煎煮提取1.5小时，分离第二次提取液，合并两次提取液，采用过滤法除去提取液中的固体杂质，提取液回收溶剂，干燥，即得木蝴蝶水提取物，取提取物，溶解悬浮于水中，上样到空白极性大孔吸附树脂HPD750上，先用水洗脱去除杂质，再用95％乙醇洗脱，得到95％乙醇洗脱物，95％乙醇洗脱物回收乙醇，干燥，即得。
3.权利要求1所述的木蝴蝶总黄酮提取物的测定方法，步骤如下：
1)对照品溶液：分别配制黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品甲醇混合溶剂，使浓度在1-100μg/ml范围内；
2)供试品溶液：称取木蝴蝶总黄酮提取物5-50mg，甲醇溶解，定容到100μg/ml；
3)将对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱色谱仪，得到色谱图，根据色谱图峰面积计算供试品溶液中黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷的含量；
其中，所述高效液相色谱条件如下：ODS色谱柱，检测波长：柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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木蝴蝶总黄酮提取工艺和脂肪酸成分研究;胡殿丽;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》(第6期);第E057-18页，尤其是第14页第1段 *

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