CN111398451A - 超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素的方法 - Google Patents

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素的方法，将血清样本与所有待测物的混合内标溶液混合，样本无需衍生化处理，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，灵敏度高，特异性强，检测种类较多，5分钟之内可同时检测9种水溶性维生素，可用于临床上血清水溶性维生素的诊断及健康评估。

Description

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素 的方法
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素的方法。
背景技术
水溶性维生素是能在水中溶解的一组维生素，常是辅酶或辅基的组成部分。主要包括 B族维生素和维生素C。其中，B族维生素包括维生素B1(Thiamine，VB1)、维生素B2(Riboflavin，VB2)、维生素B3(Nicotinamide，VB3)、维生素B5(Pantothenic acid， VB5)、维生素B6(Pyridoxic Acid，VB6)、维生素B7(Biotin，VB7)、维生素B12 (Cyanocobalamin，VB12)和5-甲基四氢叶酸(5-methyl tetrahydrofolic acid，5-MTHF)。
维生素B1即硫胺素，在糖代谢中起到重要作用。硫胺素缺乏会导致糖代谢障碍，使血液中丙酮酸和乳酸含量增多，影响神经组织供能，产生脚气病。主要表现为肌肉虚弱、萎缩，小腿沉重、下肢水肿、心力衰竭等。维生素B2又叫核黄素，是体内许多重要辅酶类的组成成分，能促进生长发育，保护眼睛、皮肤的健康，缺乏会引起皮炎，口角炎，舌炎，唇裂症，脂溢性皮炎，阴囊炎等。维生素B3又称为烟酸，有助于促进消化系统健康，改善肠胃功能障碍和腹泻；有助于降低血液中胆固醇和甘油三酯水平；医学上还用于改善口腔炎，防止口臭。维生素B5又叫泛酸、抗压维生素，因为它有助于肾上腺素的产生，从而有效缓解压力和疲劳。泛酸与维生素C一起食用，还有助于保持肌肤活力，加快伤口愈合。维生素B6又叫吡哆素，在蛋白质的代谢过程中起调控作用，它有助于能量的产生，让人感觉精力充沛，被称为提神营养素。吡哆酸是维生素B6的主要代谢产物，是在肝脏醛氧化酶的作用下产生的。维生素B9又叫叶酸，是一种重要的维生素，它与B12一起有利于血红细胞形成，减少贫血。孕妇缺乏叶酸会导致胎儿的脊柱裂和无脑畸形。此外，叶酸还有助于保持血液正常的同型半胱氨酸水平(衡量心脏病的重要指标)，减少心脏病的发生。5-甲基四氢叶酸是血清中叶酸的主要存在形式，为活性叶酸。维生素B12又叫钴胺素，可以促进血红细胞形成和再生，减少恶性贫血；可以消除烦躁，帮助集中注意力和增强记忆力；有助于儿童生长发育，增进食欲。
维生素C又叫L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素，主要作用是提高免疫力，预防癌症、心脏病、中风，保护牙齿和牙龈等。
目前，有关水溶性维生素的检测方法有很多种，如微生物检测法、ELISA、放射免疫分析，蛋白质结合或生物传感器等方法。微生物检测方法适用于检测多种衍生物的总和(如总叶酸)，其它方法在代谢物的区分上存在相同的缺点。而液相色谱串联质谱法 (LC-MS/MS)能够区分开天然维生素及其代谢产物，灵敏度高，特异性强，非常适用于血清或血浆中多种水溶性维生素的检测。但是，目前的LC-MS/MS技术检测水溶性维生素时仍然存在诸多问题，如灵敏度不够、前处理复杂和样本用量大等。
山东博济医药科技有限公司于2019年5月10日申请的中国专利201910387449.0，发明名称“多种水溶性维生素含量的测定方法”，采用LC-MS法对血样种5种水溶性维生素进行了检测，该专利所分析化合物种类较少，且没有写明液相洗脱条件，数据也较少。济南英盛生物技术有限公司于2015年11月23日申请的中国专利201510818863.4，发明名称“一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法”，采用LC-MS法对血样种9 种水溶性维生素进行了检测，该方法所使用的前处理较为复杂，蛋白沉淀后需氮吹复溶，前处理时间较长，在临床应用比较受限。北京和合医学诊断技术股份有限公司于2019年 9月5日申请的中国专利201910837920.1，发明名称“一种检测血液中水溶性维生素的方法”，采用LC-MS法对血样种11种水溶性维生素进行了检测，该专利虽然所分析的维生素较多，但所使用的蛋白沉淀剂去除蛋白和基质能力较差，且一针分析时间为15min，在临床检测中难以应用。广州市丰华生物工程有限公司于2017年2月23日申请的中国专利201710100120.2，发明名称“一种同时检测干血滤纸片中多种维生素的方法和试剂盒”，采用LC-MS法对血样种2种水溶性维生素和5种脂溶性维生素进行了检测，该方法所使用的流动相与质谱很难兼容，对仪器损害大，难以长期应用；前处理较为复杂，蛋白沉淀后需氮吹复溶，前处理时间较长，在临床应用比较受限。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素的方法。
本发明的技术方案如下：
一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素的方法，
所述9种水溶性维生素分别为：维生素B1(VB1)、维生素B2(VB2)、维生素B3 (VB3)、维生素B5(VB5)、维生素B6(VB6)、维生素B7(VB7)、维生素B12(VB12)、 5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和维生素C(VC)；
上述9种水溶性维生素对应的同位素内标物分别为：维生素B1-13C4(VB1-IS)、维生素B2-13C4,15N2(VB2-IS)、维生素B3-13C3,15N(VB3-IS)、维生素B5-13C3,15N (VB5-IS)、维生素B6-d3(VB6-IS)、维生素B7-d4(VB7-IS)、维生素B12-15N6(VB12-IS)、 5-甲基四氢叶酸-13C,d3(5-MTHF-IS)和维生素C-13C6(VC-IS)；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的水溶性维生素，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测目标物与其对应同位素内标的质荷比(m/z)，使用同位素内标法定量，分别计算出9种水溶性维生素的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01～0.5％甲酸-1～10mM甲酸铵水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Agilent Pursuit PFP 2.0×150mm，3.0μm；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由98:2匀速渐变至50:50；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由50:50匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至98:2；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为0.5kV(ESI+)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了9种水溶性维生素及其对应同位素内标。
在一种优选方案中，色谱柱为五氟苯基柱。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测水溶性维生素的灵敏度更高，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，检测种类较多，5分钟之内可同时检测9种水溶性维生素。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.1～0.5％甲酸-1～5mM甲酸铵水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸-2mM甲酸铵水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.01～0.5％甲酸-1～10mM甲酸铵水溶液和甲醇作为流动相，色谱柱型号：Agilent Pursuit PFP(2.0×150mm，3.0μm)，色谱柱为五氟苯基柱，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用维生素B1-13C4(VB1-IS)、维生素B2-13C4,15N2(VB2-IS)、维生素B3-13C3,15N(VB3-IS)、维生素B5-13C3,15N(VB5-IS)、维生素B6-d3(VB6-IS)、维生素B7-d4 (VB7-IS)、维生素B12-15N6、(VB12-IS)、5-甲基四氢叶酸-13C,d3(5-MTHF-IS)和维生素C-13C6(VC-IS)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中水溶性维生素时的重现性、准确度均较好。
在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为为0.3mL/min。
进一步地，柱温为35～45℃，优选为40℃。
更进一步地，进样体积为1～10μL，优选为5μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素时，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸-2mM甲酸铵水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Agilent Pursuit PFP(2.0×150mm，3.0μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表1；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为5μL。
表1 流动相梯度洗脱参数
时间 流速(mL/min) ％A ％B Curve
0.0 0.3 98 2 -
1.0 0.3 50 50 6
2.5 0.3 2 98 6
3.0 0.3 2 98 6
5.0 0.3 98 2 1
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为0.5kV(ESI+)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了9种水溶性维生素及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表2。
表2 水溶性维生素质谱参数
化合物 母离子(m/z) 子离子(m/z) 锥孔电压(V) 碰撞电压(V)
VB1 265.13 122.00 34 10
VB1-IS 268.78 122.00 22 10
VB2 377.20 243.02 30 18
VB2-IS 383.23 249.07 32 16
VB3 123.00 79.96 50 12
VB3-IS 126.97 82.95 40 10
VB5 220.1 89.93 28 10
VB5-IS 224.16 93.97 18 10
VB6 183.98 148.02 34 18
VB6-IS 187.03 149.97 32 18
VB7 245.07 227.00 34 8
VB7-IS 249.16 170.11 8 20
VB12 678.30 147.10 40 30
VB12-IS 681.30 147.10 40 30
5-MTHF 460.40 313.17 40 14
5-MTHF-IS 464.40 317.22 40 14
VC 177.0 56.9 16 14
VC-IS 183.0 102.1 20 14
本发明提及的血清为人或动物血清。
在一种方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为甲醇。
在一种优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，涡旋后加入180μL甲醇，在12000～15000 r/min，10～20℃离心4～10min后，取70μL上清液。
在一种更优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入180μL甲醇，高速振荡 (最大振速)5min；在转速14000r/min，15℃离心5min；取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量5μL。
在一种方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：
称取各同位素内标物，包括维生素B1-13C4(VB1-IS)、维生素B2-13C4,15N2 (VB2-IS)、维生素B3-13C3,15N(VB3-IS)、维生素B5-13C3,15N(VB5-IS)、维生素 B6-d3(VB6-IS)、维生素B7-d4(VB7-IS)、维生素B12-15N6(VB12-IS)、5-甲基四氢叶酸-13C,d3(5-MTHF-IS)和维生素C-13C6(VC-IS)，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为1mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、1mg/mL、 0.5mg/mL和1mg/mL的同位素内标母液；
上述各同位素内标母液再以甲酸-甲醇水溶液配制成包含有100ng/mL维生素 B1-13C4、200ng/mL维生素B2-13C4,15N2、200ng/mL维生素B3-13C3,15N、400ng/mL 维生素B5-13C3,15N、100ng/mL维生素B6-d3、20ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B12-15N6、500ng/mL 5-甲基四氢叶酸-13C,d3和50000ng/mL维生素C-13C6的同位素内标SI溶液；
取100μL SI溶液，加入900μL甲酸-甲醇水溶液，混合均匀得混合内标工作液。
在制备混合内标工作液时，采用的甲酸-甲醇水溶液为0.05～0.5％甲酸-60～90％甲醇水溶液；优选为0.1～0.5％甲酸-75～85％甲醇水溶液；更优选为0.1％甲酸-80％甲醇水溶液。
在一种优选方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：
准确称量3-5mg各同位素内标物于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中同位素内标母液浓度，除了维生素C-13C6，再将各使用浓度用0.1％甲酸-80％甲醇水溶液配制成同位素混合内标SI溶液(详见表3)，最后取 100μL SI溶液，加入900μL0.1％甲酸-80％甲醇水溶液，混合均匀得混合内标工作液。
表3 同位素混合内标SI溶液的配制
Figure BDA0002409744720000061
在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
称取各待测物标准品，包括维生素B1(VB1)、维生素B2(VB2)、维生素B3(VB3)、维生素B5(VB5)、维生素B6(VB6)、维生素B7(VB7)、维生素B12(VB12)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和维生素C(VC)，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为1mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.1mg/mL、0.5 mg/mL和10mg/mL的标准品母液；
上述各标准品母液再以甲酸-甲醇水溶液配制成包含有1000ng/mL维生素B1(VB1)、 1000ng/mL维生素B2(VB2)、4000ng/mL维生素B3(VB3)、8000ng/mL维生素B5 (VB5)、2000ng/mL维生素B6(VB6)、100ng/mL维生素B7(VB7)、250ng/mL 维生素B12(VB12)、4000ng/mL5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和1000000ng/mL维生素 C(VC)的混合标准S0溶液；
将上述混合标准S0溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
维生素B1(VB1)和维生素B2(VB2)的浓度相同，依次为0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL和50ng/mL；
维生素B3(VB3)和5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)的浓度相同，依次为1.6ng/mL、 4ng/mL、8ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL和200ng/mL；
维生素B5(VB5)的浓度依次为3.2ng/mL、8ng/mL、16ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、200ng/mL和400ng/mL；
维生素B6(VB6)的浓度依次为0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL；
维生素B7(VB7)的浓度依次为0.04ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL和5ng/mL；
维生素B12(VB12)的浓度依次为0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、6.25ng/mL和12.5ng/mL；
维生素C(VC)的浓度依次为400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、25000ng/mL和50000ng/mL。
进一步地，制备标准品溶液时，采用的甲酸-甲醇水溶液为0.05～0.5％甲酸-60～90％甲醇水溶液；优选为0.1～0.5％甲酸-75～85％甲醇水溶液；更优选为0.1％甲酸-80％甲醇水溶液。
更进一步地，制备标准品溶液时，空白血清基质为0.05～0.5％甲酸-5～20％甲醇水溶液；优选为0.1～0.5％甲酸-5～15％甲醇水溶液；更优选为0.1％甲酸-10％甲醇水溶液。
在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
准确称量3-5mg各待测标准品粉末于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中标准品母液浓度，再将各使用浓度用0.1％甲酸-80％甲醇水溶液配制成混合标准S0溶液(详见表4)，混合均匀备用。
表4 混合标准液S0的配制
Figure BDA0002409744720000081
取20μL混合S0溶液至1.5mL离心管中，加入380μL 0.1％甲酸-10％甲醇水溶液得到第一个高值浓度点S7，再逐级稀释至S1(详见表5)，各标曲点的浓度如表5中所列。
表5 标曲的配制及浓度
Figure BDA0002409744720000082
(注：浓度单位均为ng/mL)
每个浓度点样品取50μL，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入180μL甲醇，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min，15℃离心5min；取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量5μL。
本发明提及的甲酸-甲醇水溶液的浓度一般指体积浓度。
本发明还包括制备质控品，所述质控品为含有9种水溶性维生素的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。其中，
QC(L)为上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至1000倍；
QC(M)为上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至200倍；
QC(H)为上述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至20倍。
在一种方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准S0溶液以5％～20％甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准S0溶液以0.1～0.5％甲酸-5～15％甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。
在一种更优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准S0溶液以0.1％甲酸-10％甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。
QC(L)中包含：1ng/mL维生素B1(VB1)、1ng/mL维生素B2(VB2)、4ng/mL 维生素B3(VB3)、8ng/mL维生素B5(VB5)、2ng/mL维生素B6(VB6)、0.1ng/mL 维生素B7(VB7)、0.250ng/mL维生素B12(VB12)、4ng/mL5-甲基四氢叶酸(5-MTHF) 和1000ng/mL维生素C(VC)。
QC(M)中包含：5ng/mL维生素B1(VB1)、5ng/mL维生素B2(VB2)、20ng/mL 维生素B3(VB3)、40ng/mL维生素B5(VB5)、10ng/mL维生素B6(VB6)、0.5ng/mL 维生素B7(VB7)、1.25ng/mL维生素B12(VB12)、20ng/mL5-甲基四氢叶酸(5-MTHF) 和5000ng/mL维生素C(VC)。
QC(H)中包含：50ng/mL维生素B1(VB1)、50ng/mL维生素B2(VB2)、200ng/mL 维生素B3(VB3)、400ng/mL维生素B5(VB5)、100ng/mL维生素B6(VB6)、5ng/mL 维生素B7(VB7)、12.5ng/mL维生素B12(VB12)、200ng/mL5-甲基四氢叶酸(5-MTHF) 和50000ng/mL维生素C(VC)。
本发明建立了一种简单、高效且可靠的血清中水溶性维生素的检测方法，相比现有技术，更能满足临床应用的需求。
采用本发明的技术方案，优势如下:本发明提供的超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素的方法，将血清样本与所有待测物的混合内标溶液混合，样本无需衍生化处理，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，灵敏度高，特异性强，检测种类较多，5分钟之内可同时检测9种水溶性维生素，可用于临床上血清水溶性维生素的诊断及健康评估。
附图说明
图1为9种水溶性维生素标准品的选择离子流色谱图；
图2为血清样本中9种水溶性维生素的选择离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自于武汉亚洲心脏病医院2018年3月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱型号Agilent Pursuit PFP(2.0×150mm，3.0μm)(美国安捷伦公司)。
(3)标准品：维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素 B7、维生素B12及对应的同位素内标购自Sigma公司，5-甲基四氢叶酸、维生素C及对应的同位素内标购自TRC公司。
(4)质控品：含有9种水溶性维生素的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸-2mM甲酸铵水溶液；流动相B：甲醇。色谱柱型号：Agilent Pursuit PFP(2.0×150mm，3.0μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为5μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为0.5kV(ESI+)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了9种水溶性维生素及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表2。
三、实验过程
(1)标准品配制：
准确称量3-5mg各待测标准品粉末于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中标准品母液浓度，再将各使用浓度用0.1％甲酸-80％甲醇水溶液配制成混合标准S0溶液(详见表4)，混合均匀备用。
将上述混合标准S0溶液以空白血清基质(0.1％甲酸-10％甲醇水溶液)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取20μL混合S0溶液至1.5mL离心管中，加入380μL 0.1％甲酸-10％甲醇水溶液得到第一个高值浓度点S7，再逐级稀释至S1(详见表5)，各标曲点的浓度如表5中所列。
(2)混合内标工作液配制
准确称量3-5mg各同位素内标物于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用纯甲醇配制成下表中同位素内标母液浓度，除了维生素C-13C6(VC-IS)，再将各使用浓度用0.1％甲酸-80％甲醇水溶液配制成同位素混合内标SI溶液(详见表3)，最后取100μL SI溶液，加入900μL0.1％甲酸-80％甲醇水溶液，混合均匀得混合内标工作液。
(3)质控品配制：
取上述混合标准S0溶液以0.1％甲酸-10％甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、 QC(M)、QC(H)。
QC(L)中包含：1ng/mL维生素B1(VB1)、1ng/mL维生素B2(VB2)、4ng/mL 维生素B3(VB3)、8ng/mL维生素B5(VB5)、2ng/mL维生素B6(VB6)、0.1ng/mL 维生素B7(VB7)、0.250ng/mL维生素B12(VB12)、4ng/mL5-甲基四氢叶酸(5-MTHF) 和1000ng/mL维生素C(VC)。
QC(M)中包含：5ng/mL维生素B1(VB1)、5ng/mL维生素B2(VB2)、20ng/mL 维生素B3(VB3)、40ng/mL维生素B5(VB5)、10ng/mL维生素B6(VB6)、0.5ng/mL 维生素B7(VB7)、1.25ng/mL维生素B12(VB12)、20ng/mL5-甲基四氢叶酸(5-MTHF) 和5000ng/mL维生素C(VC)。
QC(H)中包含：50ng/mL维生素B1(VB1)、50ng/mL维生素B2(VB2)、200ng/mL 维生素B3(VB3)、400ng/mL维生素B5(VB5)、100ng/mL维生素B6(VB6)、5ng/mL 维生素B7(VB7)、12.5ng/mL维生素B12(VB12)、200ng/mL5-甲基四氢叶酸(5-MTHF) 和50000ng/mL维生素C(VC)。
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入180μL甲醇，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min，15℃离心5min；取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量5μL。
2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，然后涡旋5s；加入180μL甲醇，高速振荡(最大振速)5min；在转速14000r/min， 15℃离心5min；取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量5μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
本发明的检测方法中，9种水溶性维生素的标准品与血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为9种水溶性维生素标准品的选择离子流色谱图；图2为血清样本中9种水溶性维生素的选择离子流色谱图。
1.标准曲线：
采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中水溶性维生素待测物的浓度。9种水溶性维生素在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.997 以上，详见表6。
表6 9种水溶性维生素的保留时间及线性范围
Figure BDA0002409744720000121
Figure BDA0002409744720000131
2.最低定量限
最低定量限(LLOQ)作为标曲线性范围的最低点，也反映方法的灵敏度。水溶性维生素在人体含量低，对方法的灵敏度和特异性要求较高，对方法进行优化和考察，目前最低定量限(LLOQ)基本满足9种水溶性维生素同时检测的灵敏度要求，LLOQ的浓度具体见表7。
表7 方法定量下限数据表
Figure BDA0002409744720000132
3.加标回收率考察：随机选取一例人血清样品，其中1个不加标准品，其它2个分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，计算回收率结果，见表8。结果显示，血清中9种水溶性维生素的加标回收率结果在85％-115％之间，均满足要求。
表8 血清中9种水溶性维生素的加标回收率结果(单位ng/mL)
Figure BDA0002409744720000133
Figure BDA0002409744720000141
4.精密度试验：取血清质控样本一天内重复处理6批，处理3天，以同位素内标法定量测定9种水溶性维生素的浓度，连续三日统计批内和批间精密度，计算结果见表9。
表9 批内、批间精密度试验结果(单位ng/mL)
Figure BDA0002409744720000142
Figure BDA0002409744720000151
Figure BDA0002409744720000161
五、讨论
本发明采用UPLC-MS/MS方法测定了人体血清中的9种水溶性维生素，同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，特异性强。与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
考察了9种水溶性维生素在血清中加标回收率，均在85％-115％，符合要求。
方法的重现性结果表明，血清中的9种水溶性维生素的日内精密度，日间精密度，方法的重现性良好。
本方法较其他LC-MS/MS方法灵敏度更高，前处理简单，只需一步蛋白沉淀处理，样本用量小，检测种类较多，5分钟之内可同时检测9种水溶性维生素，可用于临床上血清水溶性维生素的诊断及健康评估。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中9种水溶性维生素的方法，
所述9种水溶性维生素分别为：维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B12、5-甲基四氢叶酸和维生素C；
上述9种水溶性维生素对应的同位素内标物分别为：维生素B1-13C4、维生素B2-13C4,15N2、维生素B3-13C3,15N、维生素B5-13C3,15N、维生素B6-d3、维生素B7-d4、维生素B12-15N6、5-甲基四氢叶酸-13C,d3和维生素C-13C6；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的水溶性维生素，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测目标物与其对应同位素内标的质荷比，使用同位素内标法定量，分别计算出9种水溶性维生素的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01～0.5％甲酸-1～10mM甲酸铵水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Agilent Pursuit PFP 2.0×150mm，3.0μm；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由98:2匀速渐变至50:50；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由50:50匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至98:2；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为0.5kV(ESI+)；离子源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了9种水溶性维生素及其对应同位素内标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.1～0.5％甲酸-1～5mM甲酸铵水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；柱温为35～45℃；进样体积为1～10μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.1％甲酸-2mM甲酸铵水溶液；所述流速为0.3mL/min；所述柱温为40℃；所述进样体积为5μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血清为人或动物血清。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为五氟苯基柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为甲醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作，涡旋后加入180μL甲醇，在12000～15000r/min，10～20℃离心4～10min后，取70μL上清液。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，
所述混合内标工作液按照如下方法制备：
称取各同位素内标物，包括维生素B1-13C4、维生素B2-13C4,15N2、维生素B3-13C3,15N、维生素B5-13C3,15N、维生素B6-d3、维生素B7-d4、维生素B12-15N6、5-甲基四氢叶酸-13C,d3和维生素C-13C6，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为1mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL的同位素内标母液；
上述各同位素内标母液再以甲酸-甲醇水溶液配制成包含有100ng/mL维生素B1-13C4、200ng/mL维生素B2-13C4,15N2、200ng/mL维生素B3-13C3,15N、400ng/mL维生素B5-13C3,15N、100ng/mL维生素B6-d3、20ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B12-15N6、500ng/mL 5-甲基四氢叶酸-13C,d3和50000ng/mL维生素C-13C6的同位素内标SI溶液；
取100μL SI溶液，加入900μL甲酸-甲醇水溶液，混合均匀得混合内标工作液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述标准品按照如下方法制备：
称取各待测物标准品，包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B12、5-甲基四氢叶酸和维生素C，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为1mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL和10mg/mL的标准品母液；
上述各标准品母液再以甲酸-甲醇水溶液配制成包含有1000ng/mL维生素B1、1000ng/mL维生素B2、4000ng/mL维生素B3、8000ng/mL维生素B5、2000ng/mL维生素B6、100ng/mL维生素B7、250ng/mL维生素B12、4000ng/mL5-甲基四氢叶酸和1000000ng/mL维生素C的混合标准S0溶液；
将上述混合标准S0溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
维生素B1和维生素B2的浓度相同，依次为0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL和50ng/mL；
维生素B3和5-甲基四氢叶酸的浓度相同，依次为1.6ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL和200ng/mL；
维生素B5的浓度依次为3.2ng/mL、8ng/mL、16ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、200ng/mL和400ng/mL；
维生素B6的浓度依次为0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL；
维生素B7的浓度依次为0.04ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL和5ng/mL；
维生素B12的浓度依次为0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、6.25ng/mL和12.5ng/mL；
维生素C的浓度依次为400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、25000ng/mL和50000ng/mL。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
所述甲酸-甲醇水溶液为0.05～0.5％甲酸-60～90％甲醇水溶液；优选为0.1～0.5％甲酸-75～85％甲醇水溶液；更优选为0.1％甲酸-80％甲醇水溶液；
所述空白血清基质为0.05～0.5％甲酸-5～20％甲醇水溶液；优选为0.1～0.5％甲酸-5～15％甲醇水溶液；更优选为0.1％甲酸-10％甲醇水溶液。
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