KR20160086920A

KR20160086920A - 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스와 그 제법 및 용도

Info

Publication number: KR20160086920A
Application number: KR1020167015962A
Authority: KR
Inventors: 도시히코 하나와; 스미코 휴가; 유키히로 고다; 마사시 휴가; 요시아키 아마쿠라; 모리오 요시무라; 다다토시 야마시타
Original assignee: 가부시키가이샤 도키와 쇼쿠부츠가가쿠 겡큐쇼; 국립의약품식품위생연구소장이 대표하는 일본국; 각코우호우징 기타사토켄큐쇼
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2016-07-20
Also published as: JP6781881B2; JP7143972B2; CN105744941A; JP2020172491A; JP2022101668A; WO2015076286A1; CN105744941B; JPWO2015076286A1

Abstract

마황 엑기스로부터 에페드린 알칼로이드를 제거한 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조 방법 그리고 그것을 유효 성분으로 하는 항암·항전이약, 동통 억제약, 항인플루엔자 바이러스약을 제공한다.

Description

에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스와 그 제법 및 용도 {EPHEDRA EXTRACT STRIPPED OF EPHEDRINE ALKALOIDS, METHOD FOR PRODUCING SAME AND USE OF SAME}

본 발명은, 보다 안전성이 높은 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스와 그것을 제조하기 위한 방법 그리고 그것을 유효 성분으로 하는 항암·항전이약, 동통 억제약 및 항인플루엔자 바이러스약에 관한 것이다.

마황은 마황과 식물 초마황 (Ephedra sinica Stapf), 중마황 (Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer) 또는 마황과 (Ephedra equisetina Bunge) (Ephedraceae) 의 땅윗줄기이다. 마황은 예로부터 지금까지 사용되어 온 최대 중요한 생약이며, 마황을 구성 생약으로서 함유하는 한방약 (한방 처방) 으로는, 조두탕, 조약순기탕, 월비탕, 월비가출탕, 회수산료, 화개산료, 갈근탕, 갈근탕가천궁신이, 갈근가출부탕, 갈근가반하탕, 감초마황탕, 계강조초황신부탕, 계지작약지모탕, 계지이월비일탕, 계지마황각반탕, 후박마황탕, 오호탕, 오호이진탕, 오적산료, 시갈해기탕, 소청룡탕, 소속명탕, 신비탕, 속명탕, 대청룡탕, 독활갈근탕, 방풍통성산료, 마황탕, 마황부자세신탕, 마행감석탕, 마행의감탕, 사간마황탕, 의이인탕, 여택통기탕 등을 들 수 있다. 또, 현재, 건강 보험 수재 한방 처방 중에서 마황을 구성 생약으로서 포함하는 한방 처방은 이하의 16 처방이 있다：월비가출탕, 갈근탕, 갈근탕가천궁신이, 갈근가출부탕, 계지마황각반탕, 오호탕, 오적산료, 소청룡탕, 신비탕, 속명탕, 방풍통성산료, 마황탕, 마황부자세신탕, 마행감석탕, 마행의감탕, 의이인탕을 들 수 있다.

마황의 유효 성분으로는, 에페드린 알칼로이드류 ((-)-에페드린, (＋)-슈도에페드린) 가 유명하고, 일본 약국방에 있어서는, 초마황, 중마황 또는 마황과 (Ephedraceae) 의 땅윗줄기를 건조시킨 것을 정량할 때, 총 알칼로이드 (에페드린 및 슈도에페드린) 0.7 ％ 이상을 함유한다고 규정되어 있다. 마황에는 중추 신경 흥분 작용, 교감 신경 흥분 작용, 발한 작용, 진해 작용, 항염증 작용, 항알레르기 작용이 알려져 있고 (비특허문헌 1), 이들 약리 작용은 에페드린 알칼로이드에서 유래한다고 생각되어 왔다 (비특허문헌 2). 또한, 마황은 신체 동통의 모든 증상에 사용되고 있고, 마황의 진통 작용은 슈도에페드린의 항염증 작용에 의해 설명되고 있다 (비특허문헌 3). 한편, 본 발명자들은, 마황의 새로운 약리 작용으로서, 암세포의 운동능 억제 작용을 통한 암전이 억제 효과나 암세포의 증식 억제 효과를 통한 항종양 효과를, 마우스를 사용한 생체내의 해석으로부터 명확하게 하고 (비특허문헌 4), 그 분자 기구로서 간세포 증식 인자 (HGF) 의 수용체인 Met 저해에 의한 HGF-Met-Akt 시그널의 억제에 의한 것임을 보고하였다 (특허문헌 1, 비특허문헌 5). 이들 작용은 에페드린 알칼로이드 단독으로는 관찰되지 않았기 때문에, 활성 성분을 탐색한 결과, 플라보노이드 화합물 헤르바세틴 (Herbacetin) 배당체를 알아냈다 (비특허문헌 6). 그러나, 헤르바세틴 배당체의 함유량은 약 0.005 ％ 로 낮고, 본 성분만으로 마황의 새로운 약리 작용을 설명할 수 없고, 복수의 성분이 관여하고 있다고 생각된다 (비특허문헌 7). 따라서, 마황의 약효를 유효하게 이용하기 위해서는, 마황 엑기스인 채 의약품으로서 사용하는 것이 바람직하다.

마황에는, 교감 신경 자극 작용 및 중추 신경 자극 작용이 있으므로, 협심증, 심근경색, 고혈압의 기왕이 있는 인간은 원칙으로서 금기이다. 또, 고령자에 대해서는 주의하여 사용할 필요가 있다. 또한, 위장이 약한 인간은 식욕 부진이나 급성 위점막병변에 의한 복통을 일으킬 가능성이 있다. 그 외, 동계 (動悸), 흥분, 배뇨 장해, 불면, 발진 등에 주의가 필요하다 (비특허문헌 8). 이들 부작용은, 에페드린 알칼로이드에서 유래한다고 생각되고 있다 (비특허문헌 9). 미국에서는, 마황을 서플리먼트로서 사용하고 있었지만, 과잉 섭취 등의 부적절한 사용으로부터, 사망 사고가 발생함에 따라, FDA 는 마황 등의 에페드린 알칼로이드를 함유하는 것에 대해서는, 일절 판매를 금지하는 것을 정하고, 소비자에 대해서도 주의 환기하고 있다 (2004년 에페드라 금지령). 그 근거가 된 랜드 리포트에서는, 방대한 수의 논문과 FDA 에 도달된 백수십건의 사망예를 포함하는 일만 수천건의 부작용 보고를 면밀하게 검증하여, 마황 제제에는 동계나 구역 및 구토 등의 경도부터 중등도의 부작용이 있다고 결론짓고 있다 (비특허문헌 10). 일본에 있어서는, 마황은, 오로지 의약품으로서 사용되는 재료로 분류되어 있고, 의약품으로서 승인된 것이 사용이 허용되고 있지만, 의료의 현장에서는, 환자의 체질이나 병상에 따라서는 위독한 부작용이 발생할 것이 우려되고 있는 것이 현상황이다.

지금까지, 마황의 약효는, 거의 모두 에페드린 알칼로이드에서 기인되는 것이라고 믿어져 왔다. 그 근거는, 비특허문헌 2 에 기재된 탈알칼로이드 마황 엑기스가, 마황이 갖는 약효를 모두 잃은 것에 의한다. 이 점으로부터, 마황의 주작용과 부작용을 분리하는 것은 곤란하다고 생각되어, 마황의 부작용을 제거하기 위해서, 마황으로부터 에페드린 알칼로이드를 제거한다는 발상은 지금까지 전혀 없었다. 그러나 발명자들은, 전술한 바와 같이, 마황에, 에페드린 알칼로이드에 의존하지 않는 유용한 약효를 발견하고, 부작용의 원인 물질인 에페드린 알칼로이드를 선택적으로 제거함으로써 안전성이 높은 의약품으로서 마황 엑기스를 제공할 수 있다는 발상에 이르렀다.

「마황을 성분으로 하는 MET 저해제」일본 특허출원 2009-86363호 (2009년 3월 31일)

마황의 약효·약리, 현대 동양 의학, 15 (4), 551-554, 1994. 마황의 약리, 현대 동양 의학, 1 (2), 34-39, 1980. 한방약 중에서의 진통제의 위치 결정과 종류, 통증과 임상, 5 (3), 262-268, 2005. Basic research on the use of Kampo medicines to protect against cancer recurrence and metastasis, J. Trad. Med., 30 (1), 19-26, 2013. Ephedrae herba, a major component of maoto, inhibits the HGF-induced motility of human breast cancer MDA-MB-231 cells through suppression of c-Met tyrosine phosphorylation and c-Met expression. J. Trad. Med., 28, 128-138, 2011. Characterization of phenolic constitutes from Ephedra Herba extract. molecules, 18, 5326-5334, 2013. 마황 엑기스에 함유되는 성분 연구, 일본 약학회 연회 요지집 133연회 2호, 185, 2013. 하나와 토시히코 저 「한방 진료의 레슨」증보판, p46-47, 카네하라 출판, 2003년 Haller CA, Benowitz NL., Adverse cardiovascular and central nervous system events associated with dietary supplements containing ephedra alkaloids, N Engl J Med. 2000 Dec 21；343 (25)：1833-8. Final Rule Declaring Dietary Supplements Containing 에페드린 Alkaloids Adulterated Because They Present an Unreasonable Risk. Federal Register： 69 (28), pp 6787-6854, 2004

본 발명은, 마황이 갖는 몇 가지 약효를 유지한 채 마황 엑기스로부터 에페드린 알칼로이드를 제거함으로써, 안전성이 높은 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 제조하기 위한 방법 그리고 그것을 유효 성분으로 하는 항암·항전이약, 동통 억제약 및 항인플루엔자 바이러스약을 제공하는 것을 목적으로 한다.

비특허문헌 2 에는, 마황을 NH₄OH 및 에테르로 처리함으로써 알칼로이드를 제거하고, 탈알칼로이드 마황 엑기스를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 이 방법으로 제조한 탈알칼로이드 마황 엑기스는, 잔존 총 알칼로이드를 고농도 (0.33 - 0.5 ％) 로 함유하고 있고, 또한 NH₄OH 처리는, 식물 성분의 구조에 화학적 변화를 일으키는 점에서 (오오하라 세이지, 목재 학회지, 55, 59-68, 2009；D. Ferreira et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 203-208, 1990), 원래의 마황 엑기스와는 상이한 인공 성분을 함유하고 있다고 생각된다. 비특허문헌 2 의 저자도 이 건에 대해서는 언급하고 있다. 또, 비특허문헌 2 에 기재된 탈알칼로이드 마황 엑기스는 마황이 갖는 약리 효과가 모두 없어진 점에서, 마황의 약효에 영향을 주는 제조 방법으로, 마황으로부터 에페드린 알칼로이드를 제거하여 의약품으로서 이용하기에는 부적절한 방법이다.

본 발명자들은, 탈알칼로이드 마황 엑기스의 높은 알칼로이드 함량이나, 함유 성분의 화학적인 구조 변화, 또한 약효 소실과 같은 문제점을 극복하고, 상기의 과제를 해결하기 위해서, 예의 연구를 거듭한 결과, 마황 엑기스가 함유하는 성분의 구조에 영향을 미치지 않고, 약효를 유지한 채로, 마황 엑기스로부터 간편하게 에페드린 알칼로이드를 제거하는 마일드한 제조법의 개발에 성공하였다. 또한, 얻어지는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스가 항암·항전이 작용을 유지하고 있는 것, 이에 더하여 동통 억제 작용 및 항인플루엔자 바이러스 작용도 유지하고 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 보다 구체적으로는 이하 (1) ∼ (9) 를 제공하는 것이다.

(1) 마황 엑기스로부터 에페드린 알칼로이드를 제거한 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스.

(2) 에페드린 알칼로이드를 0.23 ％ 이하의 양으로 함유하는 (1) 에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스.

(3) 에페드린 알칼로이드를 0.023 ％ 이하의 양으로 함유하는 (1) 에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스.

(4) 에페드린 알칼로이드를 0.05 ppm (검출 한계) 이하의 양으로 함유하는 (1) 에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스.

(5) 마황의 추출액/또는 추출물의 수용액에 함유되는 성분 중 양이온 교환 수지에 흡착되지 않는 성분을 함유하는 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스.

(6) (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 함유하는 한방 제제.

(7) 마황의 추출액 및/또는 추출물로부터 이온 교환 크로마토그래피에 의해 에페드린 알칼로이드를 제거하는 것을 특징으로 하는 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조 방법.

(8) (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하는 항암·항전이약.

(9) (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하는 동통 억제약.

(10) (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하는 항인플루엔자 바이러스약.

본 발명 방법은, 마황 엑기스를 어떤 종류의 양이온 교환 칼럼에 통액시키는 것만으로 0.23 ％ 이하 혹은 0.023 ％ 이하, 혹은 0.05 ppm (검출 한계) 이하까지 에페드린 알칼로이드를 제거하는 것이 가능한 매우 간편하고 유용한 제조 방법이다. 또, 본 발명의 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는, 마황의 항전이 작용의 기구로서 밝혀져 있는 Met 키나아제의 저해 활성을 원래의 마황 엑기스와 동일한 정도로 억제하고, 또한 Met 고발현 인간 폐암 세포주 H1975 의 세포 증식을 원래의 마황 엑기스와 마찬가지로 농도 의존적으로 억제하였다. 이들 결과로부터, 본 발명의 제조 방법은, 마황 엑기스가 갖는 MET 저해를 통한 항암·항전이 작용을 유지한 채 에페드린 알칼로이드를 제거할 수 있는 것을 나타내고 있고, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하는 항암·항전이약을 제공할 수 있는 것이 명확해졌다.

마황제 (마황을 주약으로 하는 한방약) 는 관절통의 치료약으로서도 빈용되는 점에서, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 진통 효과에 주목하여, 마우스를 사용한 동통 시험 (포르말린 시험) 에 의해 평가하였다. 그 결과, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 경구 투여에 의해 동통이 유의하게 억제되어, 마황 엑기스보다 높은 동통 억제 효과를 나타냈다. 지금까지, 마황의 진통 효과는 슈도에페드린에서 유래한다고 생각되어 온 점에서, 이 결과는 지금까지의 마황에 대한 생각을 뒤집는 발견이었다. 따라서, 본 발명에 의해, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하는 동통 억제약을 제공할 수 있는 것이 명확해졌다.

마황제의 하나인 마황탕은, 인플루엔자 초기의 치료에 사용되고 있는 점에서, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스가 인플루엔자 바이러스의 감염을 억제할 수 있는지, MDCK 세포를 사용한 인플루엔자 바이러스 감염 시험으로 평가하였다. 그 결과, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는, 원래의 마황 엑기스와 동일한 정도로 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하였다. 따라서, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하는 항인플루엔자 바이러스약을 제공할 수 있는 것이 명확해졌다.

이상으로부터, 본 발명의 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는 보다 안전성이 높은 항암·항전이약, 동통 억제약 및 항인플루엔자 바이러스약으로서의 이용이 기대된다. 또한, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는, 암치료와 암성 동통의 치료를 동시에 실시할 수 있는 새로운 타입의 암치료약이 된다.

마황은 한방약의 구성 생약으로서 폭넓게 사용되고 있는 점에서, 마황을 함유하는 한방약의 마황을, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로 치환함으로써, 보다 안전성이 높은 신규의 한방 제제를 제공할 수 있다.

예를 들어, 마황탕을 항암·항전이약으로서 이용할 때, 신규의 효능 효과를 부여하면서, 종래의 마황탕에 감수성인 환자에게도 적응 확대할 수 있다.

또, 예를 들어, 고령자의 관절통 이용으로의 응용이 가능하다. 고령자의 관절통은, 퀄리티·오브·라이프 (QOL) 저하 원인 중 하나로, 그 대부분은 변형성 관절증에 의해 발생한다. 이와 같은 관절통은 고령자의 지원 필요·간호 필요 원인의 약 1 할을 차지하여, 지원 필요 원인의 탑으로 되어 있다 (Matsui, Y., National Center for Geriatrics & Gerontology, 42, 1-4, 2013). 관절통의 치료는, 비스테로이드성 항염증약 (NSAID) 이 중심이지만, 부작용인 위장 장해로부터 장기 복용이 곤란하여, NSAID 를 대신하는 진통약이 요구되고 있다. 최근, 어느 제약 기업이 진통 작용을 갖는 항체 의약품의 개발을 실시하여, 임상 치험을 실시했지만, 일부 환자에서 변형성 관절증이 악화되어 치험이 중지되었다 (Yamaguchi, A, Drug Delivery System, 26 (5), 457-460, 2011). 이 증상 악화는, 강한 진통 효과에 의해 환자의 행동이 급격하게 증가했던 것이 원인으로 생각되고 있다. 한편, 마황을 함유하는 한방약 (갈근탕, 마행의감탕, 월비가출탕, 의이인탕 등) 은 관절통의 치료에 유효하고, 그 진통 효과는 완만하기 때문에, 환자의 급격한 활동 증가를 잘 초래하지 않아, 변형성 관절증의 악화를 발생시키는 경우가 없다. 그러나, 마황의 부작용 (동계, 혈압 상승, 불면, 배뇨 장해 등) 때문에, 마황 함유 한방약의 고령자로의 투여는 주의를 필요로 한다. 이들 한방약의 마황을 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로 치환한 한방 제제를 사용함으로써, 변형성 관절증의 악화를 발생시키지 않고, 안전하게 고령자의 관절통을 컨트롤할 수 있어, QOL 의 개선에 기여할 수 있다.

또한, 인플루엔자 초기의 치료에 사용되는 마황탕은, 임상 연구로부터 서양약의 오셀타미비르와 동일한 정도의 인플루엔자 치료 효과를 갖는 것이 보고되어 있는데 (Nabeshima, S., et al., J. Trad. Med., 27, 148-156, 2010；키모토 히로시, 치료학, 40, 385-388, 2006), 마황에 의한 부작용으로부터, 고령자나 마황 감수성 환자로의 투여는 삼가할 필요가 있다. 그러나, 마황을 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로 치환한 마황탕을 사용하면, 고령자나 마황 감수성 환자로의 투여가 가능해진다. 또, 마황탕은 마황에 의한 부작용으로부터 장기 투여가 어려운 한방약이었지만, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 사용한 마황탕을 사용하면, 인플루엔자 감염 예방의 목적으로 감염의 위험성이 높은 인간에게 예방적 투여를 장기로 실시하는 것이 가능해진다.

본원 발명에 의해, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스가, 마황 엑기스가 갖는 항암·항전이약, 동통 억제약 및 항인플루엔자 바이러스약으로서의 작용을 갖는 것이 명확해지고, 또한 부작용의 원인 물질인 에페드린 알칼로이드가 선택적으로 제거된, 안전성이 높은 의약품으로서 사용할 수 있는 것이 확인되었다. 본 발명은, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 의약품으로서 제공하기 위한 매우 중요한 기반 기술이다. 본원 발명의 임상 분야에 있어서의 이용이 기대된다.

도 1 은 실시예 4 에 기재하는, 이온 교환 크로마토그래피 정제 전후의 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 HPLC 차트를 나타낸다.
도 2 는 실시예 5 에 기재하는, 이온 교환 크로마토그래피 정제 전후의 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 핑거 프린트를 나타낸다.
도 3 은 실시예 6 에 기재하는, 이온 교환 크로마토그래피 정제 전후의 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 LC-MS 차트를 나타낸다.
도 4 는 실시예 7 에 기재하는, 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 MET 키나아제 저해 작용을 나타낸다.
도 5 는 실시예 8 에 기재하는, 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 인간 비소 세포 폐암 H1975 세포의 증식에 대한 억제 작용을 나타낸다.
도 6 은 실시예 9 에 기재하는, 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 동통 억제 작용을 나타낸다.
도 7A 는 실시예 10 에 기재하는, 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 인플루엔자 바이러스 감염 억제 작용을 나타낸다.
도 7B 는 실시예 10 에 기재하는, 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 인플루엔자 바이러스 감염 억제 작용을 나타낸다.

마황 엑기스

본 발명에 사용되는 마황은 마황과 식물 초마황, 중마황 또는 마황과 (Ephedraceae) 의 땅윗줄기를 사용한다. 생 것, 건조 혹은 땅윗줄기를 가공한 것을 이용할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어서 실시하는 마황의 추출 공정은, 주지된 방법 중 어느 것에 기초하여 실시할 수 있다. 추출 용매로는, 물 또는 온수, 열수, 알코올계 용매 및 아세톤 등 그 밖의 유기 용매를 사용할 수 있다. 알코올계 용매로는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올 등을 예시할 수 있다. 이들 용매는 단독으로 사용해도 되고, 조합하여 사용해도 된다.

추출 용매의 양은 마황의 건조 중량에 대하여, 2 - 100 중량부가 바람직하다. 추출 온도는 4 - 98 ℃ 가 바람직하다. 추출 시간은 30 분 - 2 시간이 바람직하다. 추출 방법은 교반 추출, 침지 추출, 향류 추출, 초음파 추출, 초임계 추출 등의 임의의 방법으로 실시할 수 있다.

얻어진 추출액 또는 추출액을 여과하여 얻어진 여과액, 혹은 여과액을 농축한 농축액, 농축액을 건조하여 얻어지는 건조물을 이와 같이 하여 얻어진 추출 성분은 다음의 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제 공정에 제공해도 되지만, 그 전에 구성 성분을 대강 분리해 두는 것이 바람직하다. 예를 들어, 적당한 필터를 사용하여 여과하거나 원심 분리하거나 함으로써, 세세한 고체 성분을 간단하게 제거할 수 있어, 다음의 크로마토그래피를 실시할 때에 칼럼이 막히거나 하는 트러블을 방지할 수 있다.

후술하는 실시예 1 에서는, 이와 같이 하여 얻어진 마황 엑기스 중의 에페드린 알칼로이드는 4.74 ％ (에페드린이 3.19 ％, 슈도에페드린이 1.55 ％) 였다.

에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스

상기 공정을 거침으로써 얻어지는 마황 엑기스는, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 에페드린을 제거하고, 농축 건조를 거쳐, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 얻을 수 있다. 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는, EFM (에페드린 alkaloids free Mao extract) 로 약기하는 경우도 있다.

본 발명의 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조에 적합한 이온 교환 크로마토그래피의 충전제를 결정하기 위해서 검토를 실시하였다. 마황 엑기스를 각종 이온 교환 수지로 처리한 후에, 엑기스에 함유되는 에페드린 알칼로이드를 TLC 및 HPLC 로 해석하였다. 검토한 이온 교환 수지는, 양이온 교환 수지 13 종류, 양성 이온 교환 수지 1 종류, 음이온 교환 수지 8 종류의 합계 22 종류이다. 그 결과, 에페드린 알칼로이드 제거에 적합한 이온 효과 수지는 양이온 교환 수지인 것을 알 수 있었다. 그래서, 약산성 양이온 교환 수지 WK10, WK11, WK20, WK40L, FPC3500, 강산성 양이온 교환 수지 SK104, SK110, SK1B, UBK530, UBK12, PK216, IR120B, 1060H 를 사용하여, 마황 엑기스를 처리한 후의 엑기스에 함유되는 에페드린 알칼로이드 함량을 HPLC 에 의해 정량하였다. 그 결과를 하기의 표에 나타낸다.

이상의 결과로부터, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조에 적합한 양이온 교환 칼럼은 다음과 같이 된다. 에페드린 알칼로이드 함량이 0.23 ％ 이하인 EFM 의 제조에는, 약산성 양이온 교환 수지 WK20, 강산성 양이온 교환 수지 SK104, SK110, SK1B, UBK530, PK216, IR120B, FPC3500, 1060H 중에서 칼럼 충전제로서 선택할 수 있다. 에페드린 알칼로이드 함량이 0.023 ％ 이하인 EFM 제조에는, 약산성 양이온 교환 수지 WK20, 강산성 양이온 교환 수지 SK104, SK110, SK1B, UBK530, PK216, IR120B, 1060H 중에서 칼럼 충전제로서 선택할 수 있다. 또한, 에페드린 알칼로이드 함량이 0.05 ppm 이하인 EFM 의 제조에는, 강산성 양이온 교환 수지 PK216 을 칼럼 충전제로서 선택할 수 있는 것 이외에, 실시예 2 및 실시예 3 으로부터 강산성 양이온 교환 수지 SK1B, IR120B 도 선택할 수 있다.

크로마토그래피의 구체적인 실시 방법은, 당업자에게 주지인 방법 중 어느 것에 의한다.

건조 방법은, 감압 건조, 동결 건조, 스프레이 건조 등의 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 필요한 경우에는 덱스트린 등의 부형제를 넣어도 된다.

본 발명의 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는, 마황 엑기스로부터 에페드린 알칼로이드를 제거한 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로, 에페드린 알칼로이드 (에페드린과 슈도에페드린의 합계) 를 0.23 ％ 이하의 양으로 함유하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 에페드린 알칼로이드를 0.023 ％ 이하의 양으로 함유하는 것이며, 더욱 바람직하게는 0.05 ppm (검출 한계) 이하의 양으로 함유한다.

일본 약국방에서는, 마황은 생약의 건조물에 대하여, 총 알칼로이드 (에페드린 및 슈도에페드린) 를 0.7 ％ 이상 함유한다고 규정되어 있고, 이 양은 마황 엑기스로 환산한 경우, 약 2.3 ％ ∼ 3.5 ％ 이상 함유하는 것으로 계산되므로, 본 발명의 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는 현재 사용되고 있는 마황 엑기스와 명확하게 구별된다.

또한, 상기의 마황 엑기스 중의 총 알칼로이드 함량의 환산은, 비특허문헌 (나리카와 이치로 「한방의 주장-현대 과학과 한방 제제」p162 - 163, (주) 건우관, 1991년 발행) 및 실시예 1 로부터 구해진다. EFM 의 제조에 사용한 일본 약국방의 마황으로부터 마황 엑기스를 제조하면, 마황에 함유되는 에페드린 알칼로이드는 거의 모두 마황 엑기스로 이행한다. 그러나, 마황으로부터 얻어지는 마황 엑기스의 수율은 20 ％ 내지 30 ％ 가 되기 때문에, 마황 엑기스에 함유되는 총 알칼로이드는 3.3 배 ∼ 5 배로 농축된다. 따라서, 일본 약국방에서 규정되는 마황의 총 알칼로이드 0.7 ％ 이상을 3.3 배 ∼ 5 배로 한 수치 2.3 ％ ∼ 3.5 ％ 이상이 마황 엑기스의 총 알칼로이드의 규정값이 된다.

본 EFM 의 알칼로이드 함량은, 이하의 비특허문헌으로부터 정하였다. 한방약의 플라세보를 제조하는 경우, 10 ％ 의 실약을 혼합하는 점에서 (데라사와 카츠토시, 키타 토시아키 편집 「EBM 한방」p8, 2003년 3월 20일, 의치약 출판 주식회사), 10 분의 1 이하의 함량이라면, 그 약리 작용이 출현할 가능성이 매우 낮다고 생각된다. 마황 엑기스에서는 2.3 ％ ∼ 3.5 ％ 이상 에페드린 알칼로이드를 함유하는 점에서, 그 10 분의 1 의 0.23 ％ ∼ 0.35 ％ 이하로 함으로써, 에페드린 알칼로이드의 부작용의 출현의 가능성이 매우 적은 수치로 생각된다. 본 발명에서는, 비특허문헌 2 의 탈알칼로이드 마황 엑기스 (잔존 알칼로이드 함량 0.33 ％ ∼ 0.5 ％) 와 명확하게 구별하기 위해서 0.23 ％ 이하로 하였다. 더욱 확실성을 높이기 위해서 0.023 ％ 이하를 규정하였다. 또, 보다 바람직한 것은 실시예 1 에 나타내는 0.05 ppm 이하 (검출 한계 이하) 이다.

에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 함유 한방 제제

마황은 한방약의 구성 생약으로서 폭넓게 사용되고 있는 점에서, 마황을 함유하는 한방약의 마황을, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로 치환함으로써, 에페드린 알칼로이드에서 기인되는 부작용이 배제된, 보다 안전성이 높은 한방 제제를 제공할 수 있다. 예를 들어, 관절통의 치료에 사용되고 있는 마행의감탕은 마황, 행인, 의이인, 감초로 구성되므로, 마황 이외의 구성 생약, 즉, 행인, 의이인, 감초로부터 조제한 엑기스에, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 첨가함으로써 부작용이 적은 마행의감탕을 제조할 수 있다.

또, 인플루엔자의 초기에 사용되는 마황탕은, 마황, 계피, 행인, 감초로 구성되므로, 계피, 행인, 감초로부터 조제한 엑기스에 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 첨가함으로써, 부작용이 적은 마황탕을 제조할 수 있다.

의약 조성물

본 발명은 또한, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 함유하는 조성물을 제공하고, 조성물은 항암·항전이약, 동통 억제약, 또는 항인플루엔자 바이러스약으로서 사용할 수 있고, 식품, 영양 보조 식품 또는 의약품의 형태일 수 있다.

조성물에 사용하는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로는, 상기 서술한 에페드린 알칼로이드 함량이 0.23 ％ 이하 혹은 0.023 ％ 이하인 것이 바람직하다. 보다 바람직한 것은 에페드린 알칼로이드 함량이 0.05 ppm (검출 한계) 이하이다.

본 발명의 조성물이 의약용 조성물일 때의 투여 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 경구 투여 가능한 제형이 바람직하다. 본 발명의 의약용 조성물은 여러 가지 제형으로 할 수 있다.

예를 들어, 경구 투여를 위해서는 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 환제, 액제, 유제, 현탁제, 용액제, 알코올제, 시럽제, 엑기스제, 엘릭시르제로 할 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다. 또, 제제에는 약제적으로 허용할 수 있는 여러 가지의 담체를 첨가할 수 있다.

예를 들어, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 착향제, 착색제, 감미제, 교미제, 용해 보조제, 현탁화제, 유화제, 코팅제, 비타민 C, 항산화제를 함유할 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 의약용 조성물의 투여량은, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로 환산하면, 성인 1 일 용량으로서 100 ㎎ ∼ 3 g 의 범위에서 사용할 수 있다. 일반적인 마황 엑기스의 투여량을 근거로 하여, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로 환산하면, 성인 1 일 용량으로서 740 ㎎ ∼ 770 ㎎ 으로 어림잡을 수 있지만, 에페드린 알칼로이드에서 기인되는 부작용이 배제되어 있기 때문에, 투여량을 증가시키는 것이 가능하다.

물론 개별적으로, 투여되는 인간의 연령, 체중, 증상, 투여 경로, 투여 기간, 치료 경과 등에 따라 변화시킬 수도 있다.

1 일당의 양을 수회로 나누어 투여할 수도 있다. 또, 다른 동통 억제제 또는 항암제와 조합하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물은, 식품 또는 영양 보조 식품의 형태로 할 수도 있다. 예를 들어, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 원재료에 배합함으로써, 면류, 빵, 캔디, 젤리, 쿠키, 스프, 건강 음료의 형태로 할 수 있다.

이와 같은 식품, 영양 보조 식품에는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 이외에, 철, 칼슘 등의 무기 성분, 여러 가지 비타민류, 올리고당, 키토산 등의 식물 섬유, 대두 추출물 등의 단백질, 레시틴 등의 지질, 자당, 젖당 등의 당류를 첨가할 수 있다.

항암·항전이약

본 발명의 조성물을 항암·항전이약으로서 사용할 수 있는 암의 종류는, 주로 MET 발현암이다. MET 는 위암, 대장암, 폐암, 난소암, 유방암, 골육종, 뇌종양 등 여러 가지의 암세포 표면에 발현하고 있는 점에서, 이들 암의 치료에 사용하는 것이 가능하다. HGF-c-Met 시그널은, 암세포의 증식, 운동능, 세포 분산, 생존, 혈관 신생을 촉진시켜, 암 세포의 증식, 침윤 및 전이의 열쇠가 된다. 따라서, 본 발명의 조성물은, 암의 재발·전이 방지약으로서도 유효하다.

동통 억제약

본 발명의 조성물을 동통 억제제로서 사용할 수 있는 질환으로는, 근육통, 관절통, 요통, 류마티스, 통풍, 암성 동통 등을 들 수 있다.

항인플루엔자 바이러스약

본 발명의 조성물은, 인플루엔자 바이러스의 감염 예방 및 감염 초기의 치료에 유효하다.

실시예

이제부터 본 발명을 이하의 실시예로 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않는다.

실시예 1：마황 엑기스의 제조.

마황의 건조 원료를 믹서에 의해 분쇄하고, 그 분쇄물 50 g 에 500 ㎖ 의 물을 첨가하고 교반하면서, 95 ℃ 에서 1 시간 추출하였다. 고액 분리하고, 추출액을 3000 rpm 으로 10 분간 원심 분리를 실시하였다. 얻어진 상청액을 60 ℃ 에서 감압 농축하였다면, 60 ℃ 에서 하룻밤 감압 건조를 실시하여, 마황 엑기스로서 9.6 g 을 얻었다.

실시예 2：이온 교환 수지 SK1B 에 의한 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조.

마황의 건조 원료를 믹서에 의해 분쇄하고, 그 분쇄물 50 g 에 500 ㎖ 의 물을 첨가하고 교반하면서, 95 ℃ 에서 1 시간 추출하였다. 고액 분리하고, 추출액을 3000 rpm 으로 10 분간 원심 분리를 실시하고, 얻어진 상청액을 25 ㎖ 의 강산형 양이온 교환 수지 SK1B (미츠비시 화학 제조) 에 통액시켰다. 통과액을 5 ％ 의 NaHCO₃ 으로 pH = 5.2 까지 조정하고, 60 ℃ 에서 감압 농축하였다면, 60 ℃ 에서 하룻밤 감압 건조를 실시하여, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로서 6.3 g 을 얻었다.

실시예 3：이온 교환 수지 IR120B 에 의한 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조.

마황의 건조 원료를 믹서에 의해 분쇄하고, 그 분쇄물 50 g 에 500 ㎖ 의 물을 첨가하고 교반하면서, 95 ℃ 에서 1 시간 추출하였다. 고액 분리하고, 추출액을 3000 rpm 으로 10 분간 원심 분리를 실시하고, 얻어진 상청액을 25 ㎖ 의 강산형 양이온 교환 수지 IR120B (오르가노사 제조) 에 통액시켰다. 통과액을 5 ％ 의 NaHCO₃ 으로 pH = 5.2 까지 조정하고, 60 ℃ 에서 감압 농축하였다면, 60 ℃ 에서 하룻밤 감압 건조를 실시하여, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로서 6.3 g 을 얻었다.

실시예 4：고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의한 마황 엑기스 (실시예 1) 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (실시예 2 와 실시예 3) 에 함유되는 에페드린의 함량 비교.

마황 엑기스 (실시예 1) 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (실시예 2) 의 HPLC 차트를 도 1 에 나타낸다.

분석 조건

칼럼：SHISEIDO AG120 4.6 × 150 ㎜ 5 μ

이동상：라우릴황산나트륨 용액 (1 → 128)/아세토니트릴/인산 혼액 (640：360：1)

온도：45 ℃

검출：자외선 흡광 광도계 (측정 파장：210 ㎚)

유속：0.6 ㎖/분 (에페드린이 14 분 부근이 되도록 조정)

샘플：마황 엑기스, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 건조물을 각 10 ㎎ 취하고, 메탄올 1 ㎖ 를 첨가하여 혼합하여, 각 20 ㎕ 를 주입하였다.

표준 용액：에페드린 표준 용액 (1.0 ㎎/50 ％ 메탄올 10 ㎖) 및 슈도에페드린 표준 용액 (1.0 ㎎/50 ％ 메탄올 10 ㎖) 을 각 20 ㎕ 주입하였다.

얻어진 결과를 이하의 표 2 에 나타낸다. 이들 결과로부터 강산형 양이온 교환 수지 SK1B, 혹은 IR120B 를 사용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 마황 엑기스로부터 에페드린 알칼로이드 (에페드린 및 슈도에페드린) 를 검출 한계 (0.05 ppm) 이하까지 제거할 수 있는 것이 명확해졌다.

실시예 5：3 차원 고속 액체 크로마토그래피 (3 D-HPLC) 에 의한 마황 엑기스 (실시예 1) 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (실시예 2) 의 조성 성분의 비교.

분석 조건

칼럼：TSK-GEL 80TS 4.6 × 250 ㎜ 5 μ

이동상：(A) 0.05 M 아세트산암모늄 (pH 3.6)

(B) 아세토니트릴

0 분：B 액 10 ％ → 60 분：B 액 100 ％

온도：40 ℃

검출：포토다이오드 어레이 (PDA)

유속：1.0 ㎖/분

샘플：마황 엑기스, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 건조물을 각 10 ㎎ 취하고, 메탄올 1 ㎖ 를 첨가하고 혼합하여, 각 20 ㎕ 를 주입하였다.

표준 용액：에페드린 표준 용액 (1.0 ㎎/10 ㎖ 메탄올) 및 슈도에페드린 표준 용액 (1.0 ㎎/10 ㎖ 메탄올) 을 각 20 ㎕ 주입하였다.

3D-HPLC 의 핑거 프린트는 도 2 에 나타낸다.

3D-HPLC 에 의해 마황 엑기스와 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 조성 성분을 비교한 결과, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스에 있어서는 에페드린 알칼로이드의 피크가 소실되었지만, 다른 성분의 패턴은 마황 엑기스와 거의 동일하였다.

실시예 6：LC/MS 에 의한 마황 엑기스 (실시예 1) 와 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (실시예 2) 의 조성 해석 및 비교 검토

분석 조건

칼럼：Inertsil ODS-3 (2.1 × 150 ㎜ I.D. 5 ㎜)

이동상：수 중 0.1 ％ HCOOH (A) ― MeOH 중 0.1 ％ HCOOH (B), 구배 모드： 5 ％ B (0 - 10 분) → 75 ％ B (70 분)

온도：40 ℃

검출 1：PDA 검출기 (200 - 400 ㎚)

검출 2：MS 검출기

인터페이스, ESI 양성/음성；ESI 전원 전압, 4.0 ㎸；모세관 전압, 10 V； 소스 온도, 300 ℃； 시스 (sheath) 가스 유량, 50；보조 가스 유량, 25； 스캔 범위, m/z 150 - 2000； 질량 분해능, 30,000 전폭.

유속：0.2 ㎖/분

샘플：주입 부피, 5 ㎎/㎖ 에서 1 ㎕

LC/MS 의 차트는 도 3 에 나타낸다.

LC/MS 에 의해 마황 엑기스와 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 조성 성분을 비교한 결과, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스에 있어서는, l-에페드린, 슈도에페드린, 메틸에페드린, 노르에페드린의 각 피크가 소실되어 있는 것을 확인하였다 (도 3).

실시예 7：마황 엑기스 (실시예 1) 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (실시예 2) 의 MET 키나아제 저해 작용

MET 키나아제 활성은, Poly E4Y1 펩티드를 기질로 한 재조합 MET 키나아제 도메인에 의한 ATP 소비에 수반하는 ADP 의 산생량을 지표로 하였다. 재조합 MET 키나아제 도메인에 Poly E4Y1 펩티드와 ATP 를 함유하는 반응 완충액의 혼합물에, 마황 엑기스 혹은 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (2 로트) 를, 각각 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 및 10 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, 실온에서 1 시간 인큐베이션하였다. 반응 정지 후, ADP-Glo 시약을 사용하여 ADP 량에 의존한 루미놀 발광 강도를 측정하고, 상대 MET 키나아제 활성을 조사하였다.

그 결과, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는 마황 엑기스와 동일한 정도로 MET 키나아제 작용을 저해하는 것이 명확해졌다. 마황 엑기스 (실시예 1) 와 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (실시예 2) 의 MET 키나아제 저해 곡선을 도 4 에 나타낸다.

실시예 8：마황 엑기스 (실시예 1) 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (실시예 2) 의 인간 폐암 유래 H1975 세포의 증식에 대한 억제 효과

H1975 세포는, 미국 생물 자원 뱅크 (ATCC) 로부터 구입하였다. H1975 세포를 10 ％ FCS-RPMI 배지에 현탁하고, 96 웰 배양 플레이트의 각 웰당, 2 × 10³ 개/100 ㎕ 로 파종하였다. 하룻밤 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (3 로트) 를, 각각 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 로 첨가하고, 컨트롤은 10 ％ FCS-RPMI 배지를 첨가하였다. 72 시간 배양한 후, Cell counting kit-8 을 10 ㎕ 로 각 웰에 첨가하고, 4 시간을 배양한 후, 각 웰의 흡광도 (450 ㎚) 를 플레이트 리더로 측정하였다. 각 엑기스의 농도마다 4 웰 측정하고, 그 평균값으로부터 상대 세포수를 산출하였다 (도 5).

그 결과, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는 마황 엑기스와 마찬가지로 인간 폐암 유래 H1975 세포의 증식을 억제하는 것이 명확해졌다.

실시예 9：동물 시험에 있어서의 마황 엑기스 (실시예 1) 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (실시예 2) 의 동통에 대한 억제 효과

실험 동물은 4 주령의 수컷 ICR 마우스를 48 마리 사용하였다. 실험 개시일에 체중 측정을 실시하고, 각 군에서 거의 동일해지도록 컨트롤군, 마황 엑기스 2 군 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 2 군 (1 일 투여량은 각각 350 과 700 ㎎/㎏) 으로 나누었다. 마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스에는 주사용 증류수를 첨가하고, 37 ℃ 에서 30 분간 교반하면서 현탁시켰다. 현탁액은 경구 투여 직전에 볼텍스를 가하고, 균일하게 하고 나서 존데 (sonde) 로 투여하였다. 1 일째와 2 일째에는, 단회의 투여량이 175 ㎎/㎏, 또 375 ㎎/㎏ 로 하여, 하루 2 회 (9 시와 17 시) 를 투여하였다. 3 일째에는, 오전 중에 350 ㎎/㎏ 또는 700 ㎎/㎏ 의 1 회만을 투여하였다.

3 일째의 오전 중의 최종 투여 6 시간 후에 2.5 ％ 포르말린 용액을 20 ㎕ 족저부 피하에 투여하였다. 투여 후 신속하게 마우스를 원주 플라스틱 용기 (내경 116 ㎜, 높이 152 ㎜) 에 넣고 45 분간 비디오 촬영하였다. 동통 관련 행동은 투여 직후부터 10 분후까지 발생하는 제 1 상과 15 분 이후 30 분까지 발생하는 제 2 상을 대상으로 하고, 일정 시간마다 처치한 다리를 핥거나 또는 씹는 행동 시간을 계측하였다. 통계학적 해석은 컨트롤군과 피험 물질 투여군의 동통 행동 시간을 던넷 시험 (Dunnett's test) 으로 실시하고, 유의 수준은 5 ％ 로 하였다.

그 결과, 마황 엑기스는 700 ㎎/㎏ 투여한 경우, 제 2 상의 동통 관련 행동을 유의하게 억제하였다. 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는 350 ㎎/㎏, 및 700 ㎎/㎏ 의 양 투여량으로, 제 2 상의 동통 관련 행동을 농도 의존적으로 유의하게 억제하여, 에페드린 제거 전의 마황 엑기스보다 동통 억제 작용이 높았다 (도 6). 이상의 결과로부터, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는 마황 엑기스보다 높은 동통 억제 효과를 갖는 것이 명확해졌다.

실시예 10： 마황 엑기스 (실시예 1) 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (실시예 2) 의 인플루엔자 바이러스 감염 저해 작용

에세이는 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 MDCK 세포가 용해되는 것을 이용하고, 잔존 세포를 색소로 염색함으로써 검출하였다.

마황 엑기스 및 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스에 대하여, 각각 10 ％ FBS-MEM 으로 200 ㎍/㎖ 의 용액으로 조제하고, 또한 10 단계의 2 배 희석 계열을 제조하여, 시료 용액으로 하였다. 인플루엔자 바이러스 (A/WSN/33 (H1N1) 주) 를 함유하는 액을 10 ％ FBS-MEM 로 1000TCID₅₀/㎖ 로 희석하여, 인플루엔자 바이러스액으로 하였다. MDCK 세포를 10 ％ FBS-MEM 으로 현탁하고, 96 웰 배양 플레이트의 각 웰당, 3 × 10⁴ 개/100 ㎕ 로 파종하였다. 24 시간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 시료 용액 100 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 추가로 100 ㎕ 의 인플루엔자 바이러스액 혹은 10 ％ FBS-MEM 을 첨가하였다. 72 시간 배양한 후, 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 마이크로 플레이트 리더로 각 웰의 560 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 10 ％ FBS-MEM 을 첨가한 계열에서는, 시료 농도 1.56 ∼ 25 ㎍/㎖ 의 범위에 있어서, 어느 엑기스에 있어서도 세포수의 저하는 관찰되지 않았던 점에서, 이 첨가 농도역에서는 세포 독성은 나타나지 않는 것이 확인되었다 (도 7B). 한편, 인플루엔자 바이러스액을 첨가한 계열에서는, 모든 엑기스가 이 시료 농도역에서 농도 의존적으로 세포가 용해되어 있는 것이 관찰되었다 (도 7A). 4 파라미터 로지스틱 곡선의 근사식을 구하고, 그 파라미터로부터 IC₅₀ 값을 산출한 결과, 마황 엑기스에서는 8.6 ㎍/㎖, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스에서는 8.3 ㎍/㎖ 였다. 이상의 결과로부터, 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스는 마황 엑기스와 동일한 정도로 MDCK 세포에 대한 인플루엔자 바이러스의 감염을 저해하는 것이 명확해졌다.

Claims

마황 엑기스로부터 에페드린 알칼로이드를 제거한 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로서, 마황의 추출액/또는 추출물의 수용액에 함유되는 성분 중 양이온 교환 수지에 흡착되지 않는 성분을 함유하는 상기 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스.
제 1 항에 있어서,
에페드린 알칼로이드를 0.23 ％ 이하의 양으로 함유하는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스.
제 1 항에 있어서,
에페드린 알칼로이드를 0.023 ％ 이하의 양으로 함유하는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스.
제 1 항에 있어서,
에페드린 알칼로이드를 0.05 ppm (검출 한계) 이하의 양으로 함유하는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 함유하는 한방 제제.
마황의 추출액 및/또는 추출물로부터 이온 교환 크로마토그래피에 의해 에페드린 알칼로이드를 제거하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하는 항암·항전이약.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하는 동통 억제약.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하는 항인플루엔자 바이러스약.