CN114280178A - 一种多种水溶性维生素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多种水溶性维生素B2、B5、B6、B9、MMA的检测方法,所述检测方法包括以下步骤:(1)取血液样本,直接用缓冲液稀释,得待上样样本;(2)对得待上样样本进行阴离子交换固相萃取柱萃取,获得所需洗脱液;(3)洗脱液40℃吹干复溶得到待测样本;(4)然后对待测样本进行LC‑MS/MS分析,检测获得水溶性维生素的含量。本发明方法可以同时检测多种水溶性维生素,该方法在固相萃取前无需沉淀吹干,仅需简单稀释后即可上样,对比沉淀吹干等复杂方法提高了检测效率,节省了前处理时间,避免了因蛋白沉淀造成的样本损失,满足临床准确快速检测的需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体的涉及水溶性维生素的检测方法。
背景技术
水溶性维生素是一类人和动物为维持正常生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质,在人的生长、代谢、发育过程中发挥着重要作用。水溶性维生素若长期缺乏易导致一些生理机能障碍引起的疾病,如成人会引起恶性贫血,易发炎,过敏;幼儿生长缓慢,影响正常发育;孕妇缺少叶酸,可使先兆子痫、胎盘剥离的发生率增高。故建立准确的方法同时监测水溶性维生素及其体内活性形式有助于及时发现人体因维生素不足或过量所致的健康隐患以及在治疗期间根据体内含量调整维生素的补充量等。
叶酸代谢的第一步发生在肠粘膜上,经过多步转化生成活性的5-MTHF。5-MTHF是血清中主要的叶酸形式,约占血液循环中叶酸总量的82-93%。当人体缺乏叶酸时,医生会建议适当补充合成叶酸(FA),后者经亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR代谢后转化成5-MTHF才能被细胞真正利用,该酶存在基因多态性,慢代谢者的FA利用度受限。维生素B12又称钴胺素,是唯一含金属元素的维生素,包括甲钴胺、氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺。腺苷钴胺缺乏时,导致MMA(B12缺乏的功能性标志物)指数升高。研究发现社区缺乏VB12的老人约占12~22%,缺乏的原因主要有:严格的素食和酗酒、疾病导致的吸收不良、先天性钴胺转运蛋白缺陷、不同细胞内酶的先天性缺乏等。
已发表或公开的采用LC-MS法检测水溶性维生素的方法有很多,如济南英盛生物技术有限公司于2015年11月23日申请且已授权的中国专利201510818863.4,“一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法”,对血样中9种水溶性维生素进行了检测。该方法部分分析物灵敏度低,不能满足对于定量下限LLOQ的要求,例如VB5泛酸专利中LLOQ为1ng/mL,附图中色谱图样本浓度为130.5ng/mL(其图7),响应为9000cps,按此响应换算LLOQ的响应不足70cps;同理,VB6的LLOQ响应不足150cps(其图3),不满足定量下限的检测要求。北京和合医学诊断技术股份有限公司于2019年9月5日申请的中国专利201910837920.1,“一种检测血液中水溶性维生素的方法”,对血样中11种水溶性维生素进行了检测,该专利虽然分析的维生素较多,但一针分析时间为15min,过于冗长不利于临床快速检测。处理方法为蛋白沉淀法,样本基质影响较大,例如其中5-甲基四氢叶酸的精密度以及回收率较差,混合标准溶液加标量为8mg以及32mg的平均回收率在140%以上,加标量为2mg的精密度大于20%。广东南芯医疗科技有限公司于2020年4月1日申请的中国专利202010074354.6,“一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法及其应用”,该专利虽一针10min就能检测出13种水溶性维生素,但说明书中并没有明确给出样本检测的精密度和准确度的相关数值,单看附图中某个样本的峰形和响应,无法得出其分析物在此范围内线性关系良好的结论;且对于一种同时检测多种物质的方法,部分分析物色谱图的质量较差,无法获得准确的检测结果以及良好的可重现性。
因此,本领域迫切需要具有较高准确性,能快速同时检测多个水溶性维生素的方法。
发明内容
本发明为一种采用阴离子交换固相萃取结合LC-MS/MS技术同时检测人血清中多种水溶性维生素以及部分活性代谢物的方法,其中水溶性维生素包括维生素B2(核黄素)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆酸VB6-PA)、维生素B9(包括叶酸VB9-FA和5-甲基四氢叶酸VB9-5-MTHF)、MMA(VB12缺乏的功能性标志物)。
本发明的目的是提供一种多种水溶性维生素的检测方法,所述检测方法包括以下步骤:
(1)取血液样本,经缓冲液稀释,得待上样样本;
(2)对待上样样本进行阴离子交换固相萃取柱萃取,获得洗脱液;
(3)洗脱液40℃吹干,加入复溶液,得到待测样本;
(4)对待测样本进行LC-MS/MS分析,检测获得水溶性维生素B2、B5、B6、B9、MMA(B12缺乏的功能性标志物)的含量。
上述步骤(1)中使用的缓冲液采用磷酸缓冲溶液、硼酸缓冲溶液、醋酸铵缓冲溶液或甲酸铵缓冲溶液,pH 5-7;并包含以下同位素内标:核黄素-13C4 15N2、叶酸-13C5、5-甲基四氢叶酸-13C5、泛酸-13C3 15N、吡哆酸-D3、甲基丙二酸-D3。
上述步骤(2)中采用以下洗脱溶液洗脱:
质量体积浓度0.1~1g/L抗坏血酸;
质量百分比浓度为1~10%的乙酸或甲酸;
质量百分比浓度为40~60%乙腈,其余水,pH 3-4。
上述步骤(2)中所述阴离子交换固相萃取柱为PAX、MAX、SAX或WAX固相萃取小柱;所述步骤(2)中萃取流程为:活化、平衡、上样、清洗、洗脱。
上述血液样本为血浆或者血清,优选血清。
上述步骤(3)中复溶液为含有质量体积浓度0.1~1g/L抗坏血酸的水溶液。
上述LC-MS/MS分析将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后,采用先负离子后正离子的方式电喷雾电离,对待测物质进行定性与定量检测。
上述液相色谱条件为,流动相A:甲酸或者乙酸水溶液(pH 2~3);流动相B:甲酸或者乙酸甲醇溶液(pH 2~3);柱温:室温;所述流动相采用梯度洗脱;流速:0.5-0.7mL/min;进样量:10-30μL;进样时间:5min。
上述质谱条件为采用先负离子后正离子扫描;气帘气:30psi;碰撞气:12psi;雾化气:60psi;加热气:60psi;正离子源电压:5500V(负离子电压-4500V);离子源温度:550℃。
上述LC-MS/MS条件中质谱条件为采用负离子电离(扫描)时间为1~2min,正离子电离(扫描)时间为1~5min。本发明建立了一种以阴离子交换固相萃取为原理的前处理技术结合LC-MS/MS检测人血清中的多种水溶性维生素的方法。
A.本方法首次将VB12缺乏的功能性标志物甲基丙二酸与核黄素、泛酸、吡哆酸、叶酸和5-甲基四氢叶酸实现了同时检测。
B.本方法所包含的前处理方法利用目标分析物的极性大小和/或分析物结构中所包含的阴离子基团,建立了基于阴离子交换和反相保留为机制的固相萃取前处理方法,与以往公开的蛋白沉淀方法不同,该方法的前处理效率更高,节省检测时间,有利于快速出具结果,辅助检测需求。
C.本方法在前处理过程中均添加了稳定剂抗坏血酸,避免了水溶性维生素在样本处理过程中因加热、氧化等因素导致的降解。
本发明和其他方法比较,存在显著的优势,主要表现在3个方面:
A.高通量:本方法可同时检测人血清中的VB9-FA、VB9-5MTHF、VB2、VB5、VB6-PA、MMA(B12缺乏的功能性标志物),一针检测时间仅需5min,满足临床样本快速检测的需求。
B.高灵敏度:本方法采用的阴离子交换固相萃取前处理技术极大程度的去除了血清中的杂质,避免了共流出干扰物引起的信号抑制以及蛋白沉淀造成的样本损失,方法的灵敏度高,回收率好,血清中痕量水平的水溶性维生素可被定量检出。
C.高特异性:该发明所述的方法在检测高脂血、溶血中水溶性维生素时的精密度高,准确度好,无明显基质效应。
附图说明
图1水溶性维生素VB2色谱图。(VB21ng/mL)
图2水溶性维生素VB5色谱图。(VB58ng/mL)
图3水溶性维生素VB6-PA色谱图。(VB6-PA 1ng/mL)
图4水溶性维生素VB9-FA色谱图。(VB9-FA 0.2ng/mL)
图5水溶性维生素VB9-5-MTHF色谱图。(VB9-5-MTHF 0.5ng/mL)
图6水溶性维生素MMA色谱图。(MMA 10ng/mL)
以上附图中横坐标为时间,单位分钟,min;纵坐标为仪器灵敏度响应强度,单位cps。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的原理和构思作进一步说明,但下述实施例并不意在限制本发明。
在本发明中,若非特指,所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的,下述实施例中的方法,如无特别说明,均为本领域常规方法。
本发明中缓冲溶液可以是磷酸缓冲溶液、硼酸缓冲溶液、醋酸铵缓冲溶液或甲酸铵缓冲溶液或者二者以上的混合溶液,满足pH 5-7即可。
本发明中使用的阴离子交换固相萃取柱包含但不仅限于PAX、MAX、SAX、WAX等类型固相萃取小柱。所述萃取流程为:活化、平衡、上样、清洗、洗脱。
实施例1水溶性维生素的检测
(1)血清样本前处理
1)上样样本前处理步骤方法:取待测血清样本200μL至2mL离心管中,加入600μL含同位素内标(核黄素-13C4 15N2、叶酸-13C5、5-甲基四氢叶酸-13C5、泛酸-13C3 15N、吡哆酸-D3、甲基丙二酸-D3)的缓冲溶液(本实例中使用的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液,pH为7),后1000rpm振荡混匀5min,待进样。
2)混合型阴离子交换固相萃取(本实例中使用的是MAX小柱)流程:
活化:向萃取小柱中加入200μL活化剂(甲醇),正压后废液弃去;
平衡:向萃取小柱中加入600μL缓冲溶液,正压后废液弃去;
上样:将1)方法得到的上样样本转移至萃取小柱中上样,正压后废液弃去;
清洗:200μL缓冲溶液清洗1次,正压后废液弃去;
洗脱:200μL含稳定剂的洗脱溶液(本实施例中使用的洗脱溶液为1g/L抗坏血酸60%乙腈水溶液,用甲酸调节pH为4)洗脱,收集正压后的洗脱液;
40℃空气吹干洗脱液后加入150μL复溶液(本实施例中使用的是0.1g/L抗坏血酸水溶液),1900rpm振荡混匀5分钟后,进样分析。
(2)液相色谱条件
梯度洗脱:稀释结合阴离子交换固相萃取技术在最大程度上清除了血清样本中的干扰基质,但结构和理化性质较相似的类似物仍需优化色谱条件来实现进一步分离。本方法使用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪器或性能相等同的不同品牌仪器进行分析和检测(本实例中使用的仪器是Exion LC,AB Sciex,美国),色谱柱使用C18或其它相似柱效的色谱柱作为分离柱(本实例中使用的是Polar C18(2.6μm 100×3.0mm)Phenomenex),具体参数见表1。
表1液相色谱条件参数
(3)质谱条件
质谱检测采用电喷雾电离(ESI)模式,正负离子切换扫描,为了监测每一个临床样本可能存在的干扰,我们分别为每一个分析物设置了定量(qn)和定性(ql)通道,以及相对应的同位素内标IS,通过计算二者比值与标准样品的偏差来判断临床样本是否存在干扰。质谱的源参数和化合物参数通过优化得到,具体见表2。
表2质谱条件参数
表中qn为定量通道,ql为定性通道
(4)该实施例结果
水溶性维生素的定量下限在0.1-5ng/mL之间,线性范围则达到了400倍,可同时检测水溶性维生素的缺乏和异常升高的样本(线性范围和检测限LOD见表3)。该方法的灵敏度较高,部分分析物的检测限LOD(S/N≥3)可达到25pg/mL。从附图1-6的方法2真实样本色谱图也能看出,各分析物与干扰峰可实现较好的分离。
表3.水溶性维生素及其活性代谢物的线性
通过外添加回收试验考察方法的准确度,并进行了连续三个批次的准确度(用与理论添加浓度的偏差Bias表示)和精密度(用变异系数CV表示)验证,并针对方法的提取回收率,脂血溶血等特殊样本外添加标准品的回收准确度以及前处理过程中内标校正后的基质效应进行了考察。结果表明(见表4),该方法中水溶性维生素的批内和批间准确度在90.3%-111.9%之间;精密度均<15%;特异性溶血脂血中的Bias<15%;所有分析物的提取回收率均在35.6%以上;内标校正后的基质效应接近1.0。
表4.方法二水溶性维生素的验证指标性能
此外应理解,对本领域普通技术人员来说,可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种多种水溶性维生素的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤:
(1)取血液样本,加入缓冲液进行稀释,得待上样样本;
(2)对待上样样本进行阴离子交换固相萃取柱萃取,获得洗脱液;
(3)将洗脱液40℃吹干,加入复溶液后得到待测样本;
(4)对待测样本进行LC-MS/MS分析,检测获得水溶性维生素B2、B5、B6、B9及MMA的含量。
2.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中使用的缓冲液采用磷酸缓冲溶液、硼酸缓冲溶液、醋酸铵缓冲溶液或甲酸铵缓冲溶液,pH 5-7;并包含以下同位素内标:核黄素-13C4 15N2、叶酸-13C5、5-甲基四氢叶酸-13C5、泛酸-13C3 15N、吡哆酸-D3、甲基丙二酸-D3。
3.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中采用以下洗脱溶液洗脱:质量体积浓度0.1~1g/L抗坏血酸;
质量百分比浓度为1~10%的乙酸或甲酸;
质量百分比浓度为40~60%乙腈,其余水,pH 3-4。
4.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(2)中所述阴离子交换固相萃取柱为PAX、MAX、SAX或WAX固相萃取小柱;所述步骤(2)中萃取流程为:活化、平衡、上样、清洗、洗脱。
5.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述血液样本为血浆或者血清。
6.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,复溶液为含有质量体积浓度0.1~1g/L抗坏血酸的水溶液。
7.如权利要求1或5所述的检测方法,其特征在于,所述LC-MS/MS分析将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后,采用电喷雾电离,对待测物质进行定性与定量检测。
8.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述液相色谱条件为,流动相A:甲酸或者乙酸水溶液(pH 2~3);流动相B:甲酸或者乙酸甲醇溶液(pH 2~3);柱温:室温;所述流动相采用梯度洗脱;流速:0.5-0.7mL/min;进样量:10-30μL;进样时间:5min。
9.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述质谱条件为采用先负离子后切换为正离子扫描;气帘气:30psi;碰撞气:12psi;雾化气:60psi;加热气:60psi;正离子源电压:5500V(负离子电压-4500V);离子源温度:550℃。
10.如权利要求6-9任一权利要求所述的检测方法,其特征在于,所述质谱条件为采用负离子电离时间为1~2min,正离子电离时间为1~5min。
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