CN109828051B

CN109828051B - 一种有毒化合物的检测方法

Info

Publication number: CN109828051B
Application number: CN201910182726.4A
Authority: CN
Inventors: 李勇竞
Original assignee: Wuhu Center For Disease Control And Prevention
Current assignee: Wuhu Center For Disease Control And Prevention
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2039-03-11
Also published as: CN109828051A

Abstract

本发明涉及一种有毒化合物的检测方法，步骤包括样品预处理、超高效液相色谱‑串联质谱法检测，本发明通过超高效液相色谱‑串联质谱法同时测定突发中毒事件样品中的多种农药和鼠药，提高了突发中毒事件的检测效率、缩短了样品检测时间、避免多重检测、减少了中毒样品的消耗，实现了快速确定中毒因子。

Description

一种有毒化合物的检测方法

技术领域

本发明属于有机化合物检测技术领域，特别是涉及一种有毒化合物的检测方法。

背景技术

近年来，因农药和鼠药管理不善，误食、投毒、服毒、污染等引起的中毒事件屡有发生，成为突发中毒事件中常见的有毒化合物，危害广大人民群众的生命健康。目前，农药和鼠药的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法，其中液相色谱-串联质谱法具有很高的灵敏度(ppb级)和定性、定量准确性是检测农药和鼠药的理想方法之一。针对突发中毒事件的四种常见样品：血液、尿液、食物、呕吐物中的农药或鼠药，国内已有一些学者采用液相色谱-串联质谱法进行分析，但是这些方法只是单独检测农药或单独检测鼠药，由于农药多为有机磷类化合物，鼠药多为抗血凝性化合物，分子结构完全不同，理化性质也不同，并且血液、尿液、食物、呕吐物的前处理方法不同，需要分别进行复杂的前处理，因此在突发中毒事件中需要进行多次、分批检测，增加了中毒样品的消耗、延长了检测时间、增加了检测成本。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种有毒化合物的检测方法。本发明通过超高效液相色谱-串联质谱法同时测定突发中毒事件样品中的多种农药和鼠药，提高了突发中毒事件的检测效率、缩短了样品检测时间、避免多重检测、减少了中毒样品的消耗，实现了快速确定中毒因子，为挽救人民生命提供有效的技术支持

本发明采用的技术方案是：

一种有毒化合物的检测方法，步骤包括：

A、样品预处理；

所述样品为血清、尿液、食物、呕吐物中的一种或几种；

所述血清的预处理方法为：

将体积比为1:5的血清和乙腈加入离心管中，涡旋震荡混匀后离心分离，取上层清液于温水浴中用氮气吹干，加入甲醇定容备用。所述水浴温度为45-55℃。

所述尿液的预处理方法为：

将体积比为1:5的尿液和乙酸乙酯加入离心管中，涡旋震荡混匀后离心分离，将乙酸乙酯提取液吸出后，再按相同的方法重复提取一次，合并乙酸乙酯提取液于温水浴中用氮气吹干，加入甲醇定容备用。所述水浴温度为45-55℃。

所述食物的预处理方法为：

将质量比为2:5的食物和无水硫酸钠以及与食物质量体积比(g/mL)为1:5的乙腈、Quechers萃取包加入离心管中，涡旋震荡混匀后离心分离，取上层清液于温水浴中用氮气吹干，加入甲醇定容备用。所述水浴温度为45-55℃。

所述Quechers萃取包的成分及质量比：PSA:C18:GCB:MgSO₄＝80:80:9:30(PSA:N-丙基乙二胺，C18:碳-18，GCB:石墨化炭黑)，所述Quechers萃取包与食物的质量比为1:2.01。

所述呕吐物的预处理方法为：

将质量比为1:5的呕吐物和无水硫酸钠以及与食物质量体积比(g/mL)为1:5的乙腈、Quechers萃取包加入离心管中，涡旋震荡混匀后离心分离，取上层清液于温水浴中用氮气吹干，加入甲醇定容备用。所述水浴温度为45-55℃。

所述Quechers萃取包的成分及质量比：PSA:C18:GCB:MgSO₄＝80:80:9:30，所述Quechers萃取包与食物的质量比为1:2.01；

B、用超高效液相色谱-串联质谱法进行检测；

所述色谱条件为：以UPLC BEH C18色谱柱为分析柱，流动相A为5mmol/L乙酸铵，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序:0～3.0min，流动相由40％B线性梯度至90％B，保持2min后，流动相又回到40％B，并平衡2min；流速0.2mL/min；柱温40℃；进样体积5μL；

所述质谱条件为：复合电喷雾离子源，正、负离子同时多反应监测(MRM)模式；ESI毛细管电压3.0kV；离子源温度120℃；锥孔反吹气流量50L/h，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气流量500L/h。

本技术采用超高效液相色谱-串联质谱法实现农药和鼠药同时检测，提高了突发中毒事件的检测效率、缩短了样品检测时间、避免多重检测、减少了对中毒样品量的消耗。为了缩短样品预处理时间，本研究采用了Quechers萃取管一步提取、净化剩余食物和呕吐物中的农药和鼠药，取得了较理想的效果。

附图说明

图1-图16分别为具体实施方式中甲胺磷、乙酰甲胺磷、安妥、氧化乐果、对硫磷、克鼠灵、氯唑磷、三唑磷、甲基毒死蜱、马拉硫磷、伏杀磷、杀鼠灵、氯灭鼠灵、溴鼠灵、溴敌隆和氟鼠灵标准溶液的MRM质谱图。

具体实施方式

本发明检测方法涉及到的仪器与试剂包括：

Aquity UPLC-Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪(配有电喷雾源，美国Waters公司)；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters公司)；MX-S旋涡混合器(中国大龙公司)；12位氮吹仪(天津恒奥公司)；TGL-20高速冷冻离心机(中国湘仪公司)；10mL容量瓶；5mL具塞离心管；微量移液枪(中国大龙公司)。

乙腈和甲醇(质谱级，美国Fisher公司)；乙酸铵(质谱级，美国Sigma公司)；超纯水(中国屈臣氏公司)；Quechers萃取包(，400mg PSA+400mg C18+45mg GCB+150mg MgSO4；中国月旭公司)；农药和鼠药标准品(浓度均为100mg/L)：甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果、对硫磷、氯唑磷、三唑磷、甲基毒死蜱、马拉硫磷、伏杀磷。鼠药标准品：安妥、克鼠灵、杀鼠灵、氯灭鼠灵、溴鼠灵、溴敌隆、氟鼠灵。新鲜人血清购自芜湖市中心血站，空白尿液来自志愿者。食物：取一定量的米饭、青菜、肉炒熟粉碎混合而成；呕吐物：取一定量的米饭、青菜、肉炒熟粉碎后，再加一定体积的盐酸溶液混合而成(5g食物样品+2ml 0.6M的盐酸溶液)。

混合标准储备液和基质标准系列溶液的制备：

分别取0.1mL各农药和鼠药单标溶液(农药和鼠药标准品)，加入一只10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成各农药和鼠药的浓度均为1000ug/L的混合标准储备液，于-20℃冰箱保存。七只10mL容量瓶，分别加入0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、0.8mL、1.0mL的混合标准储备液，分别用甲醇定容至刻度，制成浓度分别为1ug/L、5ug/L、10ug/L、20ug/L、50ug/L、80ug/L、100ug/L的标准系列溶液，再将标准系列溶液分别按照血清、尿液、食物、呕吐物的处理方法进行制备得到基质标准系列溶液。

样品预处理：

血清：取200μL血清于5mL具塞离心管中，加入1.0mL乙腈，涡旋震荡5min，以10000r/min离心5min，取上清液，于50℃水浴中用氮气吹干，加入1mL甲醇定容后上机，进样量5μL。

尿液：取1.0mL尿液于10mL具塞离心管中，加入5.0mL乙酸乙酯旋涡提取3min，3000r/min离心3min，吸取乙酸乙酯液于另一个10mL具塞离心管中，重复提取一次，合并乙酸乙酯提取液，于50℃水浴中用氮气吹干，加入1mL甲醇定容后上机，进样量5μL。

食物：取2g食物样品于50ml具塞离心管中，加入5g无水硫酸钠、10ml乙腈、Quchers萃取包，涡旋震荡5min，8000r/min高速离心5min，取上清液用氮气吹干，1ml甲醇定容，待测。

呕吐物：取2g食物样品于50ml具塞离心管中，加入10g无水硫酸钠、10ml乙腈、Quchers萃取包，涡旋震荡5min，8000r/min高速离心5min，取上清液用氮气吹干，1ml甲醇定容，待测。

本发明对血液和尿液分别采用乙腈沉淀蛋白并提取、乙酸乙酯直接两提取获得了较高的回收率，且方法过程短。对于食物和呕吐物，这两类基质比较复杂(含有色素、油脂、蛋白质等)，本发明先用足够的无水硫酸钠吸水，然后加入Quechers萃取包(400mg PSA+400mgC18+45mg GCB+150mg MgSO4)，该萃取包具有除去复杂食品基质中多种杂质的作用：PSA除去脂类、C18除去蛋白质、GCB除去色素、硫酸镁除去水分。实验结果表明，食品和呕吐物中的干扰杂质大部分已经除去，保证了实验的回收率。针头过滤器的滤膜会吸附待测物，特别是极性小的杀鼠剂，如溴敌隆和氟鼠灵，因此本发明所有操作过程均不使用针头过滤而改用高速离心的方法。

样品检测：

色谱-质谱条件：

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters公司)，配在线过滤器；流动相A为5mmol/L乙酸铵，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序:0～3.0min，流动相由40％B线性梯度至90％B，保持2min后，流动相又回到40％B，并平衡2min；流速0.2mL/min；柱温40℃；进样体积5μL。复合电喷雾离子源，正、负离子同时多反应监测(MRM)模式。ESI毛细管电压3.0kV；离子源温度120℃；锥孔反吹气流量50L/h，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气流量500L/h。

质谱条件的优化：

分别在电喷雾正、负离子检测方式下对16种农药和鼠药的质谱测定条件进行优化，使样液中各目标化合物的分子离子对信号达到最大。大多数农药在ESI正离子模式下有最大的离子化效率，大多数鼠药在ESI负离子下具有最大的离子化效率，为了兼顾2类化合物的特点，本仪器采用复合离子源，可以实现一次进样同时分析正、负离子，减少了实验的重复工作。按照欧盟要求，每个化合物定性分析需要4个识别点，选择两对分子离子对，设定合适的峰驻留时间(Dwell time)，确保色谱峰的采样点数在15～20点，从而得到较好的定量重复性。优化后的测定条件见表1。

色谱条件的优化：

以UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)为分析柱，分别采用乙酸铵-甲醇和乙酸铵-乙腈系统作为流动相。综合考虑各化合物的出峰速度和峰形，决定采用乙酸铵-甲醇体系作为流动相。本发明采用5mmol/L乙酸铵-甲醇系统为流动相，既有足够的灵敏度，又使各目标化合物得到较好分离，同时又能得到良好的峰型，一次进样分析仅需7min。

定性与定量方法：

定性：每个化合物选出2对离子，其中1对为定性离子，当样品中存在可疑目标物时，需要将保留时间与定性离子的比例和标准品进行对照，如果一致，则判断为阳性。

定量：每个化合物选出1对丰度大的离子对做为定量离子，软件将根据定量离子的峰面积来计算对应的目标物浓度。

表1质谱MRM参数

方法的线性范围和检出限

在选定的色谱条件和质谱条件下对基质标准系列溶液进行测定，各农药和鼠药的MRM质谱图详见附图，以定量离子对的峰面积对浓度作图，四种样品基质中目标化合物的相关系数在0.990～0.999之间，符合线性关系的要求。采用空白样品添加低浓度的混合标准液，进行样品前处理，然后上机测定，以定量离子对3倍信噪比的响应值对应的样品浓度作为检出限(LOD)，结果见表2。四种基质中安妥的检出限为1μg/L，其余目标物的检出限都在0.1～0.5μg/L之间，均明显低于各目标物的致毒浓度，能够满足公共卫生突发事件和临床毒物学检测的要求。

表2方法的线性范围和检出限(血清)

表3方法的线性范围和检出限(尿液)

表4方法的线性范围和检出限(食物)

表5方法的线性范围和检出限(呕吐物)

方法的精密度和加标回收率

分别在四种空白样品基质中加入1ug/L、10ug/L、50ug/L三个浓度的混合标准储备液(每个浓度制作6份平行样品。)制成加标样品，按照样品预处理的方法进行处理，上机检测，计算加标回收率和日内相对标准偏差(RSD)，结果见表6-7。血清和尿液中目标化合物的加标回收率分别在72.3％～123％和65％～120％之间，相对标准偏差为1.13％～12.5％和1.03％～12.0％。食物和呕吐物中目标化合物的加标回收率分别在43.3％～153％和90％～121％之间，相对标准偏差为0.39％～11.9％和0.93％～11.2％。其中食品样品中1μg/L加标的安妥和50μg/L加标的溴敌隆的加标回收率分别为153％和43.3％。基本符合中毒检测要求。

表6血清和尿液样品的加标回收和精密度实验(n＝6)

表7食物和呕吐物样品的加标回收和精密度实验(n＝6)

Claims

1.一种农药和鼠药的检测方法，步骤包括：

A、样品预处理；

所述样品为血清、尿液、食物、呕吐物中的一种或几种；

所述血清的预处理方法为：将体积比为1:5的血清和乙腈加入离心管中，涡旋震荡混匀后离心分离，取上层清液于温水浴中用氮气吹干，加入甲醇定容备用；

所述尿液的预处理方法为：将体积比为1:5的尿液和乙酸乙酯加入离心管中，涡旋震荡混匀后离心分离，将乙酸乙酯提取液吸出后，再按相同的方法重复提取一次，合并乙酸乙酯提取液于温水浴中用氮气吹干，加入甲醇定容备用；

所述食物的预处理方法为：将质量比为2:5的食物和无水硫酸钠以及与食物质量体积比g/mL为1:5的乙腈、Quechers萃取包加入离心管中，涡旋震荡混匀后离心分离，取上层清液于温水浴中用氮气吹干，加入甲醇定容备用；

所述呕吐物的预处理方法为：将质量比为1:5的呕吐物和无水硫酸钠以及与食物质量体积比g/mL为1:5的乙腈、Quechers萃取包加入离心管中，涡旋震荡混匀后离心分离，取上层清液于温水浴中用氮气吹干，加入甲醇定容备用；

B、用超高效液相色谱-串联质谱法进行检测；

所述步骤B中色谱条件为：以UPLC BEH C18色谱柱为分析柱，流动相A为5mmol/L乙酸铵，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序:0～3.0min，流动相由40％B线性梯度至90％B，保持2min后，流动相又回到40％B，并平衡2min；流速0.2mL/min；柱温40℃；进样体积5μL；

所述步骤B中质谱条件为：复合电喷雾离子源，正、负离子同时多反应监测模式；ESI毛细管电压3.0kV；离子源温度120℃；锥孔反吹气流量50L/h，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气流量500L/h；

所述Quechers萃取包的成分及质量比为PSA:C18:GCB:MgSO₄＝80:80:9:30；

所述食物的预处理方法中Quechers萃取包与食物的质量比为1:2.01；所述呕吐物的预处理方法中Quechers萃取包与食物的质量比为1:2.01；

所述农药包括甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果、对硫磷、氯唑磷、三唑磷、甲基毒死蜱、马拉硫磷和伏杀磷；

所述鼠药包括安妥、克鼠灵、杀鼠灵、氯灭鼠灵、溴鼠灵、溴敌隆和氟鼠灵。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述水浴温度为45-55℃。