CN112870242A - 雪莲黄酮类组合物在制备治疗关节炎疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及雪莲黄酮类组合物在制备治疗关节炎疾病的药物制剂中的用途，所述雪莲黄酮类组合物包含四种组分，所述四种组分分别为：芦丁、肉豆蔻醚、异槲皮苷、木犀草素‑7‑o‑葡萄糖苷。本发明通过大量的动物实验，证实了本发明提供的黄酮类组合物的药效活性，其可以用于制备各类临床应用的解痛镇痛类药物和关节炎治疗药物，相比于直接应用雪莲制备的中成药制剂来说，其具有药效活性高、临床使用剂量小、见效快、副作用低等效果。药物剂型可以采用常规的片剂或胶囊剂，也可以根据药物组分的特性，制备成吸收率更高、或储存性更佳的一些药物新剂型。

Description

雪莲黄酮类组合物在制备治疗关节炎疾病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药用途的组合物技术领域，尤其是涉及一种雪莲黄酮类组合物及其用途。

背景技术

雪莲花(学名：Saussurea involucrata(Kar.et Kir.)Sch.-Bip.)，因其顶形似莲花，故得名雪莲花，简称雪莲。为菊科、风毛菊属多年生草本，高15-35厘米。根状茎粗，颈部被多数褐色的叶残迹。茎粗壮，无毛。叶密集，基生叶和茎生叶无柄，叶片椭圆形或卵状椭圆形；最上部叶苞叶状，膜质，淡黄色，包围总花序，边缘有尖齿。头状花序10-20个，在茎顶密集成球形的总花序。总苞半球形，直径1厘米；总苞片3-4层，边缘或全部紫褐色。小花紫色。瘦果长圆形。冠毛污白色。花果期7-9月。分布于中国多地高寒地带，俄罗斯及哈萨克斯坦也有分布。生长于高山雪线附近的岩缝、石壁和冰磺砾石滩中，海拔2400-4000米。以天山所产最多，质亦最佳。可作药用，也有一定的观赏价值。

雪莲花现有的品种有绵头雪莲花、大苞雪莲花(又名苞叶雪莲)和水母雪莲花等，雪莲花性温，味甘苦，入肝、脾、肾三经，具除寒、壮阳、调经、止血之功，用于治疗阳痿、腰膝软弱、妇女月经不调、崩漏带下、风湿性关节炎及外伤出血等症。具有通经活血、散寒除湿、止血消肿、排体内毒素等功效。雪莲花含有蛋白质、氨基酸、黄酮类化合物、生物碱等。但是其独特的药效是如何产生以及生效的，一直是研究领域的难点和盲点。

发明内容

本发明以苞叶雪莲为研究对象，深入研究了雪莲花的主要药效成分，成功发现了其最重要的药效组分及配伍，在此基础上，提供了本发明的雪莲黄酮类组合物及其应用。

本发明采用的苞叶雪莲，通过肉眼观察到的性状为：茎直立，无毛。未见基生叶；叶片长椭圆形或长圆形、卵形，长7-20厘米，宽3-6厘米，边缘有细齿，两面有腺毛；茎生叶无柄；最上部茎叶苞片状，膜质，黄色，长椭圆形或卵状长圆形，长达16厘米，宽达7厘米，顶端钝，边缘有细齿，两面被短柔毛和腺毛，包围总花序。头状花序13个，在茎端密集成球形的总花序，无小花梗或有短的小花梗。总苞半球形，直径1-1.5厘米；总苞片4层，外层卵形，中层椭圆形，内层线形。全部苞片顶端急尖，边缘黑紫色，外面被短柔毛及腺毛。小花蓝紫色，长1.8厘米，管部长8毫米，檐部长10毫米。冠毛2层，淡褐色，外层短；糙毛状，长5毫米，内层长，羽毛状，长1.2厘米。

雪莲的药物作用强，但其化学成分复杂，其最主要的药效成分到底是什么一直是研究的难点。雪莲已知的化学成分有黄酮类，生物碱类、倍半萜类及挥发油等，其中黄酮类化合物是雪莲的主要化学成分，具有显著的清除超氧阴离子自由基、清除羟基自由基、对抗NADH过氧化物酶氧化的生物活性，表现出较强的抗氧化、抗辐射、延缓衰老等作用。故而本发明先针对雪莲中的黄酮类物质进行提取和分析。经过长时间复杂的提取、分析、药效试验后，创新性地发现提取自苞叶雪莲的四种黄酮类物质组分具有较强的药效活性，所述四种组分分别为：芦丁、肉豆蔻醚、异槲皮苷、木犀草素-7-o-葡萄糖苷。

同时发现，在对雪莲黄酮类物质的提取组分进行分析时，上述四种组分的重量配伍为芦丁：28-32；肉豆蔻醚：0.8-1.2；异槲皮苷：1.8-2.2；木犀草素-7-o-葡萄糖苷：6.8-7.2，其组成的组合物具有最强的药效活性，更优选的，所述配伍是：芦丁：30；肉豆蔻醚：1；异槲皮苷：2；木犀草素-7-o-葡萄糖苷：7。

在得到上述雪莲黄酮类组分的种类及配伍后，所述组分的提取方法可以采用已知的各种中药提取物的提取方法来进行，其中一种优选的提取方法是：

包括步骤：

(1)醇提：苞叶雪莲全株打粉，加入10倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次1h，过滤后合并提取液，减压回收溶剂，浓缩到原溶液体积的1/50，作为上样液；

(2)精提：取上样液，上样预先处理好的树脂柱后洗脱，洗脱步骤包括：先用水洗树脂柱3BV除杂，再用15％乙醇洗脱8BV除杂，洗脱流速均为3BV/h；最后用40％乙醇洗脱6BV，流速为3BV/h，分别收集40％的1-2BV的洗脱液、40％的3-4BV的洗脱液、40％的5-6BV的洗脱液；

(3)冻干：将收集的洗脱液混合，减压回收溶剂后，用冻干机冻干，得粉末状产物。

所述步骤(2)中树脂柱采用的是AB-8大孔树脂，预先处理步骤包括：先用无水乙醇浸泡24h后湿法装柱，再用乙醇约2.5BV/h流速洗脱至洗脱液加1:5体积的水无浑浊，最后用去离子水约5BV同样流速冲洗至洗脱液无醇味，备用。所述BV指的是树脂柱内装载树脂的体积，称为床容积或床体积(bed volume)，简写为BV。

本发明通过大量的动物实验，证实了本发明提供的黄酮类组合物的药效活性，其可以用于制备各类临床应用的解痛镇痛类药物和关节炎治疗药物，相比于直接应用雪莲制备的中成药制剂来说，其具有药效活性高、临床使用剂量小、见效快、副作用低等效果。药物剂型可以采用常规的片剂或胶囊剂，也可以根据药物组分的特性，制备成吸收率更高、或储存性更佳的一些药物新剂型。

附图说明

图1是雪莲纯化物正离子模式下的BPI图(进样两次重复性良好)；

图2是雪莲纯化物负离子模式下的BPI图(进样两次重复性良好)；

图3是正离子模式下的BPI图；

图4是小鼠经口灌胃给药；

图5是小鼠尾静脉注射给药；

图6是小鼠腹腔注射给药；

图7是小鼠扭体；

图8是足趾肿胀照片；

图9是足趾肿胀测量照片。

具体实施方式

下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。

实施例1苞叶雪莲中黄酮类物质的提取

1.1雪莲药材的醇提

取雪莲药材6株，打粉前后称重如下：1号：28.5g，28.3g；2号：16.3g，16.5g；3号：13.3g，13.5g；4号：15.6g，15.7g；5号：23.1g，23.2g；6号：14.6g，14.7g。粉末共计：111.9g，10倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次1h，8层纱布滤过，合并提取液。

1.2配制上样液

提取液减压回收溶剂，即得上样液约70mL。

2精提

2.1选用AB-8大孔树脂(95％乙醇浸泡24h)柱子内径约为2.5cm，径高比为1:10。将大孔树脂用无水乙醇浸泡24h后湿法装柱，装柱前需在树脂柱底部塞一层棉花，并用无水乙醇浸湿。用乙醇约2.5BV/h速洗脱至洗脱液加五倍的水(1:5)无浑浊。用去离子水约5BV同样流速冲洗至洗脱液无醇味，备用。

2.2将水洗的液面放齐平，然后上样。

2.3先用水洗树脂柱3BV除杂，再用15％乙醇洗脱8BV除杂，洗脱流速均为3BV/h。最后用40％乙醇洗脱6BV，流速为3BV/h，分别收集40％的1-2BV的洗脱液、40％的3-4BV的洗脱液、40％的5-6BV的洗脱液。

2.4将洗脱液减压回收溶剂后，用冻干机冻干，得粉末状产物。

实施例2实施例1得到的粉末状产物的分析鉴定

1.仪器与试剂

Waters Acquity UPLC Class H超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters G2Q-TOF/MS高分辨质谱仪(美国Waters公司)，Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)(美国Waters公司)；数据处理软件4.1MassLynx；乙腈(质谱级，FisherScientific公司)；屈臣氏超纯水(广州屈臣氏食品饮料有限公司))；甲酸(质谱级，FisherScientific公司)

2方法

2.1溶液的配制

供试品溶液的制备：精密称定总提取物0.02054g置于10mL容量瓶中，加40％乙醇定容，混匀，12000r/min高速离心15min，取上清液，即得供试品溶液。

2.2分析条件

色谱柱：WatersAcquity UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；检测波长为360nm；进样体积为2μL。流动相：A相为0.1％甲酸乙腈，B相为0.1％甲酸水，采用梯度洗脱，具体洗脱条件如下表。

色谱条件：流速：0.3mL/min；柱温：30℃

时间(min)	A(0.1％甲酸乙腈)％	B(0.1％甲酸水)％
			0	5	95
4	9	91
			10	13	87
20	16	84
			30	17	83
35	28	72
			40	95	5
43	5	95

质谱条件，采用ESI离子源MSE正离子模式：离子源温度120℃；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流速600L/h；锥孔气体流速50L/h；锥孔电压40V；毛细管电压3.0kV高能通道；碰撞电压20～75eV。MSE扫描模式：质量扫描范围m/z 50～1 200；扫描时间0.2s。为确保精确的质量测定，使用亮氨酸-脑啡肽作为外标在数据收集期间进行质量校正，可产生碎片离子m/z 556.2771[M+H]+。使用MassLynx V4.1软件进行数据采集与分析。

3结果及分析

雪莲纯化物正离子模式下的BPI图见图1，负离子模式下BPI图见图2。

解析正离子模式下的色谱图，见图3。

正离子模式解析结果见表1：

实施例3雪莲黄酮类组合物的组分及配伍

由实施例2分析鉴定可以得到，本发明的提取方法得到的雪莲纯化物中主要含有4种黄酮类物质，分别是：芦丁：肉豆蔻醚：异槲皮苷：木犀草素-7-o-葡萄糖苷，且他们之间的重量比为30:1:2：7。

实施例4实施例3的黄酮类组合物的药效试验(镇痛作用)

目的:通过实施例3的黄酮类组合物对醋酸致小鼠疼痛模型的治疗作用，评价实施例3的黄酮类组合物的药效学。

方法:将小鼠随机分为5组，分别为模型对照组(7只)、阳性药对照组、实施例3的黄酮类组合物高剂量组、实施例3的黄酮类组合物中剂量组、实施例3的黄酮类组合物低剂量组，每组9只，实施例3的黄酮类组合物尾静脉给药组(7只)。分组当天给药，每日1次，连续3d，对照组在同等条件下给予生理盐水灌胃。末次给药1小时后，各鼠腹腔注射1％的乙酸(冰醋酸)0.2ml/只，观察20分钟内各小鼠出现典型扭体的次数，结果采用组间比较t检验进行统计。

结果:实施例3的黄酮类组合物应用在醋酸致小鼠疼痛模型实验中，可明显降低小鼠的扭体次数，并具有很好的量效关系依赖性。

结论:实施例3的黄酮类组合物具有明显的镇痛作用。

1试验材料

1.1试验动物

BALB/c小鼠(SPF级)，北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物生产许可证：SCXK(京)2016-0006，日龄：42-62日，雄性62只，动物合格证编号：No.1100111911022372。

1.2药物和试剂

1.2.1实施例3的黄酮类组合物，淡土黄色粉末，避光干燥保存，试验中按照60mg/kg，30mg/kg，15mg/kg计量经口灌胃给药，生理盐水溶解配制，给药体积为：0.1ml/10g。

1.2.2阳性药物，双氯芬酸钠缓释片(商品名：扶他林)，由北京诺华药业有限公司生产，国药准字H10980297，避光干燥保存，浅粉色三角形薄膜衣片，75mg/片，实验中的给药剂量为：5mg/kg。生理盐水溶解，经口灌胃给药。

1.2.3溶剂：氯化钠注射液，规格：250ml 2.25g，性状：液体，保存条件：密闭保存，包装：软包袋装，批准文号：H13023201，生产单位：石家庄四药有限公司

1.2.4造模药物：乙酸(冰醋酸)(分析纯含量99.5％)英文名称:Aceticacid，分子式:C2H4O2；CH3COOH，分子量:60.05(按1985年国际原子量)，密度:1.0492沸点:117.9℃，CAS号:64-19-7天津致远化学试剂有限公司

1.3试验仪器

电子天平Sartorius公司，型号：BSA3202S-CW；

电子天平，METTLER-TOLEDO，型号：LE204；

小动物体重天平，上海越平科学仪器有限公司，型号：YP1002；移液器：eppendorf(艾本德)；

IVC小鼠饲养笼，苏州教学笼具厂产品

高清成像系统，佳能(Canon)EOS 5D

2、实验方法

2.1醋酸致小鼠疼痛模型的制备

购进Balb/c小鼠12只，用生理盐水配置乙酸(冰醋酸)溶液，浓度分别设置为0.6％、0.7％、0.8％、1％，每个浓度分别注射3只小鼠，腹腔注射给药0.2ml/只，作为模型构建预实验，给药后立即观察，应用摄像机视频记录给药后20分钟内各只小鼠出现典型扭体的次数，找出扭体次数适中的给药剂量。预实验结果表明，0.7％给药剂量为最合适的剂量。

2.2醋酸致小鼠疼痛模型药效实验方法

取Balb/c小鼠50只，按体重随机分为模型阴性对照组7只(给予生理盐水)、阳性药对照组(5mg/kg)，每组9只，试验药品实施例3的黄酮类组合物三个灌胃剂量组(60mg/kg剂量组，30mg/kg剂量组，15mg/kg剂量组)，每组9只，试验药品实施例3的黄酮类组合物以30mg/kg剂量尾静脉注射组，7只。各组灌胃给药或尾静脉注射给药，频率均为每天1次，连续3天，对照组在同等条件下给药生理盐水灌胃。末次给药1小时后，各鼠腹腔注射0.7％的乙酸(冰醋酸)，0.2ml/只，观察20分钟内各小鼠出现典型扭体的次数，计算扭体抑制率。

2.3实验过程照片

图4是小鼠经口灌胃给药，图5是小鼠尾静脉注射给药，图6是小鼠腹腔注射给药，图7是小鼠扭体(表现形式：腹部内凹，躯干后肢伸张、臀部抬起等反应)。

3、实验结果

3.1统计方法

采用SPSS13.0统计软件包处理数据，各组数据均以均数加减标准差

表示；结果采用组间比较t检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义

3.2统计结果

表2对醋酸所致小鼠疼痛模型的影响

与模型对照组比较：*P<0.05；**P<0.01

表2结果显示：注射醋酸后，各给药组小鼠的扭体数均明显少于模型对照组，与模型对照组比较均有显著性差别(P<0.05、P<0.01)。

4结论

在醋酸致小鼠疼痛模型药效实验中，实施例3的黄酮类组合物高、中、低剂量组及尾静脉中剂量组均有显著的阵痛效果，各给药组均可以大幅度减少小鼠的扭体次数，且表现出良好的量效相关性。

实施例5实施例3的黄酮类组合物的药效试验(关节炎治疗作用)

目的:通过实施例3的黄酮类组合物对弗氏完全佐剂(CFA)致关节炎小鼠模型的治疗作用，评价实施例3的黄酮类组合物的药效。

方法:小鼠均于左后足趾皮内一次性注射弗氏完全佐剂30μL以建立佐剂性关节炎小鼠模型。以小鼠造模侧、对侧和前爪足跖明显肿胀，受累关节畸形，行动不便且体质量明显下降判定为造模成功。造模24h后，剔除造模失败的小鼠后，将所有造模成功的小鼠随机分为5组，分别为模型对照组(7只)、阳性药对照组、实施例3的黄酮类组合物高剂量组、实施例3的黄酮类组合物中剂量组、实施例3的黄酮类组合物低剂量组，每组9只，实施例3的黄酮类组合物尾静脉给药组(7只)。分组当天给药，每日1次，连续10d，对照组在同等条件下给予生理盐水灌胃。记录动物状态，用游标卡尺测量足趾肿胀厚度，记录数据，结果采用组间比较t检验进行统计。

结果:实施例3的黄酮类组合物应用在佐剂性关节炎小鼠模型实验中，可明显降低小鼠的关节肿胀程度，并具有很好的量效关系依赖性。

结论:实施例3的黄酮类组合物具有明显的降低关节肿胀作用。

1试验材料

1.1试验动物

BALB/c小鼠(SPF级)，斯贝福(北京)生物技术有限公司。实验动物生产许可证：SCXK(京)2016-0002，日龄：42-56日，雄性50只，动物合格证编号：No.1103241911021019。

1.2药物和试剂

1.2.1实施例3的黄酮类组合物，黄白色粉末，避光干燥保存，试验中按照60mg/kg，30mg/kg，15mg/kg计量经口灌胃给药，生理盐水溶解配制，给药体积为：0.1ml/10g。

1.2.2阳性药物，双氯芬酸钠缓释片(商品名：扶他林)，由北京诺华药业有限公司生产，国药准字H10980297，避光干燥保存，浅粉色三角形薄膜衣片，75mg/片，实验中的给药剂量为：5mg/kg。生理盐水溶解，经口灌胃给药。

1.2.3溶剂：氯化钠注射液，规格：250ml 2.25g，性状：液体，保存条件：密闭保存，包装：软包袋装，批准文号：H13023201，生产单位：石家庄四药有限公司

1.3试验仪器

电子天平Sartorius公司，型号：BSA3202S-CW；

电子天平，METTLER-TOLEDO，型号：LE204；

小动物体重天平，上海越平科学仪器有限公司，型号：YP1002；移液器：eppendorf(艾本德)；

IVC小鼠饲养笼，苏州教学笼具厂产品

高清成像系统，佳能(Canon)EOS 5D

2、实验方法

2.1佐剂性关节炎小鼠模型的制备

小鼠均于左后足趾皮内一次性注射弗氏完全佐剂30μL以建立佐剂性关节炎小鼠模型。以小鼠造模侧、对侧和前爪足跖明显肿胀，受累关节畸形，行动不便且体质量明显下降判定为造模成功

2.2佐剂性关节炎小鼠模型药效实验方法

随机分组后，分为模型对照组7只(给予生理盐水)、阳性药对照组(5mg/kg)，每组9只，试验药品DrugX三个灌胃剂量组(60mg/kg剂量组，30mg/kg剂量组，15mg/kg剂量组)，每组9只，试验药品DrugX以30mg/kg剂量尾静脉注射组，7只。各组灌胃给药或尾静脉注射给药，频率均为每天1次，连续10天，对照组在同等条件下给药生理盐水灌胃。定期观察动物状态，用游标卡尺测量小鼠足趾肿胀厚度。足趾肿胀照片见图8，足趾肿胀测量照片见图9。

3、实验结果

3.1统计方法

采用SPSS13.0统计软件包处理数据，各组数据均以均数加减标准差

表示；结果采用组间比较t检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

3.2统计结果

表3对佐剂性关节炎小鼠模型的影响

组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	肿胀增殖率％
				模型对照组	-	7	13.23±12.81
DrugX高剂量	60	9	-2.17±14.59*
				DrugX中剂量	30	9	0.08.±6.52*
DrugX中剂量注射	30	7	4.31.±10.54
				DrugX低剂量	15	9	6.45±13.34
阳性药	5	9	6.41±5.57

与模型对照组比较：*P<0.05

表3结果显示：各给药组对关节炎小鼠的足趾肿胀均有不同程度的抑制，其中DrugX中剂量组、DrugX高剂量组与模型对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。

4结论

在佐剂性关节炎小鼠模型药效实验中，实施例3的黄酮类组合物高、中、低剂量组及中剂量注射组均有抑制小鼠足趾肿胀的作用，且表现出良好的量效相关性，其中化合物高剂量组、中剂量组具有显著性。

实施例6

为进一步证明本发明雪莲黄酮类组合物的作用，实施例6在实施例3得到的组分配伍的基础上，采用商购四种化合物，复配成本申请的组合物，再进行药效试验，试验过程与实施例4和实施例5的试验过程一致，在此不再赘述，复配比例与试验结果如下表所示：

表4组合物组分及复配比例(重量比)

组分	芦丁	肉豆蔻醚	异槲皮苷	木犀草素-7-o-葡萄糖苷
					复配比例	30	1	2	7

表5对醋酸所致小鼠疼痛模型的影响

与模型对照组比较：*P<0.05；**P<0.01

表6对佐剂性关节炎小鼠模型的影响

组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	肿胀增殖率％
				模型对照组	-	7	14.45±11.80
DrugX高剂量	60	9	-1.40±11.37*
				DrugX中剂量	30	9	-2.45±8.99**
DrugX中剂量注射	30	7	-2.58±10.96*
				DrugX低剂量	15	9	-1.67±11.83*
阳性药	5	9	-0.05±7.99*

与模型对照组比较：*P<0.05

从表5和表6可以看出，直接采用四种化合物复配后的黄酮类组合物仍然具有很好的镇痛作用和治疗关节炎的作用。

虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。

Claims (6)

1.雪莲黄酮类组合物在制备治疗关节炎疾病的药物制剂中的用途，其特征在于，所述组合物包含四种组分，所述四种组分分别为：芦丁、肉豆蔻醚、异槲皮苷、木犀草素-7-o-葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述四种组分在组合物中所占的重量比是：

芦丁：28-32；肉豆蔻醚：0.8-1.2；异槲皮苷：1.8-2.2；木犀草素-7-o-葡萄糖苷：6.8-7.2。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述四种组分在组合物中所占的重量比是：

芦丁：30；肉豆蔻醚：1；异槲皮苷：2；木犀草素-7-o-葡萄糖苷：7。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物是从苞叶雪莲提取得到的。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物制剂是片剂。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物制剂是胶囊剂。

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