CN105744941A

CN105744941A - 麻黄属生物碱除去型麻黄提取物及其制备方法及用途

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Publication number: CN105744941A
Application number: CN201480063473.4A
Authority: CN
Inventors: 花轮寿彦; 日向须美子; 合田幸广; 日向昌司; 天仓吉章; 好村守生; 山下忠俊
Original assignee: HEIMAT CO Ltd; Kitasato Institute; National Institute of Health Sciences
Current assignee: HEIMAT CO Ltd; Kitasato Institute; Tokiwa Phytochemical Co Ltd; National Institute of Health Sciences
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2034-11-19
Also published as: JP2020172491A; CN105744941B; JPWO2015076286A1; KR20160086920A; JP2022101668A; JP2024105626A; WO2015076286A1; JP6781881B2; JP7143972B2

Abstract

本发明提供一种从麻黄提取物中除去了麻黄属生物碱而得到的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物、及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的制备方法、以及以其为有效成分的抗癌、抗转移药，疼痛抑制药，抗流感病毒药。

Description

麻黄属生物碱除去型麻黄提取物及其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种安全性更高的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物、用于制备其的方法以及将其作为有效成分的抗癌、抗转移药、疼痛抑制药、及抗流感病毒药。

背景技术

麻黄为麻黄科植物——草麻黄(EphedrasinicaStapf)、中麻黄(EphedraintermediaSchrenketC.A.Meyer)或木贼麻黄(EphedraequisetinaBunge)(麻黄科)的地上茎。麻黄为自古以来所使用的最重要的生药，作为含有麻黄作为构成生药的中药(中药方剂)，可举出：乌头汤、乌药顺气汤、越婢汤、越婢加术汤、回首散、华盖散、葛根汤、葛根汤加川芎辛夷、葛根加术附汤、葛根加半夏汤、甘草麻黄汤、桂姜枣草黄辛附汤、桂枝芍药知母汤、桂枝二越婢一汤、桂枝麻黄各半汤、厚朴麻黄汤、五虎汤、五虎二陈汤、五积散、柴葛解肌汤、小青龙汤、小续命汤、神秘汤、续命汤、大青龙汤、独活葛根汤、防风通圣散、麻黄汤、麻黄附子细辛汤、麻杏甘石汤、麻杏苡甘汤、射干麻黄汤、薏苡仁汤、丽泽通气汤等。另外，目前，在收载在健康保险的中药方剂中，含有麻黄作为构成生药的中药方剂可举出以下的16个方剂：越婢加术汤、葛根汤、葛根汤加川芎辛夷、葛根加术附汤、桂枝麻黄各半汤、五虎汤、五积散、小青龙汤、神秘汤、续命汤、防风通圣散、麻黄汤、麻黄附子细辛汤、麻杏甘石汤、麻杏苡甘汤、薏苡仁汤。

作为麻黄的有效成分，麻黄属生物碱类((-)-麻黄碱，(+)-伪麻黄碱，)是有名的，在日本药典中，对中麻黄或木贼麻黄(麻黄科)的地上茎的干燥物进行定量时，规定含有总生物碱(麻黄碱及伪麻黄碱)0.7％以上。麻黄已知有中枢神经兴奋作用、交感神经兴奋作用、发汗作用、镇咳作用、抗炎作用、抗过敏作用(非专利文献1)，这些药理作用认为来自麻黄属生物碱(非专利文献2)。进而，麻黄被用于身体疼痛的各种症状，麻黄的镇痛作用通过伪麻黄碱的抗炎作用来说明(非专利文献3)。另一方面，作为麻黄的新的药理作用，本发明人等从使用小鼠的体内分析阐明了经由癌细胞的运动能力抑制作用的癌转移抑制效果、或经由癌细胞的增殖抑制效果的抗肿瘤效果(非专利文献4)，作为其分子机制，报道了是由作为肝细胞增殖因子(HGF)的受体Met抑制导致的HGF-Met-Akt信号抑制所引起的(专利文献1、非专利文献5)。这些作用在单独的麻黄属生物碱中观察不到，因此，探索活性成分的结果，发现了类黄酮化合物草棉黄素(Herbacetin)配糖体(非专利文献6)。但是，草棉黄素配糖体的含量低至约0.005％，仅该成分不能说明麻黄的新的药理作用，认为多种成分参与(非专利文献7)。因此，为了有效利用麻黄的药效，期望将麻黄提取物直接用作药物。

由于麻黄具有交感神经刺激作用及中枢神经刺激作用，因此，有心绞痛、心肌梗塞、高血压等既往史的人原则上是禁用的。另外，对于高龄者，必需注意而使用。进而，胃肠弱的人有可能引起食欲不振或急性胃粘膜病变导致的腹痛。此外，对心悸、兴奋、排尿障碍、不眠、发疹等必需注意(非专利文献8)。这些副作用被认为来自麻黄属生物碱(非专利文献9)。在美国，将麻黄作为补充剂使用，但由于过量摄取等不适当的使用，导致死亡事故发生，FDA对含有麻黄等麻黄属生物碱的物质，规定禁止一切出售，对消耗者也提醒注意(2004年麻黄禁止令)。在以此为根据的地区报告中，对庞大数量的论文和包括呈报到FDA的百数十件的死亡例的1万数千件的副作用报告进行了周密地验证，得出结论：麻黄制剂具有心悸或恶心呕吐等轻度至中度的副作用(非专利文献10)。在日本，麻黄被分类为作为专门药物使用的材料，虽然允许其作为药物使用，但在医疗现场，担心因患者的体质和症状的不同而产生严重的副作用，这是目前的现状。

迄今为止，相信麻黄的药效几乎全部起因于麻黄属生物碱。其根据是非专利文献2中记载的脱生物碱麻黄提取物全部失去了麻黄具有的药效。由此，认为将麻黄的主作用和副作用分离是困难的，为了除去麻黄的副作用，从麻黄中除去麻黄属生物碱的设想迄今为止完全没有。但是，如上所述，本发明人等在麻黄中发现了不依赖于麻黄属生物碱的有用的药效，至此实现了通过选择性地除去作为副作用的原因物质的麻黄属生物碱，可以提供作为安全性高的药物的麻黄提取物的想法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：“以麻黄为成分的MET抑制剂”，日本特愿2009-86363(2009年3月31天)

非专利文献

非专利文献1：麻黄的药效·药理，现代东洋医学，15(4)，551-554，1994。

非专利文献2：麻黄的药理，现代东洋医学，1(2)，34-39，1980。

非专利文献3：中药中的镇痛剂的定位和种类、疼痛和临床，5(3)，262-268，2005。

非专利文献4：BasicresearchontheuseofKampomedicinestoprotectagainstcancerrecurrenceandmetastasis，J.Trad.Med.，30(1)，1926，2013。

非专利文献5：Ephedraeherba，amajorcomponentofmaoto，inhibitstheHGF-inducedmotilityofhumanbreastcancerMDA-MB-231cellsthroughsuppressionofc-Mettyrosinephosphorylationandc-Metexpression.J.Trad.Med.，28，128-138，2011。

非专利文献6：CharacterizationofphenolicconstitutesfromEphedraHerbaextract.Molecules，18，5326-5334，2013。

非专利文献7：麻黄提取物中含有的成分研究，日本药学会年会要旨集133年会2号，185，2013。

非专利文献8：花轮寿彦著，“汉方诊疗的教程”，增补版，p46-47，金原出版，2003年。

非专利文献9：HallerCA，BenowitzNL.，Adversecardiovascularandcentralnervoussystemeventsassociatedwithdietarysupplementscontainingephedraalkaloids，NEnglJMed.2000Dec21；343(25):1833-8。

非专利文献10：FinalRuleDeclaringDietarySupplementsContainingEphedrineAlkaloidsAdulteratedBecauseTheyPresentanUnreasonableRisk.FederalRegister：69(28)，pp6787-6854，2004。

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于，提供一种用于通过从原样保持麻黄所具有的几种药效的麻黄提取物中除去麻黄属生物碱，来制备安全性高的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的方法以及以其为有效成分的抗癌、抗转移药、疼痛抑制药及抗流感病毒药。

解决课题的手段

非专利文献2中记载了：通过将麻黄用NH₄OH及醚进行处理而除去生物碱，制作脱生物碱麻黄提取物的方法。但是，用该方法制作的脱生物碱麻黄提取物以高浓度(0.33-0.5％)含有残存总生物碱，进而，由于NH₄OH处理在植物成分的结构上引起化学变化(大原诚资，木材学会志，55，59-68，2009；D.Ferreira等人，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1，203-208，1990)，因此认为含有了与原来的麻黄提取物不同的人造成分。非专利文献2的作者也提及了该情况。另外，由于非专利文献2中记载的脱生物碱麻黄提取物全部丧失了麻黄具有的药理效果，因此是对麻黄的药效产生影响的制备方法，对于从麻黄中除去麻黄属生物碱而作为药物利用来说，为不适当的方法。

本发明人等克服了脱生物碱麻黄提取物的高生物碱含量和所含成分的化学结构变化、以及药效消失等问题点，为了解决上述的课题，反复进行了深入研究，结果成功地开发出了：在不影响麻黄提取物所含有的成分的结构、原样保持药效的情况下从麻黄提取物中简便地除去麻黄属生物碱的温和的制备方法。进而发现，所得到的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物保持抗癌、抗转移作用，此外还保持疼痛抑制作用和抗流感病毒作用，至此完成了本发明。

即，更具体而言，本发明提供以下(1)～(9)。

(1)一种麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其从麻黄提取物中除去了麻黄属生物碱(Ephedrinealkaloids，麻黄碱类生物碱)。

(2)根据(1)所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其以0.23％以下的量含有麻黄属生物碱。

(3)根据(1)所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其以0.023％以下的量含有麻黄属生物碱。

(4)根据(1)所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其以0.05ppm(检测极限)以下的量含有麻黄属生物碱。

(5)根据(1)～(4)任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其含有麻黄的提取液/或提取物的水溶液所含成分中的没有吸附于阳离子交换树脂的成分。

(6)一种中药制剂，其含有(1)～(5)任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物。

(7)根据(1)～(5)任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的制备方法，其特征在于，通过离子交换色谱法从麻黄的提取液和/或提取物中除去麻黄属生物碱。

(8)一种抗癌·抗转移药，其将(1)～(5)任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为有效成分。

(9)一种疼痛抑制药，其将(1)～(5)任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为有效成分。

(10)一种抗流感病毒药，其将(1)～(5)任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为有效成分。

发明效果

本发明方法是可以仅使麻黄提取物通液于某种阳离子交换柱而将麻黄属生物碱除去至0.23％以下、或0.023％以下、或0.05ppm(检测极限)以下的极其简便且有效的制备方法。另外，本发明的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物将作为麻黄的抗转移作用的机制已知的Met激酶的抑制活性抑制到与原来的麻黄提取物同等程度，进而，与原来的麻黄提取物同样地浓度依赖性地抑制Met高表达人肺癌细胞株H1975的细胞增殖。由以上结果可知，本发明的制备方法显示出：可以在原样保持麻黄提取物所具有的通过MET抑制的抗癌、抗转移作用的情况下除去麻黄属生物碱，可以提供将麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为有效成分的抗癌、抗转移药。

麻黄剂(将麻黄作为主药的中药)作为关节痛的治疗药也被频繁使用，因此，着眼于麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的镇痛效果，通过使用小鼠的疼痛试验(福尔马林试验)进行评价。其结果：通过麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的经口给药，显著地抑制疼痛，比麻黄提取物显示更高的疼痛抑制效果。迄今为止，一直认为麻黄的镇痛效果来自伪麻黄碱，因此，该结果的发现颠覆了迄今为止对麻黄的认知。因此可知：根据本发明，可以提供将麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为有效成分的疼痛抑制药。

作为麻黄剂之一的麻黄汤被用于流感初期的治疗，因此，麻黄属生物碱除去型麻黄提取物可以抑制流感病毒的感染，或通过使用MDCK细胞的流感病毒感染试验进行评价。其结果：麻黄属生物碱除去型麻黄提取物与原本的麻黄提取物同等程度地抑制流感病毒感染。因此明了，可以提供将麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为有效成分的抗流感病毒药。

综上，本发明的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物期待作为安全性更高的抗癌、抗转移药、疼痛抑制药及抗流感病毒药的利用。进而，麻黄属生物碱除去型麻黄提取物成为可以同时进行癌症治疗和癌性疼痛的治疗新的癌症治疗药。

由于麻黄作为中药的构成生药被广泛使用，因此，通过将含有麻黄的中药中的麻黄替换为麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，可以提供安全性更高的新的中药制剂。

例如，将麻黄汤作为抗癌、抗转移药利用时，可以赋予新的效能效果，并且也可扩大应用于对以往的麻黄汤敏感性的患者。

另外，例如可以应用于高龄者的关节痛。高龄者的关节痛成为生活质量(QOL)降低的原因之一，其大多因变形性关节病而产生。这样的关节痛占高龄者的要援助和要护理的原因的约十分之一，成为要援助的原因的首位(Matsui，Y.，NationalCenterforGeriatrics&Gerontology，42，1-4，2013)。就关节痛的治疗而言，以非甾体类抗炎药(NSAID)为中心，但由于胃肠障碍的副作用，因此难以长期服用，谋求替代NSAID的镇痛药。最近，某些制药企业进行具有镇痛作用的抗体药物的开发，进行了临床实验，但在一部分患者中，变形性关节病恶化而试验中止(Yamaguchi，A，DrugDeliverySystem，26(5)，457-460，2011)。该症状恶化的原因认为是，由于强的镇痛效果，患者的行动急剧增加。另一方面，含有麻黄的中药(葛根汤、麻杏苡甘汤、越婢加术汤、薏苡仁汤等)对关节痛的治疗是有效的，由于其镇痛效果缓慢，因此，不易招致患者的急剧的活动增加，不会引起变形性关节病的恶化。但是，由于麻黄的副作用(心悸、血压上升、失眠、排尿障碍等)，因此，需要注意对含麻黄的中药的高龄者的给药。通过使用将这些中药中的麻黄替换为麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的中药制剂，不会引起变形性关节病的恶化，可以安全地控制高龄者的关节痛，可有助于QOL(生活质量)的改善。

进而，报道了用于流感初期治疗的麻黄汤由临床研究可知，具有与西药奥司他韦同等程度的流感治疗效果(Nabeshima，S.，等人，J.Trad.Med.，27，148-156，2010；木本博史，治疗学，40，385-388，2006)，由于麻黄的副作用，有必要控制对高龄者或麻黄敏感性患者的给药。但是，如果使用将麻黄替换为麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的麻黄汤，则可以进行对高龄者或麻黄敏感性的患者的给药。另外，麻黄汤因麻黄的副作用，是难以长期给药的中药，但如果采用使用麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的麻黄汤，则可以以流感感染预防为目的，对感染的高危人群进行长期的预防性给药。

根据本发明可知，麻黄属生物碱除去型麻黄提取物具有作为麻黄提取物所具有的抗癌、抗转移药、疼痛抑制药及抗流感病毒药的作用，且确认可以用作选择性除去作为副作用的原因物质的麻黄属生物碱的安全性高的药物。本发明为用于将麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为药物提供的非常重要的基础技术。期待本发明在临床领域中的利用。

附图说明

图1表示实施例4中记载的、离子交换色谱法精制前后的麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的HPLC图。

图2表示实施例5中记载的、离子交换色谱法精制前后的麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的指纹。

图3表示实施例6中记载的、离子交换色谱法精制前后的麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的LC-MS图。

图4表示实施例7中记载的、麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的MET激酶抑制作用。

图5表示实施例8中记载的、麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物对人非小细胞肺癌H1975细胞的增殖的抑制作用。

图6表示实施例9中记载的、麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的疼痛抑制作用。

图7A表示实施例10中记载的、麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的流感病毒感染抑制作用。

图7B表示实施例10中记载的、麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的流感病毒感染抑制作用。

具体实施方式

麻黄提取物

本发明中所使用的麻黄使用麻黄科植物中麻黄(EphedraintermediaSchrenketC.A.Meyer)或木贼麻黄(EphedraequisetinaBunge)(麻黄科)的地上茎。可以利用将生的、干燥的或地上茎加工而成的物质。

在本发明的制备方法中进行的麻黄的提取工序可以基于众所周知的方法的任一种而进行。作为提取溶剂，可以使用水或温水、热水、醇系溶剂及丙酮等其它的有机溶剂。作为醇系溶剂，可以例示甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇等。这些溶剂既可以单独使用，也可以组合使用。

相对于麻黄的干燥重量，提取溶剂的量优选为2-100重量份。提取温度优选为4-98℃。提取时间优选为30分钟-2小时。提取方法可以通过搅拌提取、浸渍提取、对流提取、超声波提取、超临界提取等任意的方法进行。

对得到的提取液、或过滤提取液而得到的滤液、或浓缩滤液而得到的浓缩液、干燥浓缩液而得到的干燥物等这样得到的提取成分，可以通过以下的阳离子交换色谱法实施于精制工序，但优选之前将构成成分粗略地分离。例如，通过使用适当的过滤器进行过滤，或进行离心分离，可以简便地除去细的固体成分，在进行以下的色谱法时，可以防止柱堵塞等麻烦。

在后述的实施例1中，这样得到的麻黄提取物中的麻黄属生物碱为4.74％(麻黄碱为3.19％、伪麻黄碱为1.55％)。

麻黄属生物碱除去型麻黄提取物

通过经过上述工序而得到的麻黄提取物可以通过阳离子交换色谱法除去麻黄碱，经过浓缩干燥，得到麻黄属生物碱除去型麻黄提取物。麻黄属生物碱除去型麻黄提取物也简记为EFM(ephedrinealkaloidsfreeMaoextract)。

为了确定适于制备本发明麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的离子交换色谱法的填充剂，进行了研究。在用各种离子交换树脂处理麻黄提取物之后，用TLC及HPLC对提取物中所含的麻黄属生物碱进行分析。研究的离子交换树脂为阳离子交换树脂13种、两性离子交换树脂1种、阴离子交换树脂8种，总计22种。其结果可知：适于除去麻黄属生物碱的离子效果树脂为阳离子交换树脂。因此，使用弱酸性阳离子交换树脂WK10、WK11、WK20、WK40L、FPC3500、强酸性阳离子交换树脂SK104、SK110、SK1B、UBK530、UBK12、PK216、IR120B、1060H，对处理麻黄提取物之后的提取物中所含的麻黄属生物碱含量通过HPLC进行定量。将其结果示于下述的表。

[表1]

综上，适于制备麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的阳离子交换柱如下所述。在麻黄属生物碱含量为0.23％以下的EFM的制备中，可以从弱酸性阳离子交换树脂WK20、强酸性阳离子交换树脂SK104、SK110、SK1B、UBK530、PK216、IR120B、FPC3500、1060H中来选择作为柱填充剂。在麻黄属生物碱含量为0.023％以下的EFM制备中，可以从弱酸性阳离子交换树脂WK20、强酸性阳离子交换树脂SK104、SK110、SK1B、UBK530、PK216、IR120B、1060H中来选择作为柱填充剂。进而，在麻黄属生物碱含量为0.05ppm以下的EFM的制备中，可以选择强酸性阳离子交换树脂PK216作为柱填充剂，此外，也可以从实施例2及实施例3中选择强酸性阳离子交换树脂SK1B、IR120B。

色谱法的具体的实施方法依据本领域技术人员众所周知的任一种方法来实施。

干燥方法可以通过减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等任意的方法来进行。根据需要，可以加入糊精等赋形剂。

本发明的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物为从麻黄提取物中除去了麻黄属生物碱的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其优选以0.23％以下的量含有麻黄属生物碱(麻黄碱和伪麻黄碱的合计)，更优选以0.023％以下的量含有麻黄属生物碱，进一步优选以0.05ppm(检测极限)以下的量含有麻黄属生物碱。

在日本药典中，麻黄被规定为相对于中药的干燥物含有总生物碱(麻黄碱及伪麻黄碱)0.7％以上，该量按麻黄提取物换算时，计算为含有约2.3％～3.5％以上，因此，本发明的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物与目前所使用的麻黄提取物明确相区别。

予以说明，上述的麻黄提取物中的总生物碱含量的换算由非专利文献(成川一郎，“汉方的主张—现代科学和汉方制剂”，p162-163，(株)健友馆，1991年发行)及实施例1求出。从用于制备EFM的日本药典的麻黄制作麻黄提取物时，麻黄中所含的麻黄属生物碱几乎全部转移至麻黄提取物。但是，由麻黄得到的麻黄提取物的收率为20％～30％，因此，麻黄提取物中所含的总生物碱被浓缩成3.3倍～5倍。因此，将日本药典中规定的麻黄的总生物碱0.7％以上的3.3倍～5倍的数值“2.3％～3.5％以上”作为麻黄提取物的总生物碱的规定值。

该EFM的生物碱含量由以下的非专利文献规定。制作中药的安慰剂的情况下，将10％的实际药物进行混合(寺泽捷年、喜多敏明编集，“EBM汉方”，p8，2003年3月20日，医齿药出版株式会社)，如果为十分之一以下的含量，则认为其药理作用出现的可能性非常低。由于在麻黄提取物中含有2.3％～3.5％以上的麻黄属生物碱，因此，通过设定为其十分之一的0.23％～0.35％以下，认为是麻黄属生物碱的副作用出现的可能性极小的数值。在本发明中，为了与非专利文献2的脱生物碱麻黄提取物(残存生物碱含量0.33％～0.5％)明确地区别，设定为0.23％以下。为了进一步提高可靠性，规定为0.023％以下。另外，更优选为实施例1所示的0.05ppm以下(检测极限以下)。

含有麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的中药制剂

麻黄作为中药的构成生药被广泛使用，因此，通过将含有麻黄的中药中的麻黄替换为麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，可以提供排除了由麻黄属生物碱引起的副作用、安全性更高的中药制剂。例如，用于关节痛治疗的麻杏苡甘汤由麻黄、杏仁、薏苡仁、甘草构成，所以，通过在由麻黄以外的构成生药、即杏仁、薏苡仁、甘草制成的提取物中添加麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，可以制作副作用小的麻杏苡甘汤。

另外，用于流感初期的麻黄汤由麻黄、肉桂、杏仁、甘草构成，所以，通过在由肉桂、杏仁、甘草制成的提取物中添加麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，可以制作副作用小的麻黄汤。

药物组合物

本发明进而提供含有麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的组合物，组合物可以用作抗癌、抗转移药、疼痛抑制药或抗流感病毒药，可以为食品、营养辅助食品或药品的形态。

作为用于组合物的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，优选上述麻黄属生物碱的含量为0.23％以下或0.023％以下。更优选麻黄属生物碱的含量为0.05ppm(检测极限)以下。

本发明的组合物为药物组合物时的给药方法没有特别限定，优选可经口给药的剂型。本发明的药物组合物可以设为各种剂型。

例如，为了经口给药，可以制成片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、酒精剂、糖浆剂、提取物剂、酏剂，但并不限定于此。另外，可以在制剂中加入药学上可接受的各种载体。

例如，可以含有赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、香味剂、着色剂、甜味剂、矫味剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、包衣剂、维生素C、抗氧化剂，但并不限定于此。

本发明的药物组合物的给药量换算为麻黄属生物碱除去型麻黄提取物时，作为成人的1天用量，可以在100mg～3g的范围内使用。以一般的麻黄提取物的给药量为根据，换算为麻黄属生物碱除去型麻黄提取物时，作为成人的1天用量，可以估计为740mg～770mg，为了消除由麻黄属生物碱引起的副作用，可以增加给药量。

当然，也可以分别地根据所给药的人的年龄、体重、症状、给药途径、给药期间、治疗经过等而使其变化。

也可以将每1天的量分成数次给药。另外，也可以与其它疼痛抑制剂或抗癌剂组合而给药。

本发明的组合物也可以设为食品或营养辅助食品的形态。例如，通过在原材料中配合麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，可以设为面类、面包、糖果、果冻、饼、汤、健康饮料的形态。

在这样的食品、营养辅助食品中，除了麻黄属生物碱除去型麻黄提取物之外，可以加入铁、钙等无机成分、各种维生素类、低聚糖、壳聚糖等食物纤维、大豆提取物等蛋白质、卵磷脂等脂质、蔗糖、乳糖等糖类。

抗癌、抗转移药

可以将本发明组合物用作抗癌、抗转移药的癌症的种类主要为MET表达癌。MET在胃癌、大肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、骨肉瘤、脑瘤等各种癌细胞表面表达，因此可用于这些癌症的治疗。HGF-c-Met信号促进癌细胞的增殖、运动能力、细胞分散、生存、血管新生，成为癌细胞的增殖、浸润及转移的关键。因此，本发明的组合物作为防止癌症的复发及转移的药也是有效的。

疼痛抑制药

作为可将本发明组合物用作疼痛抑制剂的疾病，可举出肌肉痛、关节痛、腰痛、风湿病、痛风、癌性疼痛等。

抗流感病毒药

本发明组合物对流感病毒的感染预防及感染初期的治疗有效。

实施例

由此，通过以下的实施例详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。

实施例1：麻黄提取物的制作。

通过混合机粉碎麻黄的干燥原料，向其粉碎物50g中加入500mL水，一边搅拌，一边在95℃下提取1小时。进行固液分离，将提取液以3000rpm进行10分钟离心分离。将得到的上清液在60℃下减压浓缩后，在60℃下进行一夜减压干燥，得到麻黄提取物9.6g。

实施例2：通过离子交换树脂SK1B的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的制作。

将麻黄的干燥原料通过混合机粉碎，向其粉碎物50g中加入500mL水，一边搅拌，一边在95℃下提取1小时。进行固液分离，将提取液以3000rpm进行10分钟离心分离，使得到的上清液通液于25mL的强酸型阳离子交换树脂SK1B(三菱化学制)。将通过液用5％的NaHCO₃调整至pH＝5.2，在60℃下进行减压浓缩后，在60℃下进行一夜减压干燥，得到麻黄属生物碱除去型麻黄提取物6.3g。

实施例3：通过离子交换树脂IR120B的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的制作。

将麻黄的干燥原料通过混合机粉碎，向其粉碎物50g中加入500mL水，一边搅拌，一边在95℃下提取1小时。进行固液分离，将提取液以3000rpm进行10分钟离心分离，使得到的上清液通液于25mL的强酸型阳离子交换树脂IR120B(有机社制)。将通过液用5％的NaHCO₃调整至pH＝5.2，在60℃下进行减压浓缩后，在60℃下进行一夜减压干燥，得到麻黄属生物碱除去型麻黄提取物6.3g。

实施例4：通过高效液相色谱法(HPLC)的麻黄提取物(实施例1)及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(实施例2和实施例3)中所含的麻黄碱的含量比较。

将麻黄提取物(实施例1)及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(实施例2)的HPLC图示于图1。

分析条件

柱：SHISEIDOAG1204.6×150mm5μ

流动相：月桂基硫酸钠溶液(1→128)/乙腈/磷酸混合液(640：360：1)

温度：45℃

检测：紫外线吸光光度计(测定波长：210nm)

流速：0.6mL/分钟(以麻黄碱为14分钟左右的方式调整)

样品：取麻黄提取物或麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的干燥物各10mg，加入甲醇1mL，进行混合，注入各20μL。

标准溶液：注入麻黄碱标准溶液(1.0mg/50％甲醇10mL)及伪麻黄碱标准溶液(1.0mg/50％甲醇10mL)各20μL。

将得到的结果示于下表1。由以上结果可知：通过使用强酸型阳离子交换树脂SK1B、或IR120B的柱色谱法，可以从麻黄提取物中除去麻黄属生物碱(麻黄碱及伪麻黄碱)至检测极限(0.05ppm)以下。

[表2]

实施例5：通过三维高效液相色谱法(3D-HPLC)的麻黄提取物(实施例1)及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(实施例2)的组成成分的比较。

分析条件

柱：TSK-GEL80TS4.6×250mm5μ

流动相：(A)0.05M醋酸铵(pH3.6)

(B)乙腈

0分钟：B液10％→60分钟：B液100％

温度：40℃

检测：光电二极管阵列(PDA)

流速：1.0mL/分钟

标准溶液：注入麻黄碱标准溶液(1.0mg/10mL甲醇)及伪麻黄碱标准溶液(1.0mg/10mL甲醇)各20μL。

3D-HPLC的指纹示于图2。

通过3D-HPLC比较麻黄提取物和麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的组成成分的结果，在麻黄属生物碱除去型麻黄提取物中，麻黄属生物碱的峰消失，但其它成分的图案与麻黄提取物基本相同。

实施例6：通过LC/MS的麻黄提取物(实施例1)和麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(实施例2)的组成分析及比较研究

分析条件

柱：InertsilODS-3(2.1×150mmI.D.5mm)

流动相：0.1％HCOOH的水溶液(A)—0.1％HCOOH的MeOH溶液(B)的梯度方式：5％B(0-10min)→75％B(70min)

温度：40℃

检测1：PDA检测器(200-400nm)

检测2：MS检测器

界面，ESI正极/负极；ESI源电压，4.0kV；毛细管电压，10V；源温度，300℃；鞘气流速率，50；辅助气流速率，25；扫描范围，m/z150-2000；质量分辨率，30000全宽

流速：0.2mL/min

样品：)；注入体积，1μL，在5mg/mL

LC/MS的图示于图3。

通过LC/MS比较麻黄提取物和麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的组成成分的结果，在麻黄属生物碱除去型麻黄提取物中，确认l-麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、去甲麻黄碱的各峰消失(图3)。

实施例7：麻黄提取物(实施例1)及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(实施例2)的MET激酶抑制作用

MET激酶活性是将伴有以PolyE4Y1肽为底物的重组MET激酶域的ATP消耗的ADP产生量作为指标。在重组MET激酶域中含有PolyE4Y1肽和ATP的反应缓冲液的混合物中，分别以成为1μg/mL、5μg/mL、及10μg/mL的方式添加麻黄提取物、或麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(2批)，在室温下培养1小时。反应停止后，使用ADP-Glo试剂，测定依赖于ADP量的鲁米诺发光强度，研究相对MET激酶活性。

由其结果可知：麻黄属生物碱除去型麻黄提取物与麻黄提取物同等程度地抑制MET激酶作用。将麻黄提取物(实施例1)和麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(实施例2)的MET激酶抑制曲线示于图4。

实施例8：对麻黄提取物(实施例1)及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(实施例2)的来自人肺癌H1975细胞的增殖的抑制效果

H1975细胞从美国生物资源库(ATCC)购入。将H1975细胞悬浮于10％FCS-RPMI培养基，在96孔培养板的各孔中以2×10³个/100μL播种。培养一夜后，除去培养上清液，分别以50、100、150、200μg/mL添加麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(3批次)，对照则添加10％FCS-RPMI培养基。培养72小时后，将Cellcountingkit-8(细胞计数试剂盒-8)添加于10μL各孔中，培养4小时后，用酶标仪测定各孔的吸光度(450nm)。各提取物的浓度测定4个孔，由其平均值计算出相对细胞数(图5)。

由其结果可知：麻黄属生物碱除去型麻黄提取物与麻黄提取物同样地，抑制来自人肺癌的H1975细胞的增殖。

实施例9：对动物试验中的麻黄提取物(实施例1)及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(实施例2)的疼痛的抑制效果

实验动物使用4周龄的雄性ICR小鼠48只。在实验开始日进行体重测定，以各组基本相同的方式分成对照组、麻黄提取物2组及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物2组(1天给药量分别为350和700mg/kg)。在麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物中加入注射用蒸馏水，一边在37℃下搅拌30分钟，一边使其悬浮。悬浮液在临口服给药前施加涡流而成为均匀后，用探针给药。将第1天和第2天的单次给药量设为175mg/kg，另外设为375mg/kg，一天给药2次(9点和17点)。第3天，在上午，给药350mg/kg或700mg/kg仅1次。

在第3天的上午的最终给药6小时后，将2.5％福尔马林溶液给药于20μL足底部皮下。给药后，快速将小鼠放入于圆柱塑料容器(内径116mm，高152mm)中，录像45分钟。就疼痛关联行动而言，将在从给药之后至10分钟后产生的第1相和15分钟以后至30分钟产生的第2相设为对象，计测舔或咀嚼每一定时间的处置的足的行动时间。统计学分析是将对照组和受试物质给药组的疼痛行动时间通过Dunnett试验进行，显著性水平设为5％。

其结果，在给药麻黄提取物700mg/kg的情况下，显著性抑制第2相的疼痛关联行动。麻黄属生物碱除去型麻黄提取物以350mg/kg及700mg/kg的两个给药量浓度依赖性地显著性抑制第2相的疼痛关联行动，与除去麻黄碱前的麻黄提取物相比，疼痛抑制作用提高(图6)。由以上的结果可知：麻黄属生物碱除去型麻黄提取物与麻黄提取物相比，具有更高的疼痛抑制效果。

实施例10：麻黄提取物(实施例1)及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物(实施例2)的流感病毒感染抑制作用

就分析而言，通过因流感病毒的感染而使MDCK细胞溶解，通过用色素染色残存细胞来进行检测。

对于麻黄提取物及麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，分别用10％FBS-MEM在200μg/mL的溶液中制备，进一步制作10个等级的2倍稀释系列，作为试样溶液。将含有流感病毒(A/WSN/33(H1N1)株)的液体用10％FBS-MEM稀释至1000TCID₅₀/mL，作为流感病毒液。将MDCK细胞在10％FBS-MEM中悬浮，每96孔培养板的各孔以3×10⁴个/100μL播种。培养24小时后，除去培养上清液，将试样溶液100μL添加于各孔中，进一步添加100μL的流感病毒液或10％FBS-MEM。培养72小时后，用结晶紫染色，用酶标仪测定各孔的560nm处的吸光度。

其结果，在添加10％FBS-MEM的系列中，在试样浓度1.56～25μg/mL的范围内，在任一种提取物中均没有观察到细胞数的降低，因此，确认在该添加浓度域中不显示细胞毒性(图7B)。另一方面，在添加流感病毒液的系列中，任一种提取物均观察到在该试样浓度域中浓度依赖性地细胞溶解(图7A)。求出4个参数Logistic曲线的近似式，由该参数计算IC₅₀值，结果，对于麻黄提取物来说IC₅₀为8.6μg/mL，对于麻黄属生物碱除去型麻黄提取物来说IC₅₀为8.3μg/mL。由以上的结果可知：麻黄属生物碱除去型麻黄提取物与麻黄提取物同等程度地抑制流感病毒对MDCK细胞的感染。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其从麻黄提取物中除去了麻黄属生物碱，其特征在于，含有麻黄的提取液/或提取物的水溶液所含成分中的没有吸附于阳离子交换树脂的成分。

2.权利要求1所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其以0.23％以下的量含有麻黄属生物碱。

3.权利要求1所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其以0.023％以下的量含有麻黄属生物碱。

4.权利要求1所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其以0.05ppm(检测极限)以下的量含有麻黄属生物碱。

5.中药制剂，其含有权利要求1～4任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物。

6.权利要求1～4任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的制备方法，其特征在于，通过离子交换色谱法从麻黄的提取液和/或提取物中除去麻黄属生物碱。

7.抗癌、抗转移药，其以权利要求1～4任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物为有效成分。

8.疼痛抑制药，其以权利要求1～4任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物为有效成分。

9.抗流感病毒药，其以权利要求1～4任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物为有效成分。

Claims

1.麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其从麻黄提取物中除去了麻黄属生物碱。

5.权利要求1～4任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物，其含有麻黄的提取液/或提取物的水溶液所含成分中的没有吸附于阳离子交换树脂的成分。

6.中药制剂，其含有权利要求1～5任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物。

7.权利要求1～5任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物的制备方法，其特征在于，通过离子交换色谱法从麻黄的提取液和/或提取物中除去麻黄属生物碱。

8.抗癌、抗转移药，其将权利要求1～5任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为有效成分。

9.疼痛抑制药，其将权利要求1～5任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为有效成分。

10.抗流感病毒药，其将权利要求1～5任一项所述的麻黄属生物碱除去型麻黄提取物作为有效成分。