CN105687282A - 红花抗帕金森病有效部位滴丸及其制备方法 - Google Patents

红花抗帕金森病有效部位滴丸及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红花抗帕金森病有效部位滴丸及其制备方法，属于滴丸的制备领域。本发明红花抗帕金森病有效部位滴丸，由红花抗帕金森病有效部位提取物和基质PEG6000制成，包括：将基质加热至熔融，然后将红花抗帕金森病有效部位提取物加入熔融基质中，搅拌均匀得到熔融药液；将熔融药液滴入冷凝剂中，收缩成型，即得。本发明对滴丸制备中的药质比、滴距、滴速和冷凝剂温度等进行了优化，使所制备的滴丸圆整度和光泽度好、稳定性良好，崩解时限短，溶出量大。本发明红花抗帕金森病有效部位滴丸能减轻PD大鼠模型的PD症状，有效起到保护神经细胞作用，服用方便，起效快、生物利用度高，能够用于帕金森病等神经退行性疾病的预防和治疗。

Description

红花抗帕金森病有效部位滴丸及其制备方法
技术领域
本发明涉及滴丸，尤其涉及红花抗帕金森病有效部位滴丸，本发明还涉及所述红花抗帕金森病有效部位滴丸的制备方法，属于滴丸的制备领域。
背景技术
帕金森病(Parkinson’sDisease，PD)是仅次于阿尔茨默病(Alzheimer’sDisease，AD)的第二大常见的神经退行性疾病，平均发病年龄为60～80岁，其临床表现为肌强直、静止性震颤、运动性迟缓及姿态障碍等。目前，PD发病的确切机理仍不清楚，其主要原因是在神经元变性死亡过程中启动了以氧化应激、线粒体功能障碍、炎症、兴奋性毒素作用等病理机制。对于PD疾病的治疗措施主要分为药物治疗和非药物治疗两大类，后者包括神经外科手术、脑深部电刺激、基因治疗等，现阶段仍以药物治疗为主。已有研究表明，中药(包括单复方制剂、中药有效部位提取物、单体化合物)在治疗PD疾病时，具有一定的优势，比如改善PD患者症状，延缓发病进程，减轻西药副作用等。因此，中药治疗PD疾病值得深入探索和研究。
红花为菊科红花属植物红花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花，是一年生草本植物。在中国，红花是一味传统中药，《本草纲目》中记载红花能“活血、润燥、止痛、散肿通经”。中医上认为红花味辛、微苦、性温归心和肝经，具有活血通经、散瘀止痛、降血压、降血脂功效，在现代临床中成为预防和治疗冠心病、心肌梗死和脑血栓等疾病的重要中药。从20世纪初起，各国对红花的化学成分进行了逐步深入的研究，已分离鉴定的化学成分有60多种，其中主要结构类型有醌式查尔酮苷类、黄酮类、生物碱类、有机酸类和木脂素类等，其中以黄酮类化合物的研究较深入。
目前已有研究表明红花黄酮类提取物具有确切的预防或治疗PD疾病的功效，经实验发现，提取物中的山奈酚-3-O-芸香糖苷(Kaempferol-3-O-rutinoside，K3R)，脱水红花黄色素B(AnhydrosaffloryellowB，AYB)，6-羟基山奈酚-3,6-二-O-葡糖糖苷(6-hydroxykaempferol-3,6-di-O-glucoside)等具有与DJ-1蛋白结合的作用。DJ-1蛋白的基因突变与人类常染色体隐性遗传早发型PD相关，能够调节抗氧化应激相关基因的表达。因此，将红花抗帕金森病有效部位的提取物制备成服用方便，起效快、生物利用度高的口服剂型，对于满足临床治疗和患者的使用需求具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种红花抗帕金森病有效部位滴丸，该滴丸的圆整度和光泽度好、稳定性良好，溶出量大、溶散时限短，且其制备方法简单，能够用于帕金森症等神经退行性疾病的预防和治疗。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种红花抗帕金森病有效部位滴丸，由以下原料制成：红花抗帕金森病有效部位提取物和基质。其中，按照质量比计，红花抗帕金森病有效部位提取物：基质＝1：1-25；优选为1：4-18。更优选的，按照质量比计，红花抗帕金森病有效部位提取物：基质＝1：5-12；最优选为1：10。
本发明所述基质为聚乙二醇6000(PEG6000)或聚乙二醇4000(PEG4000)中的任意一种；优选为PEG6000。PEG6000为亲水性基质，性质稳定，对人体无毒无害，且可增加某些药物的溶出速率，提高生物利用度。
本发明通过比较基质PEG6000和PEG4000，发现基质PEG4000不适于制备红花抗帕金森病有效部位的滴丸。当基质为PEG4000，按药质比1：1-4滴制时，药液粘稠，滴头堵塞，不易流出；而按照药质比1：5-20，滴制成型的滴丸硬度和圆整度较差，易变形。
本发明进一步对基质为PEG6000时的药质比进行筛选，结果表明，按药质比(质量比)1：5-12制备的滴丸，滴制容易，圆整度和光泽度好，硬度适中，收丸率达到90％以上，崩解时限在8-10min；其中，按药质比1：10制备的滴丸质量最佳，收丸率达到97％以上，平均崩解时限为7.8min±0.2min，具有快速崩解的特性，符合《中华人民共和国药典》2010版规定。而按药质比1：1-4滴制时，药液粘稠，滴头堵塞，滴制困难，易拖尾；按药质比1：13-25时，随着基质PEG6000的比例增加，滴丸的载药量降低，有效成分含量降低，服药量增加。
本发明所述红花抗帕金森病有效部位提取物的主要化学成分包括：山奈酚-3-O-芸香糖苷(kaempferol-3-O-rutinoside，K3R)或脱水红花黄色素B(AnhydrosaffloryellowB，AYB)中的任意一种或两种按照任意比例组成的混合物。进一步实验结果表明，以有效成分为目标化合物提取的红花抗帕金森病有效部位提取物中的化学成分包括：山奈酚-3-O-芸香糖苷、脱水红花黄色素B、羟基红花黄色素A及其异构体、红花黄色素C及其异构体、前红花苷、山奈酚-3-O-β-槐糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及一些黄酮类和亚精胺类等中的一种或多种按照任意比例组成的混合物。本发明根据提取物中山奈酚-3-O-芸香糖苷所占的比例和药效学活性确定以山奈酚-3-O-芸香糖苷为滴丸质量控制中用于测定的目标化合物。
本发明所述红花抗帕金森病有效部位提取物的制备方法包括：(1)将红花用乙醇提取，得到提取液；(2)将提取液上大孔树脂，用乙醇洗脱，收集洗脱产物，冷冻干燥，即得。
其中，步骤(1)用体积比为50％乙醇提取；提取时间为2-3h，提取1-2次；步骤(2)所述大孔树脂的填料型号为AB-8，柱体积(BV)＝17L，20cm*55cm；所述用乙醇洗脱包括：按照体积比计，依次用10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、95％乙醇洗脱；所述收集洗脱产物为收集30％乙醇洗脱产物。
本发明进一步公开了一种所述红花抗帕金森病有效部位滴丸的制备方法，包括以下步骤：(1)将基质加热至熔融，得到熔融基质；(2)按照所述比例，将红花抗帕金森病有效部位提取物加入熔融基质中，搅拌均匀，得到熔融药液；(3)将熔融药液滴入冷凝剂中，收缩成型，去除滴丸表面冷凝剂，干燥，即得。
其中，步骤(1)所述加热是50-90℃水浴加热，优选为70-85℃水浴加热。步骤(3)所述将熔融药液滴入冷凝剂中的滴距为4-12cm，滴速为每分钟6-60滴；优选的，滴距为6-8cm，滴速为每分钟20-40滴；更优选的，滴距为6cm，滴速为每分钟30-40滴。步骤(3)所述冷凝剂的温度为6-13℃，优选为6-10℃；所述冷凝剂选自二甲基硅油、液体石蜡或植物油中的任意一种或几种按照任意比例组成的混合物。采用纸屑擦拭法或离心法去除滴丸表面冷凝剂。
本发明为了获得较佳质量的滴丸，对滴丸制备方法中的滴距、滴速和冷凝剂的温度进行了筛选。滴距筛选结果表明，滴距为6-8cm，液滴间距均匀、匀速沉降，滴丸大小一致，圆整度较好；其中，滴距为6cm，滴丸的重量差异小于5％，圆整度最好；当滴距大于10cm，滴丸易摔裂，导致大小不一、圆整度差。滴速筛选结果表明，滴速越慢，滴丸质量越小；滴速越快，滴丸容易粘连成串；只有每分钟30-40滴，制备的滴丸平均丸重22.3mg，没有一丸超出重量差异限度，符合《中华人民共和国药典》2010版规定。冷凝温度筛选结果表明，冷凝温度过高，滴丸内部未骤冷成固体，易形成半固体状；冷凝温度为6-10℃较适宜。
本发明利用扫描电镜(SEM)对红花抗帕金森病有效部位滴丸的粉末和剖面观察表明，本发明滴丸中药物与基质形成了大小均一的粉末颗粒，结构紧密，呈现高度分散的状态，说明药物以无定形粉末状态高度分散在基质PEG6000中，溶出速率增加。滴丸横断面上条纹清晰，致密，均匀且不存在老化现象。
本发明红花抗帕金森病有效部位滴丸在pH＝1(人工胃液)、pH＝6.8(人工肠液)、pH＝7.4三个不同pH值的溶出介质中的平均溶出量均在96％以上。且本发明滴丸在剧烈的外界条件下(高温、高湿、强光照射以及加速试验等)具有较好的稳定性。
本发明通过体外细胞实验发现，与阳性药依达拉奉(Edaravone，EDA)相比较，目标成分山奈酚-3-O-芸香糖苷(Kaempferol-3-O-rutinoside，K3R)和脱水红花黄色素B(AnhydrosaffloryellowB，AYB)在PD细胞模型中能够起到保护神经细胞的作用。体内实验表明，本发明制备的滴丸能够减轻PD大鼠模型的PD症状；解剖发现其能够明显抑制大鼠脑部黑质部位多巴胺能神经元的凋亡或坏死。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明红花抗帕金森病有效部位滴丸的物理化学性质明确，具有溶散时限短，溶出量大，质量易于控制、稳定性好等优点，且其制备方法简单。另外，将红花抗帕金森病有效部位提取物制备成口服剂型滴丸，使用方便，起效快、生物利用度高，不仅能够满足临床治疗和患者的使用需求，而且能够更有效的用于帕金森症等神经退行性疾病的预防和治疗。
附图说明
图1为山奈酚-3-O-芸香糖苷和脱水红花黄色素B的结构图；
图2为红花抗帕金森病有效部位滴丸的傅里叶红外光谱扫描图谱；
图3为红花抗帕金森病有效部位滴丸的粉末X-射线衍射图谱；
图4为红花抗帕金森病有效部位滴丸的差式扫描量热分析图谱；
图5为红花抗帕金森病有效部位滴丸的扫描电镜图；
其中，在图2、图3、图4、图5中，(1#)红花抗帕金森病有效部位提取物；(2#)药物与基质按处方比例的物理混合物；(3#)红花抗帕金森病有效部位滴丸；(4#)空白基质PEG6000；
图6为红花抗帕金森病有效部位滴丸剖面的扫描电镜图；
图7为阳性药依达拉奉(Edaravone，EDA)与山奈酚-3-O-芸香糖苷(K3R)及脱水红花黄色素B(AYB)对帕金森病细胞模型的药效学结果；
图8为红花抗帕金森病有效部位滴丸对APO诱导的PD大鼠模型旋转行为影响；
图9为红花抗帕金森病有效部位滴丸(SAFE)对PD大鼠模型黑质部位多巴胺能神经元的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
预备实施例1红花中以山奈酚-3-O-芸香糖苷和脱水红花黄色素B为目标成分的提取物的制备
药材提取：称取9kg红花药材，用8L50％乙醇浸泡2-3h，加热回流30min，提取2次，合并提取液，减压浓缩，用去离子水稀释至浓度为1g/ml的清膏4.5L。
大孔树脂的分离：填料型号AB-8，柱体积(BV)＝17L，20cm*55cm。10％乙醇洗脱7BV；30％乙醇洗脱13BV；50％乙醇洗脱7BV；95％乙醇冲柱子，液相检测合并流份。
将30％乙醇洗脱得到的红花抗帕金森病有效部位浸膏经过真空冷冻干燥后制成冻干粉末。
此红花抗帕金森病有效部位的提取物中主要化学成分有山奈酚-3-O-芸香糖苷、脱水红花黄色素B(山奈酚-3-O-芸香糖苷和脱水红花黄色素B的结构图见图1)、羟基红花黄色素A及其异构体、红花黄色素C及其异构体、前红花苷、山奈酚-3-O-β-槐糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及一些黄酮类和亚精胺类等。根据提取物中山奈酚-3-O-芸香糖苷所占的比例和药效学活性确定以山奈酚-3-O-芸香糖苷为滴丸质量控制中用于测定的目标化合物。
实施例1红花抗帕金森病有效部位滴丸的制备
采用熔融法制备。将预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位浸膏的冻干粉末轻柔研磨过100目尼龙筛，孔径150μm，按一定比例准确称取过筛后的药物粉末和PEG6000，先将PEG6000于70℃水浴加热至熔融状态，按药质比1：10(质量比)的比例少量多次加入药物粉末，充分搅拌均匀后静置30min，然后将药液加入滴丸机的贮液灌。
调节滴距6cm、滴速每分钟30～40滴。冷凝剂为二甲基硅油，冷凝温度10℃，待滴丸成型后，采用纸屑擦拭法或离心法去除表面冷凝剂，避光存放。测定滴丸丸重22.3mg，按照《中华人民共和国药典》2010版一部附录IK滴丸剂项下重量差异检查法测定本实验滴丸，未有一丸超出重量差异限度，滴丸丸重差异符合药典规定。按照《中华人民共和国药典》2010版一部附录XΙΙA崩解时限检查法对制备的滴丸进行崩解时限检查，均在10min以内溶散，具有快速崩解的特性，且符合《中华人民共和国药典》2010版规定。
实施例2红花抗帕金森病有效部位滴丸的制备
采用熔融法制备。将预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位浸膏的冻干粉末轻柔研磨过150目尼龙筛，孔径90μm，按一定比例准确称取过筛后的药物粉末和PEG6000，先将PEG6000于70℃水浴加热至熔融状态，按药质比1：10(质量比)的比例少量多次加入药物粉末，充分搅拌均匀后静置30min，然后将药液加入滴丸机的贮液灌。
调节滴距6cm、滴速每分钟30～40滴。冷凝剂为液体石蜡和二甲基硅油的混合物，冷凝温度8℃，待滴丸成型后，采用纸屑擦拭法或离心法去除表面冷凝剂，避光存放。按照《中华人民共和国药典》2010版一部附录ⅫA崩解时限检查法对制备的滴丸进行崩解时限检查，均在10min以内溶散，具有快速崩解的特性，符合《中华人民共和国药典》2010版规定。
实施例3红花抗帕金森病有效部位物理混合物的制备
将预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位浸膏的冻干粉末和基质PEG6000分别过100目尼龙筛(孔径150μm)，按照实施例1中滴丸的药物与基质比例1：10(质量比)，将二者物理混合均匀，避光存放。
实施例4红花抗帕金森病有效部位滴丸的物相表征
分别称取1.0g按实施例1中制备方法制备的滴丸，预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位的提取物，空白基质PEG6000，实施例3制备的物理混合物四个样品，分别按照各个仪器的操作方法进行傅里叶红外光谱扫描、粉末X-射线衍射、差式扫描量热、扫描电镜等物相鉴定。
本发明将制备的红花提取物滴丸经傅里叶红外光谱扫描(FTIR)后的结果表明(图2)，基质PEG6000会使药物吸收峰发生一定的位移改变；滴丸与其物理混合物的红外图谱的吸收峰几乎一致，说明在滴丸中，药物与载体间未发生化学反应。
本发明利用粉末X-射线衍射(PXRD)和差式扫描量热法(DSC)实验结果判断出红花抗帕金森病有效部位提取物中多个化合物存在且都以微晶或无定形的状态存在，没有固定的相变温度，因此，在PXRD图中滴丸和物理混合物中都只观察到基质PEG6000的强吸收峰，在DSC图中也只观察到PEG6000的吸热峰(图3、图4)。
本发明利用扫描电镜(SEM)对滴丸的粉末和剖面进行了观察(图5、图6)。结果表明，红花提取物是大小不均的粉末颗粒，比表面积小，因此其溶解度、溶出度和溶出速率都较低。基质PEG6000呈现出非晶形的不规则颗粒。物理混合物中，既能观察到药物的粉末又能观察到PEG6000的不规则块状物，粉末多以物理吸附的方式吸附在PEG6000上。在滴丸中，药物与基质形成了大小均一的粉末颗粒，呈现高度分散的状态，说明药物以无定形粉末状态高度分散在基质PEG6000中，溶出速率增加。从剖面图中可看到滴丸横断面上条纹清晰，致密，均匀且不存在老化现象(图6)。
目标成分山奈酚-3-O-芸香糖苷和脱水红花黄色素B与基质PEG6000形成了固体分散体。
实施例5滴丸中目标成分山奈酚-3-O-芸香糖苷的测定
仪器色谱柱：AlltimaHP-C18column(5μm，250mm×4.6mm)；流动相：乙腈：甲醇＝9:1(A)，0.3％HCOOH水溶液(B)；二元梯度洗脱：0-15min：16％-18％(A)；15-25min：18％-19％(A)；25-30min：19％-20％(A)；30-32min：20％(A)。
紫外检测波长：345nm；流速：1.0ml/min；柱温：20℃(室温)。进样10μl。
线性考察经实验考察，山奈酚-3-O-芸香糖苷在线性范围12.5～400μg/ml的范围内有良好的线性关系，线性方程为Y＝18638X-31535，相关系数R2＝0.9999。
含量测定将实施例1中制备的三批滴丸分别研磨成粉，各自精密称取滴丸粉末110mg，精密加入50％甲醇4ml，超声提取20min，放置室温，摇匀，用微孔滤膜(0.22μm)滤过，取续滤液按上述色谱条件检测，进样10μl。由线性方程计算红花提取物滴丸中山奈酚-3-O-芸香糖苷的标示含量为0.10mg/粒。
实施例6滴丸含量均匀度测定
随机取实施例1中制备的红花抗帕金森病有效部位滴丸10粒，每粒中分别加入2ml、50％甲醇，后续提取与处理方法同上述实施例5滴丸含量测定中供试液的制备。
按照《中华人民共和国药典》2010版二部附录XE含量均匀度检查法检查，10粒滴丸中山奈酚-3-O-芸香糖苷的相对含量平均值为99.60％，符合药典规定。
实施例7滴丸溶出度测定
根据国家食品药品监管总局制定的《普通口服固体制剂溶出度试验技术指导原则》，设计本实验。
根据《中华人民共和国药典》2010版二部附录XC溶出度测定法，本实验选用第一法(篮法)进行实验。
采用RC-8DS溶出仪，向6个溶出杯中分别加入900ml溶出介质，设定介质温度为37℃，转速100r/min，取样时间45min。待溶出介质温度恒定在37℃±0.5℃后，取实施例1中制备的红花抗帕金森病有效部位滴丸6份(每份30粒)，分别投入6个干燥的转篮中，每个转篮一份。将其同时分别放入6个溶出杯中，盖好杯盖，溶出开始。
待取样时间到后，立即用6个连有取样针的新注射器分别从6个溶出杯中吸取2ml溶出液(取样位置在转篮顶端至液面的中点，距溶出杯内壁10mm处)，用微孔滤膜(0.22μm)滤过，取续滤液待测。
样品测定按上述HPLC方法进行，进样10μl。检测结果表明，红花抗帕金森病有效部位滴丸在pH＝1(人工胃液)、pH＝6.8(人工肠液)、pH＝7.4三个不同pH值的溶出介质中溶出量均大于96％。说明，本制剂在胃肠血液中均有很好地释放。
实施例8红花抗帕金森病有效部位滴丸稳定性试验
取实施例1中制备的红花抗帕金森病有效部位滴丸，参照《中华人民共和国药典》2010版和《中药、天然药物稳定性研究技术指导原则》设计试验。
(1)高温试验
将供试品去除最小剂量包装，置于温度控制箱中，在40℃、RH50％±5％条件下放置10天，于0、5、10天取样检测。
试验结果表明，本制剂在此试验条件下，外观性状，溶散时限，标示含量均未发生明显变化。
(2)高湿试验
将供试品去除最小剂量包装，置于恒湿设备中，在25℃、RH75％±5％的条件下放置10天，于0、5、10天取样检测。检测项目应包括吸湿增重。
试验结果表明，本制剂在此试验条件下，外观性状、吸湿增重、溶散时限，标示含量与0天相比均未有明显差异。
(3)强光照射试验
将供试品去除最小剂量包装，置于光照箱中，于照度为4500lx±500lx条件下放置10天，于0、5、10天取样检测。试验控制温度为室温25℃。
试验结果表明，本制剂在此试验条件下，外观性状，溶散时限，标示含量均未发生明显变化。
(4)加速试验
将三批滴丸分别按市售包装放置于药品稳定性试验箱中，在40±2℃、RH75％±5％的条件下进行试验，在试验期间第0、1、2、3、6个月末取样检测。
结果表明，本制剂在上述实验条件下，外观，溶散时限，标示含量均未发生明显变化。
实施例9红花提取物中有效成分在预防或治疗帕金森病细胞模型上的应用
将高分化的PC12细胞转移至培养瓶中，加入完全培养基(RIMI1640培养基中含有体积分数为10％胎牛血清，1％100U/ml青霉素和链霉素)放置37℃、5％CO2的孵箱中培养。待细胞在瓶中增长至80％左右融合时，用0.25％胰酶溶液(含0.02％EDTA-2Na)消化，按1：3比例传代培养。
高分化的PC12细胞分为以下各组(1)空白对照组：细胞中除了培养基外，不加任何药物；(2)模型组：在细胞中加入0.5μM鱼藤酮；(3)模型给药组：将阳性药依达拉奉(Edaravone，EDA)、不同浓度的山奈酚-3-O-芸香糖苷(K3R)和脱水红花黄色素B(AYB)分别预处理细胞后加入0.5μM鱼藤酮；培养24h，采用MTT法在酶标仪上570nm处测定各孔吸光度值，用于定量反映细胞存活率。实验结果与只用鱼藤酮损伤组相比具有统计学显著性差异：*P<0.05，**P<0.01。
结果表明，同模型组相比，有效成分山奈酚-3-O-芸香糖苷(K3R)和脱水红花黄色素B(AYB)均能提高细胞存活率(图7)。
实施例10红花抗帕金森病有效部位滴丸在预防或治疗帕金森病动物模型上的应用
将SD大鼠饲养在室温(22±2℃)，湿度(55±5％)的环境中，12h交替照明，自由饮水饮食。大鼠饲养一周左右，腹腔麻醉，用6-OHDA溶液颅内注射，人工造模。造模后1～3周，每隔一周通过大鼠腹腔注射APO，记录大鼠30min内的旋转行为，选择稳定旋转且速度大于5圈/min的大鼠视为成功的PD模型。
从PD大鼠模型中，随即将其分为5组：假手术组、6-OHDA组、低剂量组、高剂量组、阳性药组。将实施例1制备的滴丸溶于生理盐水中，给予低剂量和高剂量组，假手术组和模型组给予相同剂量的空白基质PEG6000溶液，阳性药组给予美多芭药物。
大鼠给予药物治疗三周后进行APO诱导的大鼠旋转行为检测。
与6-OHDA组相比，红花抗帕金森病有效部位滴丸(SAFE)给药组能明显减少大鼠在30min内的转圈次数，说明本滴丸具有抑制APO诱导的PD大鼠模型旋转行为的作用(图8)。
将上述组别的大鼠分别用生理盐水和4％多聚甲醛灌注后，取脑固定，再用30％蔗糖溶液脱水后冰冻切片。按照免疫组化染色法操作用二氨基联苯胺法(DAB)染色，将封片在显微镜下观察，使用IPP6.0软件对阳性染色区域进行光密度分析并统计。
免疫组化结果表明，大鼠黑质部位注射6-OHDA后，TH阳性神经元明显减少，给予红花抗帕金森病有效部位滴丸(SAFE)后，与模型组相比，大鼠黑质部位的TH阳性神经元明显增加(图9)。
实验例1红花抗帕金森病有效部位滴丸的药质比优化实验
采用熔融法制备。将预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位浸膏的冻干粉末轻柔研磨过100目尼龙筛，孔径150μm，按一定比例准确称取过筛后的药物粉末和PEG6000，先将PEG6000于70℃水浴加热至熔融状态，按药质比(质量比)分别为1:1、1:2、1:4、1:5、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:15、1:18、1:25的比例少量多次加入药物粉末，充分搅拌均匀后静置30min，然后将药液加入滴丸机的贮液灌。调节滴距6cm、滴速每分钟30～40滴。冷凝剂为二甲基硅油，冷凝温度10℃，待滴丸成型后，采用纸屑擦拭法或离心法去除表面冷凝剂，避光存放，分别考察不同药质比制备滴丸时的滴制现象，滴丸的外观(圆整度、硬度)、收丸率和崩解时限。
滴丸的崩解时限按照《中华人民共和国药典》2010版一部附录ⅫA崩解时限检查法进行检查。
结果表明，按药质比1：2-4，滴制时，药液粘稠，滴头堵塞，滴制困难；而且滴丸的圆整度和硬度差，收丸率低，崩解时限长(表1)。
按药质比1：5-12制备的滴丸圆整度和光泽度好，硬度适中，收丸率在90％以上，且崩解时限短，为8-10min；其中，按药质比1：10制备的滴丸最佳，收丸率达97％以上，重量差异小于15％，崩解时限为7.8min±0.2min，(表1)，具有崩解快的特性，符合药典规定。
在药质比1：13-25时，随着基质PEG6000的比例增加，滴丸硬度过硬，溶散时间变长，且载药量降低，致使服用量增加。
表1不同药质比制备滴丸的滴制难易程度、圆整度、软硬、崩解时限比较
--：无法检测。
实验例2红花抗帕金森病有效部位滴丸的制备
采用加热熔融法制备。将预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位浸膏的冻干粉末轻柔研磨过100目尼龙筛，孔径150μm，按一定比例准确称取过筛后的药物粉末和PEG4000，先将PEG4000于50～90℃水浴加热至熔融状态，按药质比1:1、1:2、1:4、1:5、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:15、1:18、1:20的比例(质量比)少量多次加入药物粉末，充分搅拌均匀后静置30min，然后将药液加入滴丸机的贮液灌。调节滴距6cm、滴速每分钟30～40滴。冷凝剂为二甲基硅油，冷凝温度10℃，待滴丸成型后，采用纸屑擦拭法或离心法去除表面冷凝剂，避光存放。
结果表明，基质为PEG4000，按照药质比1：1～4滴制时，药液粘稠，滴头堵塞，不易流出；按照药质比1：5～20，成型的滴丸硬度和圆整度较差，易变形。说明，基质PEG4000不适于制备红花抗帕金森病有效部位的滴丸。
实验例3红花抗帕金森病有效部位滴丸的制备
采用熔融法制备。将预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位浸膏的冻干粉末轻柔研磨过100目尼龙筛，孔径150μm，按一定比例准确称取过筛后的药物粉末、PEG4000和PEG6000，先将PEG4000与PEG6000按照质量比1:1混合后于70～85℃水浴加热至熔融状态，按药质比1：10(质量比)的比例少量多次加入药物粉末，充分搅拌均匀后静置30min，然后将药液加入滴丸机的贮液灌。
调节滴距6cm、滴速每分钟30～40滴。冷凝剂为二甲基硅油，冷凝温度10℃，待滴丸成型后，采用纸屑擦拭法或离心法去除表面冷凝剂，避光存放。
结果表明，滴丸的圆整度、硬度较差，易变形。
实验例4滴距筛选实验
采用熔融法制备。将预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位浸膏的冻干粉末轻柔研磨过100目尼龙筛，孔径150μm，按一定比例准确称取过筛后的药物粉末和PEG6000，先将PEG6000于70-80℃水浴加热至熔融状态，按药质比(质量比)分别为1:10的比例少量多次加入药物粉末，充分搅拌均匀后静置30min，然后将药液加入滴丸机的贮液灌。调节滴距为4、6、8、10、12cm、滴速为每分钟30～40滴。冷凝剂为二甲基硅油，冷凝温度10℃，待滴丸成型后，采用纸屑擦拭法或离心法去除表面冷凝剂，避光存放。
结果表明，滴制时，滴距为6-8cm，液滴间距均匀、匀速沉降，滴丸大小一致，圆整度较好；其中，滴距为6cm，滴丸的重量差异小于5％，圆整度最好(表2)；当滴距较大，为10-12cm时，滴丸易摔裂，导致大小不一、圆整度差。
表2不同滴距制备滴丸的现象及重量差异比较
实验例5滴速筛选实验
采用熔融法制备。将预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位浸膏的冻干粉末轻柔研磨过100目尼龙筛，孔径150μm，按一定比例准确称取过筛后的药物粉末和PEG6000，先将PEG6000于70℃水浴加热至熔融状态，按药质比(质量比)分别为1:10的比例少量多次加入药物粉末，充分搅拌均匀后静置30min，然后将药液加入滴丸机的贮液灌。调节滴距为6cm、滴速分别为每分钟6～20滴、30～40滴、50～60滴。冷凝剂为二甲基硅油，冷凝温度10℃，待滴丸成型后，采用纸屑擦拭法或离心法去除表面冷凝剂，避光存放。
结果表明，滴制时，每分钟6～20滴，滴速越慢，滴丸质量越小，平均11.7mg；滴速越快，每分钟50～60滴，滴丸容易粘连成串；只有每分钟30～40滴，制备的滴丸平均丸重22.3mg，没有一丸超出重量差异限度，符合《中华人民共和国药典》2010版规定。
实验例6冷凝温度筛选实验
采用熔融法制备。将预备实施例1制备的红花抗帕金森病有效部位浸膏的冻干粉末轻柔研磨过100目尼龙筛，孔径150μm，按一定比例准确称取过筛后的药物粉末和PEG6000，先将PEG6000于70-85℃水浴加热至熔融状态，按药质比(质量比)分别为1:10的比例少量多次加入药物粉末，充分搅拌均匀后静置30-50min，然后将药液加入滴丸机的贮液灌。调节滴距6cm、滴速为每分钟30～40滴。冷凝剂为二甲基硅油，冷凝温度分别为6、7、8、9、10、11、12、13℃，待滴丸成型后，采用纸屑擦拭法或离心法去除表面冷凝剂，避光存放。
结果表明，冷凝温度为11-13℃，冷凝温度过高，滴丸内部未骤冷成固体，易形成半固体状。因此，冷凝温度为6-10℃较适宜。

Claims (10)

1.一种红花抗帕金森病有效部位滴丸，其特征在于，由以下原料制成：红花抗帕金森病有效部位提取物和基质。
2.按照权利要求1所述的红花抗帕金森病有效部位滴丸，其特征在：按照质量比计，红花抗帕金森病有效部位提取物：基质＝1：1-25；优选为1：4-18。
3.按照权利要求2所述的红花抗帕金森病有效部位滴丸，其特征在：按照质量比计，红花抗帕金森病有效部位提取物：基质＝1：5-12；优选为1：10。
4.按照权利要求1-3任何一项所述的红花抗帕金森病有效部位滴丸，其特征在：所述基质为聚乙二醇6000或聚乙二醇4000中的任意一种；优选为聚乙二醇6000。
5.按照权利要求1-3任何一项所述的红花抗帕金森病有效部位滴丸，其特征在，所述红花抗帕金森病有效部位提取物的化学成分包括：山奈酚-3-O-芸香糖苷或脱水红花黄色素B中的任意一种或两种按照任意比例组成的混合物。
6.按照权利要求1-3任何一项所述的红花抗帕金森病有效部位滴丸，其特征在，所述红花抗帕金森病有效部位提取物的化学成分包括：山奈酚-3-O-芸香糖苷、脱水红花黄色素B、羟基红花黄色素A及其异构体、红花黄色素C及其异构体、前红花苷、山奈酚-3-O-β-槐糖苷或山奈酚-3-O-葡萄糖苷中的任意一种或多种按照任意比例组成的混合物。
7.按照权利要求1-3任何一项所述的红花抗帕金森病有效部位滴丸，其特征在，所述红花抗帕金森病有效部位提取物的制备方法包括：
(1)将红花用乙醇提取，得到提取液；(2)将提取液上大孔树脂，用乙醇洗脱，收集洗脱产物，冷冻干燥，即得。
8.按照权利要求7所述的红花抗帕金森病有效部位滴丸，其特征在：步骤(1)用体积比为50％乙醇提取；
步骤(2)所述大孔树脂的填料型号为AB-8；所述用乙醇洗脱包括：按照体积比计，依次用10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、95％乙醇洗脱；所述收集洗脱产物为收集30％乙醇洗脱产物。
9.一种权利要求1-3任何一项所述红花抗帕金森病有效部位滴丸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将基质加热至熔融，得到熔融基质；(2)按照所述比例，将红花抗帕金森病有效部位提取物加入熔融基质中，搅拌均匀，得到熔融药液；(3)将熔融药液滴入冷凝剂中，收缩成型，干燥，即得。
10.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述将熔融药液滴入冷凝剂中的滴距为4-12cm，滴速为每分钟6-60滴；优选的，滴距为6-8cm，滴速为每分钟20-40滴；更优选的，滴距为6cm，滴速为每分钟30-40滴；
步骤(3)所述冷凝剂的温度为6-13℃，优选为6-10℃；所述冷凝剂选自二甲基硅油、液体石蜡或植物油中的任意一种或几种按照任意比例组成的混合物；
步骤(1)所述加热是50-90℃水浴加热，优选为70-85℃水浴加热。
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