CN114755354A - 一种检测叶酸的试剂盒以及全血样本中叶酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测叶酸的试剂盒以及全血样本中叶酸的检测方法，涉及生物分析检测技术领域。本发明将固相萃取过程中平衡液、淋洗液和洗脱液的pH设定为2～5，以最大限度地保护叶酸不被氧化破坏，且将多种形式的叶酸之间的转化过程稳定在一定水平，进而很好的评价全血样本中多种形式叶酸的情况，为叶酸的检测分型提供了途径。此外，采用优化的固相萃取条件对全血样本进行处理，并用于液相色谱串联质谱检测，具有高选择性、高特异性、高灵敏度的特点，能够准确评估人体叶酸代谢情况，并可以根据活性叶酸比例推测基因型。

Description

一种检测叶酸的试剂盒以及全血样本中叶酸的检测方法

技术领域

本发明涉及生物分析检测技术领域，具体而言，涉及一种检测叶酸的试剂盒以及全血样本中叶酸的检测方法。

背景技术

叶酸(Folic Acid)是一组化学结构相似，生化特征相近的化合物的统称，属于水溶性B族维生素，人体自身无法合成，需要通过食物来摄取。进入机体的叶酸在一系列酶催化作用下，转化成活性形式，发挥生理作用。叶酸可转化为四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸等。

目前叶酸检测方法主要有微生物法、化学发光法。这两种方法测定总叶酸，无法对叶酸进行分型检测，且无法准确评估人体叶酸及叶酸代谢情况。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测叶酸的试剂盒以及全血样本中叶酸的检测方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种检测叶酸的试剂盒，其包括：用于固相萃取叶酸的平衡液、淋洗液和洗脱液；其中，所述平衡液、所述淋洗液和所述洗脱液的pH均为2～5。

第二方面，本发明实施例提供了一种叶酸检测的样本前处理方法，其包括采用如前述实施例所述的检测叶酸的试剂盒对全血样本进行固相萃取。

第三方面，本发明实施例提供了一种全血样本中叶酸的检测方法，其包括采用如前述实施例所述的叶酸检测的样本前处理方法对样本进行前处理，并将处理后的样本进行叶酸的液相色谱串联质谱检测。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过优化固相萃取过程中平衡液、淋洗液和洗脱液的pH，以最大限度地保护叶酸不被氧化破坏，且将多种形式的叶酸之间的转化过程稳定在一定水平，进而能够很好的评价全血样本中多种形式叶酸的情况，为叶酸的检测分型提供了途径。

此外，采用优化的固相萃取条件对全血样本进行处理，并用于液相色谱串联质谱检测，具有高选择性、高特异性、高灵敏度的特点，能够准确评估人体叶酸代谢情况，并可以根据活性叶酸比例推测基因型。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为叶酸代谢途径示意图；

图2为质谱检测人全血样本的总离子流图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

首先，本发明实施例提供了一种检测叶酸的试剂盒，其包括：用于固相萃取叶酸的平衡液、淋洗液和洗脱液；其中，所述平衡液、所述淋洗液和所述洗脱液的pH均为2～5。

发明人经一系列创造性劳动后发现，当pH为6以上时，叶酸的回收率较低，容易发生降解或转化，并且在高pH条件下，四氢叶酸完全转化或者降解，样本中不能检出。因此，本申请将所述平衡液、所述淋洗液和所述洗脱液的pH均为2～5，有利于保护叶酸不被破坏，且将多种形式的叶酸之间的转化过程稳定在一定水平，进而能够很好的评价全血样本中多种形式叶酸的情况。具体可以设定为2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，所述平衡液、所述淋洗液和所述洗脱液的pH均为2～4，优选为2～3。

在没有限定的情况下，平衡液、淋洗液和洗脱液的pH可以采用现有的缓冲体系，优选为氨水。

优选地，所述平衡液的组分包括甲酸铵和抗坏血酸(VC)中的至少一种。

优选地，在所述平衡液中，甲酸铵的质量分数为0.5％～2％，具体可以为0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％和2％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，在所述平衡液中，抗坏血酸的质量分数为0.1％～1％，具体可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，所述淋洗液的组分包括甲酸铵和抗坏血酸中的至少一种。

优选地，在所述淋洗液中，甲酸铵的质量分数为0.01％～0.1％，具体可以为0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％和0.1％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，在所述淋洗液中，抗坏血酸的质量分数为0.01％～0.5％，具体可以为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％和0.05％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，所述洗脱液的组分包括去离子水、甲醇、乙腈、乙酸和抗坏血酸中的至少一种。

优选地，在所述洗脱液中，甲醇的体积分数为15％～25％，具体可以为15％、17％、19％、21％、23％和25％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，在所述洗脱液中，乙腈的体积分数为5％～15％，具体可以为5％、7％、9％、11％、13％和15％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，在所述洗脱液中，乙酸的体积分数为0.1％～0.5％，具体可以为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，在所述洗脱液中，抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，具体可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％和2％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，所述试剂盒还包括保护剂，保护剂中含有抗坏血酸。优选地，保护剂中抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，pH为2～4。

优选地，所述缓冲液的组分包括甲酸铵和抗坏血酸中的至少一种。

优选地，所述缓冲液中，甲酸铵的质量分数为0.5％～2％，具体可以为0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％和2％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，所述缓冲液中，抗坏血酸的质量分数为0.1％～1％，具体可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％中的任意一种或任意两种之间的范围。

本发明实施例还提供了一种叶酸检测的样本前处理方法，其包括采用如前述任意实施例所述的检测叶酸的试剂盒对全血样本进行固相萃取。

优选地，所述固相萃取包括：平衡、上样、淋洗和洗脱。可选地，在平衡前，所述固相萃取还包括活化，活化剂优选为甲醇。

在上样前，所述样本前处理方法还包括：将全血样本与缓冲液混合，以得到上样液，所述缓冲液的pH＜6。

优选地，所述缓冲液的pH为2～4。

优选地，所述缓冲液的组分包括甲酸铵和抗坏血酸中的至少一种。

优选地，在所述上样液中，所述缓冲液中的甲酸铵的质量分数为0.5％～2％，具体可以为0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％和2％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，在所述上样液中，所述缓冲液中的抗坏血酸的质量分数为0.1％～1％，具体可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，与所述缓冲液混合的全血样本为加标样本；

优选地，所述加标样本中预先加入有抗坏血酸。抗坏血酸具有抗氧化作用，能够作为叶酸的保护剂，减少前处理过程中的氧化破坏。

优选地，在所述加标样本中预先加入的抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，优选为0.5％～1.5％。叶酸在血中以多聚谷氨酸形式存在，需要解离成游离形式才能进行准确定量分析，发明人发现，在含有特定浓度范围的抗坏血酸的条件下，多种形式的叶酸(叶酸、5-甲基四氢叶酸、四氢叶酸、5,10亚甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸)解聚效果较好，且该浓度的VC能够起到较好的抗氧化作用，充分保护叶酸不被氧化破坏。

优选地，在加标样本中加入抗坏血酸后，所述前处理方法还包括将加标样本于30～45℃孵育4～8h；孵育过程能够使叶酸解聚成游离形式，以便于纯化检测。

孵育温度具体可以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃和45℃中的任意一种或任意两种之间的范围，孵育时间具体可以为4h、5h、6h、7h和8h中的任意一种或任意两种之间的范围。优选地，孵育的温度为35～40℃，5～6h。

本发明检测的“叶酸”是一种统称，叶酸在血液样本中包括多种形式，叶酸的代谢途径可参照图1，具体地，所述叶酸的形式包括：叶酸、四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰基四氢叶酸中的至少一种。

优选地，所述固相萃取装置为SPE柱和/或SPE板；

优选地，所述SPE板为反相聚合物板。固相萃取装置能够对叶酸提取效果具有一定影响，反相聚合物SPE板对于5种叶酸形式的回收率最好，但是这种影响是有限的，即便不采用优选的SPE板，也可以达到本申请所声称的技术效果。

此外，本发明实施例还提供了一种全血样本中叶酸的检测方法，其包括采用如前述任意实施例所述的叶酸检测的样本前处理方法对样本进行前处理，并将处理后的样本进行叶酸的液相色谱串联质谱检测；

所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

优选地，所述叶酸的形式包括：叶酸、四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸中的至少一种。

本发明实施例提供的检测方法能够对检测可以对叶酸、四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸进行准确定量。通过对叶酸各级代谢产物的定量分析，可以了解叶酸代谢通路是否正常，推断MTHFR基因是否突变。辅助临床全面了解个体叶酸代谢水平，精准评估机体叶酸营养情况，为围孕期妇女科学合理地制定叶酸补充方案，从而达到优生优育的目的。

可选地，液相色谱串联质谱的具体条件可以参照本领域公知的用于叶酸检测的色谱条件和质谱条件，不再赘述。

需要说明的是，优选范围的技术方案能够对应达到更好的技术效果。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种检测叶酸的试剂盒，其包括：保护剂以及用于固相萃取叶酸的平衡液(同缓冲液)、淋洗液、洗脱液。

保护剂：质量分数为1％的抗坏血酸(pH 2.7)。

缓冲液/平衡液的组分包括：1％甲酸铵、0.5％抗坏血酸，pH为3.2；

淋洗液的组分包括：0.05％甲酸铵、0.1％抗坏血酸，pH为3.4；

洗脱液的组分包括：69％去离子水、20％甲醇、10％乙腈、1％乙酸、0.5％抗坏血酸，pH为3.2。

其中，甲酸铵和抗坏血酸的％为质量分数，甲醇、乙腈、乙酸的％为体积分数。

一种全血样本中叶酸的检测方法，其包括以下步骤。

(1)样本前处理：

1.1全血样本添加抗坏血酸

每100μL全血样本加入900μL1％抗坏血酸作为保护剂。

1.2固相萃取

取含有保护剂的样本200μL，加入内标5μL(1μg/mL混合内标)，混匀。于37℃孵育4h。

加入800μL缓冲液混匀。4℃条件下冷冻离心10min，得到上样液。

固相萃取的具体步骤：

活化：甲醇1mL加入SPE板，操作正压装置，使液滴以3s～5s的速度滴入废液盒。乙腈1mL加入SPE板，同法操作。

平衡：1mL平衡液加入SPE板，操作正压装置，使平衡液过板滴入废液盒。

上样：取制备好的上样液1mL，依次加入SPE板，操作正压装置，使液体滴入废液盒。

淋洗：1mL淋洗液加入SPE板，操作正压装置，使淋洗液过板滴入废液盒。重复一遍该操作。

洗脱：加入200μL洗脱液，操作正压装置，使洗脱液过板滴入干净的96孔板(1mL)。

(2)液相色谱串联质谱检测

经前处理的样本，放入液相色谱质谱联用仪的进样器内，设置程序，进行自动检测。

质谱检测人全血样本的总离子流图可参照图2。

试验例1

通过实施例1提供的检测方法，设置2组实验组，实验组1为实施例1的技术方案，实验组2与实施例1大致相同，区别在于保护剂的不同，实验组2的保护剂为0％VC(纯水)，2组实验组对人混合全血加标准品样本进行检测，其回收率结果如下。

表1回收率

注：回收率＝(人混合全血样本加标准品检测值-人混合全血样本检测值)/标准品检测值。

结果发现，实施例1的1％VC条件下(pH＝2.7)，叶酸、5-甲基四氢叶酸、四氢叶酸、5,10亚甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸解聚效果较好，且该浓度的VC能够起到较好的抗氧化作用，充分保护叶酸不被氧化破坏。

实验组2的0％VC(纯水)即中性条件，四氢叶酸、5,10亚甲基四氢叶解聚较差，且没有保护剂存在，样本处理过程中四氢叶酸、5,10亚甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸会有不同程度降解。

试验例2

通过实施例1提供的检测方法，设置3组实验组，实验组1为实施例1的技术方案，实验组2～3与实施例1大致相同，区别在于洗脱液的不同，实验组2的洗脱液为；69％(v/v)去离子水、20％(v/v)甲醇、10％(v/v)乙腈、1(v/v)％乙酸、0.5％(m/m)抗坏血酸，pH＝6；实验组3的洗脱液为：49％(v/v)去离子水、40％(v/v)甲醇、10％(v/v)乙腈、1％(v/v)乙酸、0.5％(m/m)抗坏血酸，pH＝3.8；

3组实验组对人混合全血加标准品样本进行检测，回收率结果如下。回收率计算方法与前面相同。

表2回收率

实验组1的结果是5种叶酸均具有较好的洗脱效果，且上机检测，峰型较好。

实验组2的结果是叶酸和四氢叶酸洗脱效率较低，样本中几乎检测不到。

实验组3的结果是5种叶酸均具有较好的洗脱效果，上机检测时，四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸峰展宽，无法实现与杂质峰的较好分离。

试验例3

通过实施例1提供的检测方法，设置4组实验组，实验组1为实施例1的技术方案，实验组2与实施例1大致相同，区别在于缓冲液、平衡液、淋洗液以及洗脱液的pH不同，具体参照表3。

表3处理条件和检测结果

试验例4

本发明技术方案的准确度考察：通过在全血样品中添加3个浓度水平的叶酸标准溶液，每个浓度平行制备6份，通过加标浓度与加标实测浓度(检测方法和试剂盒参照实施例1)比值计算回收率，平均回收率在80％-120％之间，符合准确度评价要求。

具体结果如下表所示(叶酸、5-甲基四氢叶酸为准确定量，四氢叶酸、5,10亚甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸为半定量，未按照该方法进行考察)：

表4实验结果

表5实验结果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测叶酸的试剂盒，其特征在于，其包括：用于固相萃取叶酸的平衡液、淋洗液和洗脱液；其中，所述平衡液、所述淋洗液和所述洗脱液的pH均为2～5。

2.根据权利要求1所述检测叶酸的试剂盒，其特征在于，所述平衡液、所述淋洗液和所述洗脱液的pH均为2～4，优选为2～3。

3.根据权利要求1所述的检测叶酸的试剂盒，其特征在于，所述平衡液的组分包括甲酸铵和抗坏血酸中的至少一种；

优选地，在所述平衡液中，甲酸铵的质量分数为0.5％～2％；

优选地，在所述平衡液中，抗坏血酸的质量分数为0.1％～1％。

4.根据权利要求1所述的检测叶酸的试剂盒，其特征在于，所述淋洗液的组分包括甲酸铵和抗坏血酸中的至少一种；

优选地，在所述淋洗液中，甲酸铵的质量分数为0.01％～0.1％；

优选地，在所述淋洗液中，抗坏血酸的质量分数为0.01％～0.5％；

优选地，所述洗脱液的组分包括去离子水、甲醇、乙腈、乙酸和抗坏血酸中的至少一种；

优选地，在所述洗脱液中，甲醇的体积分数为15％～25％；

优选地，在所述洗脱液中，乙腈的体积分数为5％～15％；

优选地，在所述洗脱液中，乙酸的体积分数为0.1％～0.5％；

优选地，在所述洗脱液中，抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％。

5.根据权利要求1所述的检测叶酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述试剂盒还包括保护剂，保护剂中含有抗坏血酸；

优选地，所述保护剂中抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，pH为2～4。

6.一种叶酸检测的样本前处理方法，其特征在于，其包括采用如权利要求1～5任一项所述的检测叶酸的试剂盒对全血样本进行固相萃取。

7.根据权利要求6所述的叶酸检测的样本前处理方法，其特征在于，所述固相萃取包括：平衡、上样、淋洗和洗脱；

在上样前，所述样本前处理方法还包括：将全血样本与缓冲液混合，以获得上样液，所述缓冲液的pH＜6；

优选地，所述缓冲液的pH为2～4；

优选地，所述缓冲液的组分包括甲酸铵和抗坏血酸中的至少一种；

优选地，在所述上样液中，所述缓冲液中的甲酸铵的质量分数为0.5％～2％；

优选地，在所述上样液中，所述缓冲液中的抗坏血酸的质量分数为0.1％～1％；

优选地，与所述缓冲液混合的全血样本为加标样本；

优选地，所述加标样本中预先加入有抗坏血酸；

优选地，在所述加标样本中预先加入的抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，优选为0.5％～1.5％；

优选地，在加标样本中加入抗坏血酸后，所述前处理方法还包括将加标样本于30～45℃孵育4～8h；

优选地，孵育的温度为35～40℃，5～6h。

8.根据权利要求6或7所述的叶酸检测的样本前处理方法，其特征在于，所述叶酸的形式包括：叶酸、四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰基四氢叶酸中的至少一种；

优选地，固相萃取装置为SPE柱和/或SPE板；

优选地，所述SPE板的吸附剂为反相聚合物。

9.一种全血样本中叶酸的检测方法，其特征在于，其包括采用如权利要求6～8任一项所述的叶酸检测的样本前处理方法对样本进行前处理，并将处理后的样本进行叶酸的液相色谱串联质谱检测；

所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

10.根据权利要求9所述的全血样本中叶酸的检测方法，其特征在于，所述叶酸的形式包括：叶酸、四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸中的至少一种。

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