CN111812219A - 一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，前处理过程简单、灵敏度高、分析时间短、样本用量少，4.5分钟之内完成抗凝血药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗凝血药物的定量分析，为临床上抗凝血药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

Description

一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法

技术领域

本发明属于血浆检测技术领域，具体涉及一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，具体抗凝血药物为：达比加群(Dabigatran，DBT)、利伐沙班(Rivaroxaban，RXB)和阿哌沙班(Apixaban，AXB)。

背景技术

治疗药物监测(TDM)是针对不同患者个体，量体裁衣式地制定给药方案的一种方法。通过定量测定血浆或血浆中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低毒副作用。LC-MS/MS的方法可以实现快速、高通量、准确的检测体内抗凝血药物浓度，为临床上实时监测体内抗凝血药物浓度，达到最佳的治疗效果，尽可能的减少不良反应的发生。

达比加群(DBT)是一种强极性的两性化合物，不溶于有机溶剂，达比加群酯是前药，在体内被转化为达比加群而发挥抗凝作用。达比加群酯是一种人工合成的新型口服抗凝抑制剂，它能可逆地竞争性抑制凝血酶活性，属于非肽类凝血酶抑制剂。其口服后通过消化道迅速吸收，在血浆和肝脏内通过酯酶水解可以产生活性代谢产物达比加群，通过抑制凝血酶发挥抗凝活性。利伐沙班(RXB)和阿哌沙班(AXB)均属于选择性Ⅹa因子抑制剂，它不需要抗凝血酶Ⅲ参与，可直接拮抗游离和结合的Ⅹa因子，临床用于择期髋关节或膝关节置换术的成年患者，以预防静脉血栓形成。

目前，已有文献报道采用HPLC-UV和LC-MS/MS法测定血浆中的药物含量。中国临床药理学杂志第35卷第10期2019年5月，题为“液质联用法同时测定人血浆中达比加群和利伐沙班的浓度”的文章使用同位素内标定量，且前处理简单，血浆样品200μL进行蛋白沉淀处理，定量下限为2ng/mL，运行时间为6min，进样量10μL。国外已报道同时测定这三种药的LC-MS/MS方法(Bioanalysis,2016,8(4),275-283)，虽然定量下限为1ng/mL，但采用固相萃取处理样本，操作繁琐，而且运行时间为10min。中国专利(CN104730165B)公开了“一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法”，该发明分析时间8min，采用外标法定量，缺乏准确性。

总之，目前现有的方法存在操作步骤繁琐、血浆用量大、单个样品分析时间长、灵敏度低或使用外标法准确性差，检测项目单一等缺点。此外，由于临床样本极其珍贵，因此前处理样本量尽量少，且进样量过大会严重污染仪器，增加仪器维护成本。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法。

本发明的技术方案如下：

一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，

所述抗凝血药物分别为：达比加群(DBT)、利伐沙班(RXB)和阿哌沙班(AXB)；

上述抗凝血药物对应的同位素内标物分别为：达比加群-13C6(DBT-13C6)、利伐沙班-d4(RXB-d4)和阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)；

血浆样本中加入混合内标工作液涡旋均匀，加入蛋白沉淀剂，涡旋振荡，离心后取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗凝血药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗凝血药物的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：0.001％～0.01％甲酸水溶液；流动相B：流动相B为0.001％～0.01％甲酸甲醇溶液；

色谱柱型号：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm，2.7μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至90:10每个样品采集时间为4.5分钟；

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为0.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。

为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A和流动相B中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗凝血药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，4.5min之内完成抗凝血药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.001％～0.005％甲酸水溶液，流动相B为0.001％～0.005％甲酸甲醇溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.004％甲酸水溶液，流动相B为0.004％甲酸甲醇溶液。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.001％～0.01％甲酸水溶液和0.001％～0.01％甲酸甲醇溶液作为流动相，色谱柱型号：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm，2.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，4.5min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。

在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用达比加群-13C6(DBT-13C6)、利伐沙班-d4(RXB-d4)和阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中抗凝血药物时的重现性、准确度均较好。

在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。

进一步地，柱温为30～50℃，优选为40℃。

更进一步地，进样体积为0.2～10μL，优选为1μL。

在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物时，具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：0.004％甲酸水溶液；

流动相B：0.004％甲酸甲醇溶液；

色谱柱型号：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm，2.7μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至90:10每个样品采集时间为4.5分钟；具体梯度洗脱过程见表1；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL；

表1流动相梯度洗脱参数

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为0.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物DBT(472.2→289.1)、RXB(436.3→144.8)和AXB(460.3→199.1)以及同位素内标DBT-13C6(478.2→295.1)、RXB-d4(440.3→144.9)和AXB-13C,d3(464.4→447.3)。各目标待测物的质谱采集参数见表2。

表2抗凝血药物检测质谱参数

本发明提及的血浆为人或动物血浆。

在一种方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为乙腈。

在一种优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入180μL乙腈，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。

在一种更优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL乙腈,高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

在一种方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：

将50μg/mL达比加群-13C6(DBT-13C6)同位素内标母液、25μg/mL利伐沙班-d4(RXB-d4)同位素内标母液和50μg/mL阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)同位素内标母液以乙腈水溶液配制成包含有500ng/mL达比加群-13C6(DBT-13C6)、250ng/mL利伐沙班-d4(RXB-d4)和500ng/mL阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)的混合内标溶液。

取100μL混合内标溶液，加入900μL乙腈水溶液，混合均匀得混合内标工作液。

进一步地，制备混合内标工作液时，采用的乙腈水溶液为50％～90％乙腈水溶液；优选为70％～90％乙腈水溶液；更优选为80％乙腈水溶液。

在一种优选方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：

将50μg/mL达比加群-13C6(DBT-13C6)同位素内标母液、25μg/mL利伐沙班-d4(RXB-d4)同位素内标母液和50μg/mL阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)同位素内标母液以80％乙腈水溶液配制成包含有500ng/mL达比加群-13C6(DBT-13C6)、250ng/mL利伐沙班-d4(RXB-d4)和500ng/mL阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)的混合内标溶液；

取100μL混合内标溶液，加入900μL80％乙腈水溶液，混合均匀得混合内标工作液。其中，混合内标工作液中包含：50ng/mL达比加群-13C6(DBT-13C6)、25ng/mL利伐沙班-d4(RXB-d4)和50ng/mL阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)。

在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：

将2mg/mL达比加群(DBT)标准品母液、2mg/mL利伐沙班(RXB)标准品母液和2mg/mL阿哌沙班(AXB)标准品母液以乙腈水溶液配制成包含有20000ng/mL达比加群(DBT)、10000ng/mL利伐沙班(RXB)和20000ng/mL阿哌沙班(AXB)的混合标准溶液。

将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：

达比加群(DBT)和阿哌沙班(AXB)的浓度相同，七个浓度依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。

利伐沙班(RXB)的七个浓度依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

进一步地，制备混合标准溶液时，采用的乙腈水溶液为50％～90％乙腈水溶液；优选为70％～90％乙腈水溶液；更优选为80％乙腈水溶液。

进一步地，空白血浆基质为不含抗凝血目标药物的空白血浆。

在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：

将2mg/mL达比加群(DBT)标准品母液、2mg/mL利伐沙班(RXB)标准品母液和2mg/mL阿哌沙班(AXB)标准品母液以80％乙腈水溶液配制成包含有20000ng/mL达比加群(DBT)、10000ng/mL利伐沙班(RXB)和20000ng/mL阿哌沙班(AXB)的混合标准溶液。

将上述混合标准溶液以空白血浆基质(不含抗凝血目标药物的空白血浆)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点。

每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL乙腈,高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

本发明提及的乙腈水溶液的浓度一般指体积浓度。

本发明还包括制备质控品，所述质控品为含有抗凝血药物的空白血浆，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。其中，

QC(L)为上述混合标准溶液以空白血浆基质稀释至5000倍；

QC(M)为上述混合标准溶液以空白血浆基质稀释至500倍；

QC(H)为上述混合标准溶液以空白血浆基质稀释至50倍。

优选地，空白血浆基质为不含抗凝血目标药物的空白血浆。

在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准溶液以不含抗凝血目标药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表3所示。

表3抗凝血药物质控品对应浓度(单位ng/mL)

QC(L)中包含：4ng/mL达比加群(DBT)、2ng/mL利伐沙班(RXB)和4ng/mL阿哌沙班(AXB)。

QC(M)中包含：40ng/mL达比加群(DBT)、20ng/mL利伐沙班(RXB)和40ng/mL阿哌沙班(AXB)。

QC(H)中包含：400ng/mL达比加群(DBT)、200ng/mL利伐沙班(RXB)和400ng/mL阿哌沙班(AXB)。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，前处理过程简单、灵敏度高、分析时间短、样本用量少，4.5分钟之内完成抗凝血药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗凝血药物的定量分析，为临床上抗凝血药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

附图说明

图1为抗凝血药物标准品的提取离子流色谱图；

图2为血浆样本中抗凝血药物标准品的提取离子流色谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

一、实验材料与仪器

1.材料

样本来自于上海中山医院2019年9月份门诊收集的血浆样本。

(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。。

(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)：AgilentPoroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm，2.7μm)(Agilent Corporation)。

(3)标准品：达比加群、利伐沙班、利伐沙班-d4、阿哌沙班和阿哌沙班-13C,d3均购自于TRC，达比加群-13C6购自于ALSACHIM。

(4)质控品：含有抗凝血药物的空白血浆基质，分低中高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表3所示。

二、液质条件

(1)色谱条件：流动相A：0.004％甲酸-水溶液；流动相B：0.004％甲酸-甲醇溶液。色谱柱型号：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm，2.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。

(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为0.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标，见表2。

三、实验过程

(1)标准品配制：

将2mg/mL达比加群(DBT)标准品母液、2mg/mL利伐沙班(RXB)标准品母液和2mg/mL阿哌沙班(AXB)标准品母液以乙腈水溶液配制成包含有20000ng/mL达比加群(DBT)、10000ng/mL利伐沙班(RXB)和20000ng/mL阿哌沙班(AXB)的混合标准溶液。

将上述混合标准溶液以空白血浆基质(不含抗凝血目标药物的空白血浆)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点。

所述校准品溶液的七个浓度点为：

达比加群(DBT)和阿哌沙班(AXB)的浓度相同，七个浓度依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

利伐沙班(RXB)的七个浓度依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

(2)混合内标工作液配制

将50μg/mL达比加群-13C6(DBT-13C6)同位素内标母液、25μg/mL利伐沙班-d4(RXB-d4)同位素内标母液和50μg/mL阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)同位素内标母液以80％乙腈水溶液配制成包含有500ng/mL达比加群-13C6(DBT-13C6)、250ng/mL利伐沙班-d4(RXB-d4)和500ng/mL阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)的混合内标溶液；

取100μL混合内标溶液，加入900μL80％乙腈水溶液，混合均匀得混合内标工作液。其中，混合内标工作液中包含：50ng/mL达比加群-13C6(DBT-13C6)、25ng/mL利伐沙班-d4(RXB-d4)和50ng/mL阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)。

(3)质控品配制：

控品按照如下方法制备：取上述混合标准溶液以不含抗凝血目标药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表3所示。

QC(L)中包含：4ng/mL达比加群(DBT)、2ng/mL利伐沙班(RXB)和4ng/mL阿哌沙班(AXB)。

QC(M)中包含：40ng/mL达比加群(DBT)、20ng/mL利伐沙班(RXB)和40ng/mL阿哌沙班(AXB)。

QC(H)中包含：400ng/mL达比加群(DBT)、200ng/mL利伐沙班(RXB)和400ng/mL阿哌沙班(AXB)。

(4)样品处理

1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL乙腈,高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

2)血浆样品前处理：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL乙腈,高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血浆样品前处理一致，此处不再赘述。

四、方法验证

1.提取离子流色谱图：抗凝血药物的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗凝血药物标准品的提取离子流色谱图；图2为血浆样本中抗凝血药物标准品的提取离子流色谱图。

2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。抗凝血药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表4。

表4抗凝血药物线性回归方程及线性相关系数

3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。随机选取一例人血浆样品，其中1个不加标准品，其它3个分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，抗凝血药物的加标回收率在93.84％-106.42％之间，5次重复试验的RSD在2.57％-8.22％范围，统计结果见表5。

表5抗凝血药物加标回收率结果

4.精密度试验：取无干扰空白血浆样本，加入不同浓度抗凝血药物标准品，得到低、中、高三个浓度血浆样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗凝血药物的浓度，批内精密度为1.65-9.51％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.82-8.02％，结果见表6。

表6批内批间精密度测试结果

五、讨论

本发明建立了一种超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS/MS)，同时测定人体血浆中3种抗凝血药物的方法。针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。再者，因为临床样本极其珍贵，因此前处理样本用量尽量要少，且进样量大也会严重污染仪器，增加仪器维护成本。本发明的检测方法血浆用量少(仅需50μL)，进样量1μL，且前处理简单，蛋白沉淀一步到位，且一针分析多种物质只需4.5分钟，简单快速。

以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗凝血药物的加标回收率为93.84％-106.42％之间，5次重复试验的RSD为2.57％-8.22％，准确度良好。方法的重现性结果表明，抗凝血药物批内精密度为为1.65-9.51％，批间精密度为2.82-8.02％，方法的重现性良好。

总之，本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，4.5分钟之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血浆抗凝血药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，

所述抗凝血药物分别为：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班；

上述抗凝血药物对应的同位素内标物分别为：达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3；

采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗凝血药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗凝血药物的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：0.001％～0.01％甲酸水溶液；流动相B：0.001％～0.01％甲酸甲醇溶液；

色谱柱型号：Agilent Poroshell 120EC-C18；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至90:10每个样品采集时间为4.5分钟；

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为0.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述流动相A为0.001％～0.005％甲酸水溶液；流动相B为0.001％～0.005％甲酸甲醇溶液；流速为0.2～0.5mL/min；柱温为30～50℃；进样体积为0.2～10μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述流动相A为0.004％甲酸水溶液，流动相B为0.004％甲酸甲醇溶液；所述流速为0.3mL/min；所述柱温为40℃；所述进样体积为1μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物血浆。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为乙腈。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入180μL乙腈，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，

所述混合内标工作液按照如下方法制备：

将50μg/mL达比加群-13C6同位素内标母液、25μg/mL利伐沙班-d4同位素内标母液和50μg/mL阿哌沙班-13C,d3同位素内标母液以乙腈水溶液配制成包含有500ng/mL达比加群-13C6、250ng/mL利伐沙班-d4和500ng/mL阿哌沙班-13C,d3的混合内标溶液；

取100μL混合内标溶液，加入900μL乙腈水溶液，混合均匀得混合内标工作液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述标准品按照如下方法制备：

将2mg/mL达比加群标准品母液、2mg/mL利伐沙班标准品母液和2mg/mL阿哌沙班标准品母液以乙腈水溶液配制成包含有20000ng/mL达比加群、10000ng/mL利伐沙班和20000ng/mL阿哌沙班的混合标准溶液；

将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：

达比加群和阿哌沙班的浓度相同，七个浓度依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

利伐沙班的七个浓度依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，

所述乙腈水溶液为50％～90％乙腈水溶液；优选为70％～90％乙腈水溶液；更优选为80％乙腈水溶液。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，

所述空白血浆基质为不含抗凝血目标药物的空白血浆。

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