KR101940372B1

KR101940372B1 - 뇌졸중 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101940372B1
Application number: KR1020160005478A
Authority: KR
Inventors: 박소영; 이진우
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2016-01-15
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2019-01-21
Also published as: KR20170086166A

Abstract

본 발명은 뇌졸중 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 뇌졸중의 예방 및 치료에 현저한 효과를 발휘한다. 특히, 본 발명에 따른 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 간독성을 포함하는 생약 추출물의 생래적인 단점을 현저하게 감소시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 밀몽화에서 분리, 동정된 단일 물질의 뇌졸중의 예방 및 치료에 관한 최초의 용도를 제시한다.

Description

뇌졸중 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Prevention or Treatment of Stroke}

본 발명은 뇌졸중 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

뇌졸중은 한국인의 사망 원인 중 암 다음으로 중요한 요인에 해당한다. 뇌졸중은 크게 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중으로 나눌 수가 있다. 출혈성 뇌졸중은 교통사고 등에 의해서 주로 나타난다. 대부분의 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중에 해당하며, 뇌의 일부분에 혈액의 공급이 중단되는 것이 허혈성 뇌졸중의 원인이다.

대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 신경세포에서 ATP 감소 및 부종(edema)이 발생하며, 결국 신경세포 사멸로 인한 뇌의 광범위한 손상으로 이어진다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippocampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62: 201-208, 1984; Kirino T. Brain Res., 239: 57-69, 1982). 즉, 허혈성 뇌졸중이 시작되고 수 분 이내로 세포들은 손상을 입게 된다.

뇌허혈에 의한 신경세포사 기전은 두 가지가 알려져 있다. 하나는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포 내로 유입되어 결국 과도한 세포 내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전(Kang TC, et al., J. Neurocytol., 30: 945-955, 2001)이고, 다른 하나는 허혈-재관류시에 갑작스러운 산소 공급으로 인한 생체 내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사이다(Won MH, et al., Brain Res., 836: 70-78, 1999; Sub AY., Chen YM., J. Biomed. Sci., 5: 401-414, 1998; Flowers F, Zimmerman JJ. New Horiz. 6: 169-180, 1998).

최근에는 이러한 연구를 바탕으로 하여 뇌허혈시에 나타나는 신경세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 많이 수행되고 있다. 그러나 현재까지 효과적으로 뇌허혈에 의한 신경 세포사를 억제하는 물질은 거의 없는 실정이다.

현재까지 뇌졸중에 사용되고 있는 약물은 주로 혈전용해제나 항혈액응고제(플라스미노겐 활성화인자 또는 아데닐릴시클라이제 활성화 성분)등으로서, 뇌졸중에 따른 세포보호의 직접적인 약물이 아닌 허혈상태를 개선하기 위한 대증요법제가 대부분이다.

또한, 초기의 칼슘 유입을 효과적으로 억제하기 위한 칼슘채널 억제제(calcium channel blocker)인 MK-801의 경우 임상적 테스트가 실행되었으나 그 부작용으로 인해 약품을 폐기한 바 있다.

한편 국내의 경우, 생약 유래의 약제학적 조성물에 관한 특허가 공개되어 있지만, 생약 추출물에 존재하는 수 많은 성분 중 어떠한 성분이 뇌졸중에 직접적이고 약리학적으로 유리한 효과를 발휘하는지에 대해서는 공개된 바 없다.

구체적으로, 대한민국 공개특허 제2006-0019222호는 “신경세포보호 활성이 있는 밀몽화의 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물”을 그 발명의 명칭으로 하는 것으로서, 해당 문헌에는 “신경세포 보호활성을 갖는 밀몽화 조추출물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물”에 관한 발명이 개시되어 있다.

그러나, 상기 발명은 밀몽화의 추출물의 효능을 대략적으로 측정한 것일 뿐, 어떠한 성분이 그 유효한 활성을 갖는지에 대하여는 어떠한 시사나 언급도 없다.

또한, 대한민국 등록특허 제1423875호는 “복합 추출물을 함유하는 뇌졸중 또는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물”을 그 명칭으로 하는 것으로서, 해당 문헌에는 “고사리삼(Sceptridium ternatum), 밀몽화(Buddleja officinalis) 및 황금(Scutellaria baicalensis)의 복합추 출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 또는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물” 에 관한 발명이 개시되어 있다.

그러나, 상기 발명은 밀몽화를 비롯한 여러 생약의 혼합 추출물이 필수적으로 포함되어야 하는 것이어서, 밀몽화의 단독 작용으로 퇴행성 뇌질환을 개선시키는지 여부도 알 수 없을 뿐 아니라, 복합 생약 추출물의 어떠한 성분이 그와 같은 약리학적 활성을 갖는지에 대하여 시사나 언급이 전혀 존재하지 않는다.

이와 같이, 종래 발명에서는 밀몽화의 유효 성분에 대한 동정이 이루어지지 않았다. 따라서 추후 신약으로서의 발전 가능성이 매우 낮았을 뿐만 아니라, 그 정확한 메커니즘을 적용하여 산업적으로 활용되기 어려웠다. 또한, 생약 추출물은 여러 약리성분이 다수 포함되어 있다는 생래적인 한계로 인하여 그 독성이 단일 성분 화합물에 비하여 현저하게 높을 수 밖에 없는 문제를 내포하고 있었다.

따라서, 밀몽화에 포함되어 있는 수천 내지 수만 가지 성분 중에서 뇌졸중에 유효한 성분이 무엇인지 동정될 필요성이 절실하였다.

이에 본 발명의 발명자들은 밀몽화로부터 뇌졸중에 유효한 성분을 추출, 동정 및 평가하여 그 단일한 활성성분을 확인하는 것이 밀몽화의 효능을 산업적으로 이용하는데 절실하다는 점을 인식하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 공개특허 제10-2006-0019222호 대한민국 등록특허 제1423875호

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 밀몽화에서 유효성분을 추출, 분리하고 제형화하는 것을 포함한 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 밀몽화에서 유효성분을 추출, 분리하고 제형화하는 것을 포함한 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 뇌졸중의 예방 및 치료에 현저한 효과를 발휘한다. 특히, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 간독성을 포함하는 생약 추출물의 생래적인 단점을 현저하게 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명은 밀몽화에서 분리, 동정된 단일 물질의 뇌졸중의 예방 및 치료에 관한 최초의 용도를 제시한다.

도 1은 본 발명의 화합물을 얻기 위한 추출물 및 분획물 수득 과정의 일례를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 화합물을 얻기 위한 정제 과정의 일례를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 화합물을 얻기 위한 정제 과정의 또 다른 예를 나타낸 도이다.
도 4는 단일물질로 동정된 화합물 1의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 5는 단일물질로 동정된 화합물 1의¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 6은 단일물질로 동정된 화합물 2의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 7은 단일물질로 동정된 화합물 2의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 화합물 3의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 화합물 3의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 화합물 3의 구조식을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 화합물 3의 정제(추출) 과정에서 수득한 메탄올 추출물의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 화합물 3의 정제(추출) 과정에서 수득한 메탄올 추출물의 PHD 활성 억제능을 확인한 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 화합물 3의 정제(분획) 과정에서 수득한 각 용매에 따른 분획물의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 14는 본 발명에 따른 화합물 3의 정제(분획) 과정에서 수득한 각 용매에 따른 분획물의 PHD 활성 억제능을 확인한 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 화합물 3의 정제 과정에서 수득한 실리카겔 크로마토그래피 분획물의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 16은 본 발명에 따른 화합물 3의 정제 과정에서 수득한 실리카겔 크로마토그래피 분획물의 PHD 활성 억제능을 확인한 도이다.
도 17은 화합물 1 내지 3의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 18은 화합물 3의 PHD 활성 억제능을 확인한 도이다.
도 19는 화합물 3의 PHD2 발현량에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 20은 화합물 3의 HIF-1 발현량에 미치는 효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

<화학식 1>

본 발명의 “약제학적 조성물”이라 함은 사람이나 동물의 질병을 진단·치료·경감·처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품, 및 동물 또는 인간의 건강을 유지·증진·향상시키는데 필요한 모든 조성물을 의미한다.

위 화학식 1의 화합물은 본 명세서에서 “화합물 3”과 동일한 의미로 사용된다.

뇌졸중은 한국인의 사망 원인 중 암 다음으로 중요한 요인에 해당한다. 뇌졸중에는 크게 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중으로 나눌 수가 있다.

본 발명에서 의미하는 “뇌졸중”은 허혈성 또는 출혈성 뇌졸중을 의미하며, 뇌의 허혈 상태로 말미암아 나타나는 병변은 모두 본원 발명의 권리범위에 포함된다.

허혈 상태에서 세포는 이를 극복하기 위하여 많은 반응들을 일으키게 된다. 그 중 가장 중요한 인자가 바로 HIF 단백질이다. HIF-1은 다시 α와β 형태로 나눌 수가 있는데, 그 중 HIF-1α는 산소에 민감하게 반응하며, PHD2에 의해 분해된다. 하지만 허혈 상태가 되면 PHD가 HIF-1α를 분해할 수 없게 되며, HIF-1β와 결합하여 HIF-1 complex를 이루게 되고, 표적 단백질을 발현시킨다. HIF-1의 표적 단백질은 VEGF, EPO, HO-1, Glut-1 등이 있으며, 이는 혈관 생성, 철의 대사, 혈관 운동 조절, 포도당 대사 등에 관여하게 되어 손상 받은 세포를 회복시키는 역할을 한다.

따라서, HIF를 활성화시키거나 발현량을 증가시키는 작용, 또는 PHD를 억제하거나 발현량을 감소시키는 작용을 하는 물질을 찾는 것은 뇌졸중, 특히 허혈성 뇌졸중의 치료 및 예방에 있어 매우 중요하다.

본 발명의 화합물 3은 독성이 없는 범위에서도 PHD의 활성을 억제할 뿐만 아니라 그 발현량을 억제하는 것에 상응하여 HIF의 발현량을 증가시키는 것이 확인되었다(도 17 내지 20 참조).

이는 종래 (허혈성) 뇌졸중의 대증요법제로 활용되었던 혈관 확장제나 혈액응고 방지제와 달리 본 발명의 화합물 3은 뇌졸중의 직접적인 원인을 제어할 수 있는 원인요법제로 활용될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 포함되는 화합물 3의 염은 무기산, 유기산, 무기 염기 또는 유기 염기와의 생리학적으로 허용되는 염일 수 있다.

상기 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 및 인산이 예시될 수 있고, 유기산은 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등이 예시될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 화합물 3은 화학적으로 합성되거나 천연물로부터 추출하여 수득될 수 있다. 본 발명의 화합물 3은 스테로이드 모핵 구조를 가진 것으로서, 당업계의 화학자로부터 용이하게 합성될 수 있으나, 해당 화합물의 뇌졸중 용도에 관해서는 전혀 알려진 바가 없었다.

본 발명의 발명자들은 PHD를 억제하는 물질을 찾기 위해 400여 가지의 생약 라이브러리를 이용하여 luciferase assay를 통해 PHD를 줄여주는 물질에 대한 스크리닝을 진행하였고, 그 중 밀몽화를 선정하였다.

따라서, 본 발명의 3을 천연물로부터 추출하는 경우에는 밀몽화(Buddleja officinalis)로부터 분리하는 것이 바람직하다.

밀몽화의 꽃봉오리는 한국과 중국에서 전통적인 약초이며, 종래 연구에서는 플라보노이드(flavonoids), 트리테르페노이드(triterpenoids), 사포닌(saponins), 페닐에타노이드(phenylethanoids) 등이 분리되었다(Tai, B. H., Nhiem, N. X., Quang, T. H., Ngan, N. T. T., Tung, N. H., Kim, Y., Lee, J. J., Myung, C. S., Cuong, N. M., & Kim, Y. H. A new iridoid and effect on the rat aortic vasular smooth musle cell proliferation of isolated compounds from Buddleja officinalis. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2011, 21, 3462-3466등). 그러나 현재까지 이와 같은 여러 성분들 중에서 뇌졸중에 유효한 효과를 발휘한다고 명확하게 동정된 것은 없었다.

본 발명은 밀몽화로부터 화합물 3을 추출, 분리하고 제형화하는 것을 포함한 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 포함되는 화합물 3을 추출법에 의해서 수득하는 경우 그 추출 방법은 냉침추출법, 온침추출법, 열 추출법, 초음파 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 포함되는 화합물 3의 분리는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 달성할 수 있다. 이중 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이 좋다.

상기 추출에 이용되는 용매는 바람직하게는 50 내지 100 %(v/v), 더 바람직하게는 50 %(v/v) 내지 99 %(v/v)의 희석수가 좋다.

밀몽화를 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 추출물은 추출 후, 밀몽화 찌꺼기를 제거하고, 필터 페이퍼로 여과한 후 여액을 진공회전농축기 또는 진공건조기를 사용하여 농축한 다음 실온에서 보관할 수 있다.

상기 추출물은 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어지는 그룹에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 동시 또는 순차적으로 분획과정을 더 실시할 수 있다.

상기 분획에 이용되는 용매는 바람직하게는 50 %(v/v) 내지 100 % (v/v), 더 바람직하게는 50 %(v/v) 내지 99 %(v/v)의 희석수가 좋다.

상기 분획물은 진공회전농축기 또는 진공건조기를 사용하여 농축한 후, 실온에서 보관할 수 있다.

상기 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어지는 그룹에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 동시 또는 순차적으로 분획과정을 실시하여 얻어진 분획물은 실리카젤 크로마토그래피법 또는 중압액체 크로마트그래피법(MPLC)을 통해 추가적으로 분리할 수 있다.

상기 크로마토그래피법에 사용되는 용매는 제한되지 않으나, 바람직하게는 메탄올, 헥산, 아세톤, 에틸아세테이트, 아세토니트릴 및 메칠렌클로라이드로 이루어지는 그룹에서 선택된 1종 이상의 용매를 예로 들 수 있다.

상기 크로마토그래피법으로 분리되거나 화학적 합성법에 의해 합성된 화합물 3은 불활성 담체, 희석제, 또는 이들 둘 다를 포함하여 환자에게 투여 가능하도록 제형화 될 수 있다.

상기 불활성 담체 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 옥수수전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 시트르산, 타르타르산, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 위에 예시된 담체, 희석제를 포함한 첨가제를 포함하여 경구 또는 비경구 제제로 제형화 될 수 있다.

경구 투여를 위한 제제에는 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 현탁화제 및 시럽제 등이 포함된다. 비경구투여를 위한 형태는 크림제, 로션제, 연고제, 액제, 겔제, 카타플라스마제, 패취제, 에어로솔제, 유동엑스제, 엘릭서, 침제, 향낭, 주사제 등의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 사용가능한 다른 적절한 윤활제 및 추가 부형제는 하기 문헌들에 기술되어 있다. [Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th Edition, American Pharmaceutical Association; The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3th Edition, Lachman, Leon, 1976; Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Volume 1~3 Edition, Lieberman, Hebert A.,외, 1989; Modern Pharmaceutics, Banker, Gilbert and Rhodes, Christopher T, 1979; 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, 1975]

본 발명에 따른 화합물 3을 포함하는 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 인간을 포함한 동물에 적용될 수 있다.

상기 적용시의 투여량은 대상, 투여 방법, 대상의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물 등을 고려하여 결정할 수 있으며, 1일 유효 성분을 기준으로 하였을 때 인간의 경우 0.1 mg 내지 10 g의 범위에서 조절할 수 있으며, 인간을 제외한 동물의 경우 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 바람직하게는 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 더 바람직하게는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있다.

상기 투여는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 내 화합물 3의 함량은 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 0.1 중량% 내지 99 중량%, 또는 1 중량% 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용 방법에 따라 상기 화합물의 함량은 바람직한 함량으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 상기 화합물 3 이외에, 공지의 뇌졸중 개선의 대증요법적 효과가 있는 것으로 당업계에 알려진 물질을 추가적으로 포함할 수 있다.

그 예로는 쿠마린 유도체, 헤파린 유도체 및 비타민 K 길항제를 포함하는 혈액 응고 억제제; 아스피린 등을 포함하는 시클로옥세게나아제 억제제, 실로스타졸 등을 포함하는 포스포디에스터라아제 억제제, 클로피도그렐 등을 포함하는 아데닐레이트 시클라아제, 사포그릴레이트 등을 포함하는 항세로토닌제, 베라프로스트 등을 포함하는 프로스타글란딘 유도체, 티로피반등을 포함하는 GPIIb-IIIa 길항제 등을 포함하는 항혈소판제; 유로키나아제 등을 포함하는 혈전용해제; 다비가트란 등을 포함하는 트롬빈 저해제; 아픽사반, 은행잎 엑스, 나파모스타트, 리바록사반, 티클로피딘, 티카그렐러 등을 더 포함할 수 있다. 더 바람직하게는 아스피린, 실로스타졸, 클로피도그렐, 사포그릴레이트, 베라프로스트, 티로피반, 유로키나아제, 다비가트란, 아픽사반, 은행잎 엑스, 나파모스타트, 리바록사반, 티클로피딘, 티카그렐러로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 밀몽화 추출물 및 분획 추출물의 제조

1. 밀몽화의 메탄올 또는 에탄올 추출물의 제조

불순물이 제거된 밀몽화 4 kg에 90 % 메탄올을 가하여 24시간 상온에 침지시킨 후 여과지로 여과한 다음, 여액을 진공회전농축기 (EYELA)를 사용하여 농축하였다. 이 과정을 세 번 반복하고, 농축액은 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하여 메탄올 추출물 총 432 g을 수득하였다(도 1 참조).

또는, 불순물이 제거된 밀몽화 1 kg에 90 %의 에탄올을 가하여 위와 동일한 공정을 거쳐 98 g의 추출물을 얻었다.

2. 밀몽화의 분획 추출물의 제조

상기 농축된 밀몽화 메탄올 또는 에탄올 추출물을 극성의 차이를 이용하여 섞이지 않는 두 가지 용매로 각각 분획 하였다. 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물 층으로 순차적으로 분획하여 농축하며, 이 과정을 3번 반복 하였다. 농축액은 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하였다. 추출물은 각각 헥산 층 72.5 g, 메틸렌클로라이드 층 52 g, 에틸아세테이트 층 120 g, n-부탄올 층은 80 g, 물 층은 100 g을 수득하였다(도 1 참조).

실시예 2. 화합물 1 내지 3의 분리 정제

상기 분획한 헥산 층 추출물(72.5 g)을 일차적으로 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피에 적용하였다. 이동상으로는 100 % 헥산에서 100 % 아세톤을 사용하였으며, 총 8개의 fraction을 얻었다(BOH 1~8). 이 중 luciferase assay와 MTT assay 결과를 바탕으로 BOH4와 BOH5의 추가적인 실리카겔 컬럼그로파토그래피를 진행하였다(도 2 및 도 3 참조).

BOH 4의 경우 이동상은 헥산과 에틸아세테이트로 7 % 에틸아세테이트에서 60 % 에틸아세테이트, 마지막은 100 % 에틸아세테이트를 사용하였으며, 7 개의 fraction(BOH 4-1~4-7)을 얻었다. BOH 4-7을 이용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 진행하였고, 이동상은 헥산과 에틸아세테이트로 10 % 에틸아세테이트에서 100 % 에틸아세테이트로 진행하였고, 4 개의 fraction(BOH 4-7-1~4-7-4)을 얻었다. 그 중 BOH 4-7-3을 이용하여 RP-18 겔 컬럼크로마토그래피를 이용하였고, 이동상은 80 % 메탄올을 이용하였다. 네 개의 fraction(BOH 4-7-3-1~4-7-3-4)을 얻었고, 그 중 BOH 4-7-3-2를 이용하여 70 % 메탄올을 이동상으로 하는 RP-18 크로마토그래피를 진행하여 화합물 1(6.8mg)과 화합물 2(2.5 mg)를 얻었다(도 2 참조).

BOH 5의 경우 이동상으로 헥산과 에틸아세테이드, 20 % 에틸아세테이드에서 90 % 에틸아세테이트를 이용하여 실리카겔 크로마토그래피를 진행하여 6개의 fraction(BOH 5-1~5-6)을 얻었다. 그 중 BOH 5-3을 이용하여 실리카겔 크로마토그래피를 진행하였으며, 100 % 헥산에서 50 % 에틸아세테이트를 이동상으로 사용하여 5개의 fraction(BOH 5-3-1~5-3-5)을 얻었다. BOH 5-3-3을 이용하여 RP-18 겔 크로마토그래피를 이용하여 60 % 메탄올을 이동상으로 하여 화합물 3(24.7 mg)을 얻었다(도 3 참조).

실시예 3. 화합물 3의 구조 동정

본 발명에 따른 천연물 추출법에 따라 단일물질이 3종(화합물 1 내지 3) 분리되었으나, 화합물 1 및 2의 경우 세포 독성이 심하거나 PHD 활성 억제능이 떨어졌다. 따라서, 화합물 1 내지 3 모두 NMR을 측정하였지만(도 4 내지 9 참조) 단지 화합물 3만 그 구조를 분석하여 화합물을 동정하였다(도 8 내지 10 참조).

화합물 1 내지 3은 모두 Avance Ⅲ 700MHz, Bruker (Germany)를 이용하여 당업자의 통상적인 방법으로 측정하였다. 그 결과 화합물 3은 다음 화학식 I의 화합물로 동정되었다.

[화학식 1]

실험예 1. 메탄올 추출물의 세포 독성 확인

실시예 1의 메탄올 추출물이 세포에 독성을 미치는지 평가하기 위하여 MTT-based cytotoxicity assay를 시행 하였다. 96 well plate에 PHD-CHO(PHD가 과발현 된 CHO 세포) 세포를 8시간 배양한 뒤 약물처리 한 후 2 시간 뒤에 CoCl₂를 처리하여 Hypoxia를 유도하였고, 그 후 세포를 18시간 배양한 후 5 mg/ml 농도의 MTT 용액을 넣고 3시간 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO를 넣어 30분간 용해시킨 후 Emax precision microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 90 %의 메탄올 추출물 100 ug/ml의 농도에서도 세포 독성이 없다는 것을 확인하였다(도 11 참조).

실험예 2. 메탄올 추출물의 PHD 활성 억제능 확인

실시예 1-1에서 추출한 메탄올 추출물의 PHD 활성 억제능을 평가하기 위하여 PHD luciferase assay를 진행하였다. 96 well plate에 8시간 동안 배양한 PHD-CHO세포들에 약물처리를 하고, 그로부터 2 시간 뒤에 CoCl₂ 처리한 다음 18시간 배양한 후 Luciferase Assay를 진행하였다. 배지를 제거한 후 lysis buffer를 이용하여 세포를 용해한 뒤 reaction buffer를 각 well 당 100ul씩 넣어준 뒤 luminometer plate로 옮겨 Centro XS3 LB 960 Microplate Luminometer이용하여 측정하였다.

그 결과 농도 의존적으로 PHD 활성이 억제되었으며, 실험군의 100 ug/ml 농도에서 대조군(DMSO외에 아무런 처리도 되지 않음)에 상응할 정도로 PHD 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 12 참조).

실험예 3. 분획 추출물의 독성 확인

실시예 1-2의 분획 추출물의 세포 독성을 평가하기 위하여 MTT-based cytotoxicity assay를 시행 하였다. 실험군의 농도를 각각 20 ug/ml, 50 ug/ml 및 100 ug/ml으로 설정한 것을 제외하고는 실험예 1과 동일하게 진행하였다.

그 결과, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 20 ug/ml과 부탄올 전체 농도에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다(도 13 참조).

실험예 4. 분획 추출물의 PHD 활성 억제능 확인

실시예 1-2의 분획 추출물의 PHD 활성 억제능을 평가하기 위하여 PHD luciferase assay를 진행하였다. 앞서 실험예 3의 세포 독성 결과를 바탕으로 무독성을 나타내는 범위에서만 평가하였다. 그 결과, 헥산 20 ug/ml에서 가장 좋은 효과를 확인 하였다(도 14 참조).

실험예 5. 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피 분획물의 세포 독성 및 PHD 활성 억제능 평가

헥산층의 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피의 결과로 얻어진 8개의 fraction (BOH 1~8)에 대한 세포 독성과 PHD 활성 억제능을 평가하였다. 세포 독성 및 PHD 활성 억제에 관한 실험방법은 실험군의 적용 농도를 제외하고는 실험예 1 및 2와 동일하게 진행하였다. 8개의 fraction은 전부 20 ug/ml의 농도로 진행되었으며, BOH 2, 4, 5 및 7에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였고, 독성이 없는 fraction을 이용하여 PHD 활성 억제능을 확인하였다. 그 결과 BOH 2, 4 및 5에서 PHD 활성 억제능을 보였으며, 그 중 BOH 4와 5에서 가장 좋은 효과를 보였다(도 15 및 도 16 참조).

실험예 6. 화합물 1 내지 3의 세포 독성평가

분리된 단일 화합물 1 내지 3의 세포 독성을 평가하였다. 세포 독성에 관한 실험방법은 실험군의 적용 농도를 제외하고는 실험예 1과 동일하게 진행하였다. 화합물 1과 2는 7.5 ug/ml에서 약간의 독성을 보였으며 나머지 농도에서도 독성을 나타내었다. 반면 화합물 3은 30 ug/ml에서도 독성이 없는 것을 확인할 수 있었다(도 17 참조).

실험예 7. 화합물 3의 PHD 활성 억제 효능 평가

실험예 6에서 독성이 없는 것으로 확인된 화합물 3을 이용하여 PHD 활성 억제능을 평가하였다. 실험 방법은 실험군의 적용 농도를 제외하고는 실험예 2와 동일하게 진행하였다. 그 결과, 농도 의존적으로 PHD를 억제하는 것을 알 수 있었고, 30 ug/ml의 농도에서 가장 좋은 PHD 활성 억제능을 확인할 수 있었다(도 18 참조).

실험예 8. 화합물 3의 PHD 및 HIF -1 α 발현량 평가

허혈 상태에서 신경세포 보호에 중요한 인자인 HIF-1α와 HIF-1α의 상위 단백질인 PHD2의 양을 western blot analysis를 통해 알아보았다. 6 well dish에 8시간 동안 배양한 PHD-CHO세포들에 30 μg/ml의 농도로 화합물 3을 처리한 후 2 시간 뒤 CoCl₂를 처리한 뒤 18시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 laemmli sample buffer를 이용하여 단백질을 모은다. 100 ℃ 끓는 물에 10분 동안 끓인 후 사용할 때까지 -20 ℃에 보관하였다. 7.5 % gel Acrylamide gel로 전기영동을 통해 단백질을 분리한 후 PVDF membrane으로 옮겼다. PVDF membrane의 항체에 대한 비특이적 결합을 차단하기 위하여 blocking buffer (5% skin milk in PBS) 용액에서 1시간 동안 반응 시킨 후 Tween 20을 함유한 PBS 용액 (0.1% PBST)으로 15분간 3번 세척 후 각 검증 단백질에 대한 1차 항체를 첨가하여 4℃에서 12시간 반응시켰다. 사용한 1차 항체는 PHD2 rabbit antibody (Novus, Colorado, USA), HIF-1α rabbit antibody (Santa Cruz biotechnology, Texas, USA), Tubulin antibody (Santa Cruz biotechnology, Texas, USA)이며, PBST 용액으로 15분간 3번 세척한 다음 2차 항체 (5% skin milk in PBS)로 1시간 반응시켰다. 이어서 ECL-spray (Advanta, CA, USA)로 반응시킨 후 G:Box iChemiXT Imager (Syngene, Cambridge, UK) 상에서 단백질을 확인하였다.

그 결과, 화합물 3의 농도와 반비례하여 PHD2의 발현량이 감소하였으며, 동시에 화합물 3의 농도와 비례하여 HIF-1α의 발현량이 증가하는 것을 알 수 있었다(도 19 및 20 참조).

Claims

하기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.

[화학식 1]
청구항 1에 있어서,
상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 염은 무기산, 유기산, 무기 염기 또는 유기 염기와의 생리학적으로 허용되는 염인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 화학적으로 합성되거나 천연물로부터 추출하여 수득할 수 있는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 천연물로부터 추출 시에는, 밀몽화(Buddleja officinalis)로부터 분리하여 수득하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
청구항 5에 있어서,
상기 분리는 밀몽화를 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 달성되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
청구항 6에 있어서,
상기 용매 추출물을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어지는 그룹에서 선택된 1종 이상의 용매로 동시 또는 순차적으로 분획하여 달성되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 분획물을 실리카젤 크로마토그래피법 또는 중압액체 크로마토그래피법(MPLC)에 적용하여 단일 물질 분리가 달성되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 불활성 담체, 희석제, 또는 이들 둘 다를 포함하는 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구형 제제로 제형화된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
청구항 10에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 현탁화제, 시럽제, 크림제, 로션제, 연고제, 액제, 겔제, 카타플라스마제, 패취제, 에어로솔제, 유동엑스제, 엘릭서, 침제, 향낭 및 주사제로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나의 제제로 제형화된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
삭제
i) 밀몽화(Buddleja officinalis)를 메탄올, 에탄올 이소프로판올 및 프로판올로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 용매로 추출하는 단계,
ii) 위 단계에서 얻어진 추출물을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어지는 그룹에서 선택된 1종 이상의 용매로 동시 또는 순차적으로 분획하는 단계;
iii) 위 단계에서 얻어진 분획물을 실리카젤 크로마토그래피법 또는 중압액체 크로마토그래피법(MPLC)에 적용하는 단계; 및
iv) 위 단계에서 분리된 하기 화학식 1의 화합물을 환자에게 투여 가능하도록 제형화하는 단계
를 포함하는 제1항에 따른 약제학적 조성물의 제조방법.

[화학식 1]