CN108760920B - 一种基于hplc-msms法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明所述基于HPLC‑MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC‑MS/MS应用于马铃薯和土壤中氰霜唑及其代谢物CCIM的定性确证和定量检测中，能够快速的进行氰霜唑及其代谢物CCIM残留量的检测，整个方法的回收率较高，重复性好，且平均回收率达到86.1‑98.2％，平均相对标准偏差(RSD)为2.0‑6.9％，检出限低于1.5μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点；并且能满足美国、日本、欧盟、国际食品法典委员会(CAC)等相对应食品安全检测的0.02、0.05、0.01、0.01mg/kg残留限量，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法

技术领域

本发明属于农药残留量检测技术领域，具体涉及一种基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物(CCIM)残留量的方法。

背景技术

近年来，以马铃薯疫病和葡萄霜霉病为代表的卵菌性病害迅速发展，给农业生产带来了巨大损失，另一方面，此类病原菌的抗性菌不断发展也成为妨碍其药性的一个大问题，使得常规药剂很难防治。

氰霜唑(cyazofamid)，商品名为科佳，其化学名称为4-氯-2-氰基-N,N-二甲基-5-对甲苯基咪唑-1-磺酰胺，英文化学名称为4-chloro-2-cyano-n,n-dimethyl-5-p-tolylimidazole-1-sulfonamide，CAS登录号为120116-88-3，分子量为324.786，是由日本石原株式会社研制，并与BASF共同开发的新一代苯基咪唑类杀菌剂，主要用于防治晚疫病、霜霉病、疫病等病害。氰霜唑由于作用机理独特，且活性高、又无交互抗性，能有效阻碍病原菌孢子萌发至孢子囊形成的各个生育阶段，进而有效的抑制病原菌的基数，从而达到预防和控制病害蔓延的目的。

研究发现，氰霜唑在使用后会迅速分解成4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)、4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-甲酰胺(CCIM-AM)和4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-羧酸(CCTA)等多个代谢产物。其中4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)是氰霜唑在植物体内的主要降解产物，并且与氰霜唑相比具有更高的毒性，其在农产品中的残留可能会带来更高的膳食摄入风险。

因此，我国《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2016)中规定，氰霜唑的残留定义为氰霜唑和CCIM残留量之和，并要求在进行市场监测时，应同时检测氰霜唑和CCIM的残留量，并基于此进行安全性评价。但由于目前尚缺乏对CCIM标准分析的方法，使得《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2016)中只对其制订了临时限量。

目前，国内尚无对于马铃薯和土壤中氰霜唑及其代谢物的残留量进行同时测定的方法。虽然现有文献报道中有过利用液相色谱法、电化学法和液质联用法的报道，但大多数都只测定了母体即氰霜唑的残留量，但并不能同时对其代谢产物CCIM进行测定。因此，亟需开发一种能够同时测定氰霜唑及其代谢物(CCIM)残留量的方法，尤其是马铃薯和土壤中氰霜唑及其代谢物的残留量的测定，对于马铃薯作物的种植而言，具有重要的意义。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物(CCIM)残留量的方法，以解决现有技术中无法同时对氰霜唑及其代谢物(CCIM)的残留量进行检测的问题。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，包括如下步骤：

(1)取待测样品加入提取溶剂进行涡旋提取，并进行盐析，固液分离并收集滤液，得到供试溶液；

(2)取不含氰霜唑及其代谢物CCIM的同种类基质空白样品，加入所述提取溶剂和含氰霜唑及其代谢物CCIM的标准溶液，配制成至少3个浓度的含氰霜唑及其代谢物CCIM的对照溶液；

(3)以高效液相色谱串联质谱仪对所述对照溶液和供试溶液进行检测，以外标法计算氰霜唑及其代谢物CCIM的含量。

所述步骤(1)中，所述提取溶剂包括乙腈。

所述步骤(1)中，所述盐析步骤为加入氯化钠进行处理。

所述步骤(1)中，还包括将所得供试溶液过0.22μm滤膜进行净化处理的步骤。

所述步骤(3)中，所述高效液相色谱的检测条件包括：

色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅢ色谱柱，150mm×2.0mm，2.2μm；

样品室温度：15℃；

流动相：体积比为20：80的0.1％甲酸水溶液-乙腈；

流速：0.4mL/min；

进样量：5μL。

所述步骤(3)中，所述质谱检测条件包括：

离子源：电喷雾离子源(ESI)；

毛细管电压：3.5kV；

加热块温度：400℃；

干燥气温度：250℃；

干燥气流量：15.0L/min；

雾化气流量：3.0L/min；

反应气(Ar)压力：230kpa。

所述步骤(3)中，所述检测步骤包括定性检测和/或定量检测的步骤。

所述定性检测具体为：测定所述供试溶液和所述对照溶液时，若所述供试溶液中色谱峰保留时间与所述空白溶液中相应色谱峰保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与所述对照溶液的离子丰度比相一致，则可判断所述供试溶液中存在氰霜唑及其代谢物CCIM残留；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含氰霜唑及其代谢物CCIM残留。

所述定量检测的步骤包括：将各浓度梯度的所述对照溶液进行HPLC-MS/MS测定，以所述对照溶液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；随后将所述供试溶液注入HPLC-MS/MS，在相同条件下测得所述供试溶液中氰霜唑及其代谢物CCIM的色谱峰面积，分别代入所述标准曲线，计算得到所述供试溶液中氰霜唑及其代谢物CCIM的含量。

所述待测样品包括马铃薯和/或土壤。

本发明所述基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于马铃薯和土壤中氰霜唑及其代谢物CCIM的定性确证和定量检测中，能够快速的进行氰霜唑及其代谢物CCIM残留量的检测，整个方法的回收率较高，重复性好，且平均回收率达到86.1-98.2％，平均相对标准偏差(RSD)为2.0-6.9％，检出限低于1.5μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点；并且能满足美国、日本、欧盟、国际食品法典委员会(CAC)等相对应食品安全检测的0.02、0.05、0.01、0.01mg/kg残留限量，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为氰霜唑(10μg/mL)及其代谢物CCIM(10μg/mL)马铃薯基质标液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；

图2为不含氰霜唑及其代谢物CCIM的马铃薯空白样品的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；

图3为空白马铃薯添加氰霜唑(10μg/mL)其代谢物CCIM(10μg/mL)的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；

图4为实施例1中氰霜唑的标准工作曲线；

图5为实施例1中氰霜唑代谢物CCIM的标准工作曲线；

图6为了氰霜唑(10μg/mL)及其代谢物CCIM(10μg/mL)土壤基质标液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；

图7为不含氰霜唑及其代谢物CCIM的土壤空白样品的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；

图8空白土壤添加氰霜唑(10μg/mL)及其代谢物CCIM(10μg/mL)的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；

图9为实施例2中氰霜唑的标准工作曲线；

图10为实施例2中氰霜唑代谢物CCIM的标准工作曲线。

具体实施方式

本发明下述各实施例中使用的仪器与试剂包括：

高效液相色谱质谱联用仪LCMS-8030，SHIMADU公司；

多功能食品加工机XBLL-25A，上海帅佳电子科技有限公司；

电子天平JA21002，上海精密科学仪器有限公司；

离心机TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂；

氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

乙腈，色谱纯，瑞典欧森巴克环境化学公司；

氰霜唑标准品，纯度99.5％，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH；

氰霜唑代谢物CCIM标准品：纯度95％，由中国科学院动物研究所提供。

实施例1马铃薯中氰霜唑及其代谢物残留量的检测

本实施例所述基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，包括如下步骤：

(1)样品前处理及提取

将马铃薯样品用食品调理仪进行粉碎，准确称取10g样品(精确到0.01g)至50mL具塞塑料离心管内，加入10mL乙腈，涡旋混匀10min；随后加入2g氯化钠进行盐析处理，涡旋处理1min；并于3800r/min下离心处理5min；直接取上清液过0.22μm滤膜进行净化处理，得到待测样品供试溶液，待HPLC-MS/MS测定；

(2)标准工作溶液及对照溶液的配制

分别准确称取50±0.1mg氰霜唑标准品和氰霜唑代谢物CCIM标准品于50mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容至1000.0μg/mL的标准储备液；随后移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液；并将10μg/mL的标准溶液稀释配成2、1、0.4、0.2、0.1μg/mL的混合标准溶液；另取不含氰霜唑及其代谢物的空白样品按上述步骤(1)的前处理步骤处理，得样品提取净化残渣，在此残渣中加入900μL乙腈和100μL上述混合标准溶液，涡旋混匀，分别配成10、20、40、100、200μg/L浓度的基质标准工作溶液，即为对照溶液；

(3)高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定

将上述配制的不同浓度梯度的标准工作液分别注入HPLC-MS/MS，以外标法进行氰霜唑及其代谢物含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入HPLC-MS/MS进行测定，测得样品液中氰霜唑及其代谢物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氰霜唑及其代谢物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氰霜唑及其代谢物CCIM残留量；

本实施例中HPLC-MS/MS色谱条件为：

色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅢ色谱柱(150mm×2.0mm，2.2μm)；

样品室温度15℃；

流动相：0.1％甲酸水溶液-乙腈(20％：80％，v/v)；

流速：0.4mL/min；

进样体积：5μL。

所述质谱检测条件包括：

电喷雾离子源(ESI)；

毛细管电压：3.5kV；

加热块温度：400℃；

干燥气温度：250℃；

干燥气流量：15.0L/min；

雾化气流量：3.0L/min；

反应气(Ar)压力：230kpa。

图1给出了氰霜唑(10μg/mL)及其代谢物CCIM(10μg/mL)马铃薯基质标液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图2为不含氰霜唑及其代谢物CCIM的马铃薯空白样品的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图3为空白马铃薯添加氰霜唑(10μg/mL)其代谢物CCIM(10μg/mL)的HPLC-MS/MS选择离子色谱图。可见，氰霜唑及其代谢物CCIM的检测模式见下表1所示。

表1氰霜唑及其代谢物CCIM的检测模式选择

化合物名称	采集模式	定量离子对(m/z)	定性离子对(m/z)	碰撞能量(eV)
					氰霜唑	MRM(+)	325.0>108.0	325.0>108.	15
CCIM	MRM(-)	216.0>35.0	216.0>35.0	20

本实施例所述氰霜唑及其代谢物CCIM的定性鉴定步骤及鉴定标准包括：在上述相同的条件下，如果供试溶液中氰霜唑及其代谢物CCIM色谱峰保留时间与标准溶液中相应氰霜唑及其代谢物CCIM的保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，则可判断样液中存在氰霜唑及其代谢物CCIM；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本实施例所述氰霜唑及其代谢物CCIM的定量检测步骤及鉴定标准包括：按照上述检测条件，将所得各浓度的空白溶液注入高效液相色谱串联质谱仪，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，分别得到氰霜唑及其代谢物CCIM的标准工作曲线如图4、5所示。

加标回收率和重复性

在不含氰霜唑及其代谢物CCIM的马铃薯中加入10、20和200μg/kg³个浓度水平的氰霜唑及其代谢物CCIM标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。

将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差，测定结果见下表2。

表2马铃薯中氰霜唑及其代谢物(CCIM)的回收率和重复性(n＝5)

由表2可以看出，在3个加标水平上，氰霜唑及其代谢物CCIM的平均回收率为86.1％-96.3％，平均相对标准偏差(RSD)为2.2％-6.9％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

检出限

将不同浓度的氰霜唑及其代谢物CCIM基质标准工作溶液注入HPLC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比计算检出限，氰霜唑及其代谢物CCIM的检出限为0.80μg/kg。

实施例2土壤中氰霜唑及其代谢物CCIM残留量的检测

本实施例所述基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，包括如下步骤：

(1)样品前处理及提取

称取土壤样本10g(精确到0.0g)于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL乙腈，涡旋混匀10min；随后加入2g氯化钠进行盐析处理，涡旋处理1min；并于3800r/min下离心处理5min待净化；直接取上清液约1mL，过0.22μm有机系滤膜进行净化处理，得到待测样品供试溶液，待HPLC-MS/MS测定；

(2)标准工作溶液及对照溶液的配制

将上述实施例1中配制的10μg/mL标准溶液稀释配成10、2、1、0.2、0.1μg/mL标准溶液；另取不含氰霜唑及其代谢物CCIM的土壤空白样品按上述前处理步骤处理，得样品提取净化残渣，在此残渣中加入900μL乙腈和100μL上述混合标准溶液，涡旋混匀，配成10、20、50、100、200、1000μg/L基质标准工作溶液，即为对照溶液；

(3)高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定

将上述配制的不同浓度梯度的标准工作液分别注入HPLC-MS/MS，以外标法进行氰霜唑及其代谢物CCIM含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入HPLC-MS/MS进行测定，测得样品液中氰霜唑及其代谢物CCIM的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氰霜唑及其代谢物CCIM含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氰霜唑及其代谢物CCIM残留量；

本实施例中HPLC-MS/MS色谱条件为：

色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅢ色谱柱(150mm×2.0mm，2.2μm)；

样品室温度15℃；

流动相：0.1％甲酸水溶液-乙腈(20％：80％，v/v)；

流速：0.4mL/min；

进样体积：5μL。

所述质谱检测条件包括：

电喷雾离子源(ESI)；

毛细管电压：3.5kV；

加热块温度：400℃；

干燥气温度：250℃；

干燥气流量：15.0L/min；

雾化气流量：3.0L/min；

反应气(Ar)压力：230kpa。

图6给出了氰霜唑(10μg/mL)及其代谢物CCIM(10μg/mL)土壤基质标液的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图7为不含氰霜唑及其代谢物CCIM的土壤空白样品的HPLC-MS/MS选择离子色谱图；图8空白土壤添加氰霜唑(10μg/mL)及其代谢物CCIM(10μg/mL)的HPLC-MS/MS选择离子色谱图。可见，氰霜唑及其代谢物CCIM的检测模式见下表3所示。

表3氰霜唑及其代谢物CCIM的检测模式选择

本实施例所述氰霜唑及其代谢物CCIM的定性鉴定步骤及鉴定标准包括：在相同的条件下，如果供试溶液中氰霜唑及其代谢物CCIM色谱峰保留时间与标准溶液中相应氰霜唑及其代谢物CCIM的保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，则可判断样液中存在这种氰霜唑及其代谢物CCIM；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种氰霜唑及其代谢物CCIM。

本实施例所述氰霜唑及其代谢物CCIM的定量检测步骤及鉴定标准包括：按照上述检测条件，将所得各浓度的空白溶液注入高效液相色谱串联质谱仪，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，分别得到氰霜唑及其代谢物CCIM的标准工作曲线如图9、10所示。

加标回收率和重复性

在不含氰霜唑及其代谢物CCIM的土壤中加入10、20和200μg/kg³个浓度水平的氰霜唑及其代谢物CCIM标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。

将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差，测定结果见下表4。

表4土壤中氰霜唑及其代谢物(CCIM)的回收率和重复性(n＝5)

由表2可以看出，在3个加标水平上，氰霜唑及其代谢物CCIM的平均回收率为90.2％-98.2％，平均相对标准偏差(RSD)为2.0％-6.9％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

检出限

将不同浓度的氰霜唑及其代谢物CCIM基质标准工作溶液注入HPLC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比计算检出限，氰霜唑及其代谢物CCIM的检出限为1.5μg/kg。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取待测样品加入乙腈进行涡旋提取，并加入氯化钠进行盐析，固液分离并收集滤液，得到供试溶液；所述待测样品为马铃薯；

(2)取不含氰霜唑及其代谢物CCIM的同种类基质空白样品，加入乙腈和含氰霜唑及其代谢物CCIM的标准溶液，配制成至少3个浓度的含氰霜唑及其代谢物CCIM的对照溶液；

(3)以高效液相色谱串联质谱仪对所述对照溶液和供试溶液进行检测，以外标法计算氰霜唑及其代谢物CCIM的含量；

高效液相色谱的检测条件包括：

色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅢ色谱柱，150mm×2.0mm，2.2μm；

样品室温度：15℃；

流动相：体积比为20：80的0.1％甲酸水溶液-乙腈；

流速：0.4mL/min；

进样量：5μL；

质谱检测条件包括：

离子源：电喷雾离子源(ESI)；

毛细管电压：3.5kV；

加热块温度：400℃；

干燥气温度：250℃；

干燥气流量：15.0L/min；

雾化气流量：3.0L/min；

反应气Ar压力：230kpa。

2.根据权利要求1所述的基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，还包括将所得供试溶液过0.22μm滤膜进行净化处理的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述检测步骤包括定性检测和/或定量检测的步骤。

4.根据权利要求3所述的基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，其特征在于，所述定性检测具体为：测定所述供试溶液和所述对照溶液时，若所述供试溶液中色谱峰保留时间与所述对照溶液中相应色谱峰保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与所述对照溶液的离子丰度比相一致，则可判断所述供试溶液中存在氰霜唑及其代谢物CCIM残留；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含氰霜唑及其代谢物CCIM残留。

5.根据权利要求4所述的基于HPLC-MSMS法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法，其特征在于，所述定量检测的步骤包括：将各浓度梯度的所述对照溶液进行HPLC-MS/MS测定，以所述对照溶液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；随后将所述供试溶液注入HPLC-MS/MS，在相同条件下测得所述供试溶液中氰霜唑及其代谢物CCIM的色谱峰面积，分别代入所述标准工作曲线，计算得到所述供试溶液中氰霜唑及其代谢物CCIM的含量。

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