CN110749691A - 一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的hplc-ms/ms方法 - Google Patents

一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的hplc-ms/ms方法 Download PDF

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刘希凤
徐衍胜
高金明
杨艳
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Abstract

本发明提出了一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC‑MS/MS方法，包括如下步骤:配制标准品工作液；婴幼儿辅助食品样品的处理；将标准品工作液和婴幼儿辅助食品待测样品分别用HPLC‑MS/MS进行检测，分别得到色谱图和质谱图；对得到的色谱图和质谱图进行处理，对八种黄曲霉毒素及其同系物进行定性、定量检测，分别得到婴幼儿辅助食品待测样品的中八种黄曲霉毒素及其同系物质量浓度，然后计算得到婴幼儿辅助食品待测样品中八种黄曲霉毒素及其同系物的含量。本发明适用全面，灵敏度高，简便快速，只需流程化浓缩净化即可对婴幼儿食品中的八种黄曲霉毒素及其同系物同时定性定量分析。

Description

一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC- MS/MS方法
技术领域
本发明涉及真菌毒素测定技术领域，尤其是涉及一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC-MS/MS方法。
背景技术
黄曲霉毒素是一类含有二氢呋喃香豆素化学结构相似的化合物，属于真菌毒素，是由寄生曲霉菌、黄曲霉菌和毛曲霉等在特殊环境下产生的次级代谢产物。寄生曲霉菌和黄曲霉菌广泛的存在于自然界和农作物上，在阴暗潮湿条件下很容易生长产生黄曲霉毒素，文章报道已发现的黄曲霉毒素有20种，其中AFB1是众所周知化学物质中致癌性最强的一种，AFM1是AFB1的羟基化代谢物，存在于被污染的牛奶、奶粉甚至母乳中，毒性略低于前者，但仍然是砒霜的40倍，氰化钾的5倍。标准GB 2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定，婴幼儿辅助食品中AFB1和AFM1均不得超过0.5 μg·kg-1。只要具有二氢呋喃香豆素化学结构的黄曲霉毒素类似物都有毒性，我国目前主要监管食品中AFB1和AFM1，则不能对黄曲霉毒素的危害进行综合评估，而其它黄曲霉毒素AFB2、AFG1、AFG2、AFB2代谢物AFM2，以及黄曲霉毒素合成的前体MST、ST都具有类似结构，对人类毒性及致癌性极强，例如ST属于2B类致癌物质，与肝癌和肺癌密切相关。婴幼儿辅助食品主要原料是米粉、低筋面粉、玉米淀粉、奶粉、蛋清、牛奶和黄油，以及少量的水果和色素等，若原材料受到黄曲霉毒素污染，由于其化学性质稳定不易分解，则婴幼儿辅助食品中也会污染毒素。耿建强等课题组在2015-2016年间采集141份市售婴幼儿营养米粉, 黄曲霉毒素B1检出9份，检出率为6.4%，含量范围在0. 11- 0. 25 μg/kg之间。2017年，国家食药总局组织抽检6类食品412批次样品，其中一款婴幼儿谷物辅助食品中黄曲霉毒素B1检出值为0.8μg/kg，比标准规定(不超过0.5μg/k g)高出60%，充分说明污染AFB1的农作物或食品中同样存在毒素ST和MST的风险。婴幼儿属于特殊敏感群体，食用受黄曲霉毒素污染的食品会造成不可逆的伤害，因此有必要建立全面的黄曲霉毒素检测方法，从而使婴幼儿真正减少食用黄曲霉毒素及其同系物的风险，创造一个更加安全的婴幼儿食品环境。
目前，现有技术检测食品常采用酶联免疫法和高效液相色谱法，酶联免疫法属于快速筛查检测方法，前处理方法简单、半小时内就能出检测结果，但易受基质干扰出现假阳性，对于多种毒素同时检测方法不成熟。高效液相色谱法的准确度和稳定性要优于酶联免疫法，但在检测同类性质相近化合物时分析困难，对于保留时间相近的化合物容易带来误判，同时处理通量受到限制，灵敏度低。
发明内容
本发明提出一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC-MS/MS方法，该方法适用全面，灵敏度高，简便快速，只需流程化浓缩净化即可对婴幼儿食品中的八种黄曲霉毒素及其同系物同时定性定量分析，特别适合婴幼儿辅助食品生产企业及政府相关监管部门使用。
本发明的技术方案是这样实现的：一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC-MS/MS方法，包括如下步骤:
S1、配制标准品工作液；
用天平分别称取适量AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、MST、ST标准品，用乙腈定容到50 mL(100mg/L) ，得到标准品储备液：-20℃保存；分别取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、MST、ST、AFM1、AFM2标准品储备液各1mL到容量瓶，用乙腈定容到100mL(1 mg/L) ，4℃保存,得到标准品中间液；用甲醇-水（45:55, V:V）混合溶液系列稀释混合标准品中间液，得到标准品工作液；
S2、婴幼儿辅助食品样品的处理；
用研磨仪将样品粉碎，混匀，准确称取6±0.01 g样品于50 mL的具塞离心管内；加入20mL乙腈-水-乙酸涡混震荡2 min，乙腈-水-乙酸的体积比为89:10:1,在4℃冷冻下,以5 000rpm离心10 min，转移各离心管上清液10 mL到20 mL洁净玻璃管中，用氮气吹干；加入50 mgODS、30 mg PSA和30 mg NH2，用1 mL初始流动相溶液溶解，涡旋振荡1min，静置分层后，用注射器吸取并经0.22 μm滤膜过滤，得到婴幼儿辅助食品待测样品；
S3、将步骤S1得到的标准品工作液和S2得到的婴幼儿辅助食品待测样品分别用HPLC-MS/MS进行检测，分别得到色谱图和质谱图；其中：
色谱条件为：
色谱柱：岛津AQ-C18，HP：2.1 mm×100 mm，3.0 μm；
柱温箱温度：35℃；
流动相A：水-甲酸（999:1）+5 mmol/L乙酸铵；
流动相B：甲醇；
洗脱程序：0 ~ 3.0 min，45% ~ 95% B；3.0 ~3.1 min，95% B；3.1 ~ 5.0 min，95% ~45% B；5.0 ~ 6.5 min，45% B；
流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL；
质谱条件为：
MRM扫描模式：正离子扫描模式（ESI+）；
碰撞气：氩气；加热气：空气；干燥气：氮气；雾化气：氮气；干燥气流量：10 L/min；雾化气流量：3 L/min；加热气流量：10 L/min；加热块温度：400 ℃；DL温度：250 ℃；接口温度：300 ℃；接口电压4 kv；
Q1和Q3分辨率为unit；
最大扫描速度：30000 u/sec；
S4、对步骤S3得到的色谱图和质谱图进行处理，对八种黄曲霉毒素及其同系物进行定性、定量检测，分别得到婴幼儿辅助食品待测样品的中八种黄曲霉毒素及其同系物质量浓度，然后计算得到婴幼儿辅助食品待测样品中八种黄曲霉毒素及其同系物的含量。
作为一种优选的技术方案，步骤S3中，质谱条件的优化方法为：先确定八种黄曲霉毒素及其同系物的产物离子范围，分别将各自毒素标准品1 mg/L放入进样瓶，用双通代替色谱柱，流动相等度洗脱，甲醇:水的体积比为1:1，自动进样器1 μL进样；在正离子模式扫描下通过前体离子扫描，先找到各个目标化合物的前体离子，进一步扫描确定各个目标化合物响应值最高的两个产物离子；通过各自目标物确定的前体离子和产物离子对选择多反应监测模式优化电压，随着设置电压从低到高不断增加，选择色谱图中最高丰度子离子的电压作为最适电压，并根据产物离子最高丰度分别确定为定量离子和定性离子，再确定电压的基础上继续优化前体离子和产物离子，通过两轮的优化，建立最佳的前体离子/产物离子对和电压。
作为一种优选的技术方案，步骤S3中，八种黄曲霉毒素及其同系物质谱条件见下表：
No. 化合物 前体离子(m/z) 产物离子(m/z) 保留时间 (min) 电压 （eV）
1 AFB<sub>1</sub> 313.0 241.0<sup>*</sup>, 285.0 2.89 -38, -24
2 AFB<sub>2</sub> 315.0 259.0<sup>*</sup>, 287.0 3.15 -30, -27
3 AFG<sub>1</sub> 329.0 243.0<sup>*</sup>, 283.0 3.12 -29, -25
4 AFG<sub>2</sub> 331.0 245.0<sup>*</sup>, 257.0 2.73 -31, -31
5 MST 339.1 306.1<sup>*</sup>, 295.1 3.36 -29, -31
6 ST 325.0 310.1<sup>*</sup>, 281.1 2.59 -25, -36
7 AFM<sub>1</sub> 329.0 273.0<sup>*</sup>, 229.0 2.18 -25, -43
8 AFM<sub>2</sub> 331.0 259.0<sup>*</sup>, 273.0 1.21 -26, -25
采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：本发明建立了一种全新的测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC-MS/MS方法，婴幼儿辅助食品经乙腈-水-乙酸（89:10:1）溶液提取以及净化后，以甲醇与甲酸-水（1:999, V/V）+5 mmol/L乙酸铵溶液为流动相梯度稀释，经AQ-C18，HP（2.1 mm×100 mm，3.0 μm）分离，以多级反应监测（MRM），正离子模式扫描分析。结果表明，八种黄曲霉毒素及其同系物标准曲线在0.15~50 μg·L-1范围内线性良好，相关系数均大于0.996。样品在定量下限、两倍、十倍三个加标浓度下八种毒素的平均回收率在76.3%~95.9%之间，相对标准偏差（RSD）在3.1%~11.5%之间。该测定方法具有快速、经济、灵敏度高、实用性强等优点，能够同时实现对八种毒素的定性、定量检测，可用于婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的检测分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明八种黄曲霉毒素及其同系物混合标准溶液的叠加色谱图。
图2为本发明提取试剂对八种黄曲霉毒素及其同系物回收率的影响图。
图3为本发明不同比例乙腈-水对回收率的影响图。
图4 为本发明样品经前处理净化前（a）与净化后（b）的质谱扫描图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC-MS/MS方法，包括如下步骤:
步骤一、配制标准品工作液；
用天平分别称取适量AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、MST、ST标准品，用乙腈定容到50 mL(100mg/L) ，得到标准品储备液：-20℃保存；分别取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、MST、ST、AFM1、AFM2标准品储备液各1mL到容量瓶，用乙腈定容到100mL(1 mg/L) ，4℃保存,得到标准品中间液；用甲醇-水（45:55, V:V）混合溶液系列稀释混合标准品中间液，得到标准品工作液。
步骤二、婴幼儿辅助食品样品的处理；
用研磨仪将样品粉碎，混匀，准确称取6±0.01 g样品于50 mL的具塞离心管内；加入20mL乙腈-水-乙酸涡混震荡2 min，乙腈-水-乙酸的体积比为89:10:1,在4℃冷冻下,以5 000rpm离心10 min，转移各离心管上清液10 mL到20 mL洁净玻璃管中，用氮气吹干；加入50 mgODS、30 mg PSA和30 mg NH2，用1 mL初始流动相溶液溶解，涡旋振荡1min，静置分层后，用注射器吸取并经0.22 μm滤膜过滤，得到婴幼儿辅助食品待测样品。
步骤三、将步骤S1得到的标准品工作液和S2得到的婴幼儿辅助食品待测样品分别用HPLC-MS/MS进行检测，分别得到色谱图和质谱图。
步骤四、对步骤S3得到的色谱图和质谱图进行处理，对八种黄曲霉毒素及其同系物进行定性、定量检测，分别得到婴幼儿辅助食品待测样品的中八种黄曲霉毒素及其同系物质量浓度，然后计算得到婴幼儿辅助食品待测样品中八种黄曲霉毒素及其同系物的含量。
作为一种优选的技术方案，步骤S3中，质谱条件的优化方法为：先确定八种黄曲霉毒素及其同系物的产物离子范围，分别将各自毒素标准品1 mg/L放入进样瓶，用双通代替色谱柱，流动相等度洗脱，甲醇:水的体积比为1:1，自动进样器1 μL进样；在正离子模式扫描下通过前体离子扫描，先找到各个目标化合物的前体离子，进一步扫描确定各个目标化合物响应值最高的两个产物离子；通过各自目标物确定的前体离子和产物离子对选择多反应监测模式优化电压，随着设置电压从低到高不断增加，选择色谱图中最高丰度子离子的电压作为最适电压，并根据产物离子最高丰度分别确定为定量离子和定性离子，再确定电压的基础上继续优化前体离子和产物离子，通过两轮的优化，建立最佳的前体离子/产物离子对和电压。
下面对本测定方法进行实验。
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱质谱仪：LCMS-8045（日本岛津公司），配电喷雾离子源（ESI）；KH19A型离心机（湖南凯达科学仪器公司）；ZX-DC氮吹仪（北京众信佳仪科技公司）；Milli-Q纯水机（美国密理博公司）；KQ3200DA超声波清洗器（上海市百典仪器公司）；GM300研磨仪（德国莱驰公司）；MS3涡混振荡器（德国艾卡公司）；ML-T分析天平（瑞士梅特勒公司）。
黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)均购于北京坛墨质检科技公司。黄曲霉毒素M1(AFM1, 100 μg/mL)、黄曲霉毒素M2(AFM2, 100 μg/mL)、O-甲基柄曲霉素（MST）、柄曲霉素（ST）购于美国Sigma公司。中性氧化铝（Alumina-N）购于上海上海阿拉丁生化科技公司，C18（ODS）、PSA粉、石墨炭黑粉（GCB）和氨丙基粉（NH2）购于美国安捷伦公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲酸均为色谱纯，购于美国默克公司；实验用水为超纯水。
标准品储备液：用天平分别称取适量AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、MST、ST标准品，用乙腈定容到50 mL(100 mg/L) ，-20℃保存。
混合标准品中间液：分别取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、MST、ST、AFM1、AFM2标准品储备液各1mL到容量瓶，用乙腈定容到100mL(1 mg/L) ，4℃保存。
混合标准品工作液：用甲醇-水（45:55, V:V）混合溶液系列稀释混合标准品中间液，现用现配。
色谱条件
色谱柱：岛津AQ-C18，HP（2.1 mm×100 mm，3.0 μm）；柱温箱温度：35℃；流动相A：水-甲酸（999:1）+5 mmol/L乙酸铵；流动相B：甲醇；洗脱程序：0 ~ 3.0 min，45% ~ 95% B；3.0~3.1 min，95% B；3.1 ~ 5.0 min，95% ~ 45% B；5.0 ~ 6.5 min，45% B；流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL。
质谱条件
MRM扫描模式：正离子扫描模式（ESI+）；碰撞气：氩气；加热气：空气；干燥气：氮气；雾化器：氮气；干燥气流量：10 L/min；雾化气流量：3 L/min；加热气流量：10 L/min；加热块温度：400 ℃；DL温度：250 ℃；接口温度：300 ℃；接口电压4 kv；Q1和Q3分辨率为unit；最大扫描速度：30000 u/sec。八种黄曲霉毒素及其同系物质谱条件见表1。
表1 八种黄曲霉毒素及其同系物的质谱条件
No. 化合物 前体离子(m/z) 产物离子(m/z) 保留时间 (min) 碰撞能量 （eV）
1 AFB<sub>1</sub> 313.0 241.0<sup>*</sup>, 285.0 2.89 -38, -24
2 AFB<sub>2</sub> 315.0 259.0<sup>*</sup>, 287.0 3.15 -30, -27
3 AFG<sub>1</sub> 329.0 243.0<sup>*</sup>, 283.0 3.12 -29, -25
4 AFG<sub>2</sub> 331.0 245.0<sup>*</sup>, 257.0 2.73 -31, -31
5 MST 339.1 306.1<sup>*</sup>, 295.1 3.36 -29, -31
6 ST 325.0 310.1<sup>*</sup>, 281.1 2.59 -25, -36
7 AFM<sub>1</sub> 329.0 273.0<sup>*</sup>, 229.0 2.18 -25, -43
8 AFM<sub>2</sub> 331.0 259.0<sup>*</sup>, 273.0 1.21 -26, -25
1.4 样品处理
用研磨仪将样品粉碎，混匀，准确称取6±0.01 g样品于50 mL具塞离心管内，加入20mL乙腈-水-乙酸（89:10:1, V/V/V）涡混震荡2 min，以5 000 rpm冷冻（4℃）离心10 min，转移各离心管上清液10 mL到20 mL洁净玻璃管中，氮气吹干，加入50 mg ODS、30 mg PSA和30mg NH2，用1 mL初始流动相溶液溶解，涡旋振荡1min，静置分层后，用注射器吸取经0.22 μm滤膜过滤，供HPLC-MS/MS检测分析。
色谱柱的选择
对于多种黄曲霉毒素同系物的同时检测，由于化合物之间结构式类似，化学性质相近，如AFG1和AFM1是同分异构体，前体离子相同，AFG2和AFM2同样前体离子相同，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2四种的前体离子和产物离子比较接近，对分离度提出较高要求，因此色谱柱的选择非常关键。粒径5 μm长度250 mm的色谱柱属于常压色谱柱，若在质谱检测时使用色谱柱后流动相需要分流，只能部分流动相进入质谱，否则进入液体过多会损坏质谱设备；检测周期长，黄曲霉毒素及其同系物虽然毒性大但在自然界的含量很低，不需要色谱柱有过高的载样量，因此选择小的内径可以进一步提高柱效。考虑到同等条件下色谱柱的粒径越大相对压力越小，对复杂基质的抗噪性越强，使用寿命越长，最终选择了AQ-C18 HP色谱柱进行分离。
质谱条件的优化
先确定八种黄曲霉毒素及其同系物的产物离子范围，分别将各自毒素标准品(1 mg/L)）放入进样瓶，用双通代替色谱柱，流动相等度洗脱（甲醇:水=1:1，V:V），自动进样器1 μL进样。在正离子模式扫描下通过前体离子扫描，先找到各个目标化合物的前体离子，进一步扫描确定各个目标化合物响应值最高的两个碎片离子（产物离子）。通过各自目标物确定的前体离子和产物离子对选择多反应监测模式优化电压（碰撞能量），随着设置电压从低到高不断增加，选择色谱图中最高丰度子离子的电压作为最适电压，并根据产物离子最高丰度分别确定为定量离子和定性离子，再确定电压的基础上继续优化前体离子和产物离子，通过两轮的优化，建立最佳的前体离子/产物离子对和电压。通过步骤2.1和步骤2.2操作，可以实现8中黄曲霉毒素及其同系物在色谱柱良好分离，仪器响应值高，具体参数见表1，混合标准溶液（0.50 μg/L）的提取粒子流色谱图见图1。其中：
1. AFM2; 2. AFM1; 3. ST; 4. AFG2; 5. AFB1; 6. AFG1; 7. AFB2; 8. MST。
色谱条件的优化
由于八种毒素质荷比在313~339之间，排除色谱柱因素，试验还可以通过改变流动相的条件、比例、柱温箱温度来提高目标物的分离度、响应值，同时还可以通过添加甲酸、甲酸铵和乙酸铵等到流动相中来提高目标物质谱离子化效率及其峰型。首先试验了甲醇-水和乙腈-水两种流动相体系八种毒素的分离效果、色谱响应强度，试验发现甲醇-水流动相体系比乙腈-水体系目标物分离度更好，色谱峰整体响应强度高40%。进一步试验了在流动相水相中添加甲酸、甲酸铵和乙酸铵对八种毒素响应值的影响，试验发现在水相中添加甲酸可以显著提高目标分析物的响应值，推测在质谱正离子监测模式下八种黄曲霉毒素及其同系物在微酸环境下离子化效率更高，而甲酸铵和乙酸铵对目标分析物信号强度影响不大，但使色谱峰的峰型得到了改善。通过样品加标的方式检测，乙酸铵在基质检测中的稳定性要好于甲酸铵，同时对甲酸和乙酸铵的添加比例进行不同的组合验证，经多次试验最终确定了“1.2”中甲醇:水-甲酸（999:1）+5 mmol/L乙酸铵作为流动相，方法基线平稳，各目标分析物响应值高，峰型好。
提取溶液的选择
目前，食品中的黄曲霉毒素的提取溶液主要是甲醇、乙腈、或两者与水不同比例组合的混合溶液。提取溶液是回收率高低的关键因素，通过在婴幼儿辅助食品中加八种黄曲霉毒素及其同系物混标（均为10 μg/kg）的方式，先比较了甲醇、甲醇-水（8:2, v/v）、乙腈和乙腈-水（8:2, v/v）四种提取试剂对八种毒素回收率的影响，结果表明使用乙腈-水作为提取液八种黄曲霉毒素及其同系物的回收率在50%-75%之间，回收率最好，结果见图2。确定乙腈-水为提取溶液后，试验了乙腈-水（8:1, v/v）、乙腈-水（8:2, v/v）、乙腈-水（8:3, v/v）、乙腈-水（8:4, v/v）四种混合比例对回收率的影响，试验结果发现乙腈-水（8:1, v/v）回收率最高，分析认为少量水的加入有利于乙腈和样品的浸润和溶解，但较多的水不利于样品中毒素的提取分离，更重要的是乙腈-水中水的比例过大造成氮吹浓缩时间延长，不容易吹干，方法不可取。黄曲霉毒素在碱性条件下容易分解，实验进一步考察了在提取溶液中添加0%、1%、2%和3%乙酸对八种毒素回收率的影响，数据显示添加乙酸显著提高了各个毒素的回收率，八种黄曲霉毒素及其同系物收率均达到80%以上，但添加1%、2%和3%乙酸三种比例对回收率影响不显著，最终确定提取溶液为乙腈-水-乙酸（89:10:1）。
净化方式的选择
婴幼儿辅助食品营养丰富，蛋白质、氨基酸和糖类含量高，还添加有天然或人工色素等，基质复杂，都会对八种目标分析物的痕量分析带来干扰，影响检测方法的灵敏度。本实施例同时试验了5种净化粉Alumina-N，GCB，ODS，PSA，NH2 在乙腈提取溶液中对八种毒素及其同系物的吸附回收率，具体结果见表2。试验发现，ODS、PSA、NH2对八种黄曲霉毒素及其同系物的吸附影响较小，回收率都在90.4%以上。Alumina-N对八种毒素有一定的吸附，GCB对八种毒素有严重的吸附，通过试剂研究发现，Alumina-N和GCB粉对含氮、磷、硫基的杂环类物质，芳香烃等化合物吸附能力较强，而八种毒素都是杂环类化合物，因此和本实验提高回收率目的冲突，两种净化剂都不能使用。ODS吸附非极性干扰物如脂肪和酯类效果较好；PSA可以吸附多种有机酸、色素和部分脂肪酸和糖类；类似于GCB，也可以吸附清除甾体和叶绿素等，分子量越小效果越好；NH2可以吸附清除甾体和叶绿素等，三者的结合使用可以很好的降低婴幼儿辅助食品中基质的干扰，通过进一步的组合实验，最终确定了步骤1.4的净化添加比例，节省了检测成本，并达到最佳的净化效果，婴幼儿辅助食品空白样品经本文方法净化的前后效果图见图4。
表2 经ODS，Alumina-N，GCB，PSA，NH2吸附后八种黄曲霉毒素及其同系物的回收率(%)
No. 化合物 ODS Alumina-N GCB PSA NH<sub>2</sub>
1 AFB<sub>1</sub> 95.7 62.0 3.4 92.7 100.1
2 AFB<sub>2</sub> 99.2 58.7 2.9 94.4 94.8
3 AFG<sub>1</sub> 102.3 62.5 1.1 83.2 95.2
4 AFG<sub>2</sub> 104.0 71.2 10.7 100.6 99.7
5 MST 101.2 45.9 11.3 94.9 99.7
6 ST 99.7 59.6 7.2 98.7 96.5
7 AFM<sub>1</sub> 95.4 45.3 12.3 106.2 90.4
8 AFM<sub>2</sub> 97.5 42.1 10.6 101.5 91.9
2.6 线性关系、检出限与定量下限
取八种黄曲霉毒素及其同系物的混合标准品中间液，用空白婴儿饼干提取基质系列稀释，经质谱检测测定，以各毒素响应值的峰面积平均值（Y）为纵坐标，各毒素相对应的质量浓度 (X，μg·kg-1)为横坐标制定标准曲线，八种黄曲霉毒素及其同系物的线性范围在0.15-50 μg·L-1之间相关系数（r）均大于0.996。在婴幼儿辅助食品基质中加入混合标准物质系列，以3倍的信噪比（S/N）确定为方法检测限（LOD），以10倍信噪比（S/N）确定为定量下限（LOQ），八种黄曲霉毒素及其同系物的LOD范围在0.05~0.10 μg·kg-1之间，LOQ在0.15~0.30 μg·kg-1之间，其回归方程、r值、线性范围、LOD和LOQ具体结果见表3。
表3 八种黄曲霉毒素及其同系物的回归方程、r值、线性范围、检出限与定量下限（n=6）
Figure 383064DEST_PATH_IMAGE002
2.7 准确度与精密度
在婴儿饼干空白样品中添加八种黄曲霉毒素及其同系物定量下限、两倍定量下限、十倍定量下限3个水平的混合标准品溶液，按1.4样品前处理步骤，进行加标回收实验验证方法的有效性。方法的准确度用回收率表示，精密度用相对标准偏差（RSD）表示，每个样品做6个平行，取其平均值。结果表明，八种黄曲霉毒素及其同系物在3个加标水平下的平均回收率为76.3%~95.9%，相对标准偏差（RSD）为3.1%~11.5%，完全满足GB/T 27404-2008 附录F中回收率和精密度的要求，测定结果见表四。
表4 八种黄曲霉毒素及其同系物在样品中的平均回收率及精密度（n=6）
Figure 756276DEST_PATH_IMAGE004
2.8 样品测定
从市场上购买20份婴幼儿辅助食品，用本实施例建立的方法检测八种黄曲霉毒素及其同系物残留，在1份棒棒饼干（牛奶味）样品中检出AFB1、MST和ST，其中AFB1检测含量为0.55μg·kg-1，ST检测含量为1.46 μg·kg-1，MST检测含量为3.10 μg·kg-1，检测结果为：AFB1超过国家标准GB2761-2017限量要求（0.5 μg·kg-1）。
本发明能够同时实现对八种毒素的定性、定量检测。该检测方法具有快速、经济、灵敏度高、实用性强等优点，完全可以胜任对婴幼儿辅助食品中八种黄曲霉毒素及其同系物残留的检测要求，对婴幼儿辅助食品安全性检测具有深远意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，包括如下步骤:
S1、配制标准品工作液；
用天平分别称取适量AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、MST、ST标准品，用乙腈定容到50 mL(100mg/L) ，得到标准品储备液：-20℃保存；分别取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、MST、ST、AFM1、AFM2标准品储备液各1mL到容量瓶，用乙腈定容到100mL(1 mg/L) ，4℃保存,得到标准品中间液；用甲醇-水（45:55, V:V）混合溶液系列稀释混合标准品中间液，得到标准品工作液；
S2、婴幼儿辅助食品样品的处理；
用研磨仪将样品粉碎，混匀，准确称取6±0.01 g样品于50 mL的具塞离心管内；加入20mL乙腈-水-乙酸涡混震荡2 min，乙腈-水-乙酸的体积比为89:10:1,在4℃冷冻下,以5 000rpm离心10 min，转移各离心管上清液10 mL到20 mL洁净玻璃管中，用氮气吹干；加入50 mgODS、30 mg PSA和30 mg NH2，用1 mL初始流动相溶液溶解，涡旋振荡1min，静置分层后，用注射器吸取并经0.22 μm滤膜过滤，得到婴幼儿辅助食品待测样品；
S3、将步骤S1得到的标准品工作液和S2得到的婴幼儿辅助食品待测样品分别用HPLC-MS/MS进行检测，分别得到色谱图和质谱图；其中：
色谱条件为：
色谱柱：岛津AQ-C18，HP：2.1 mm×100 mm，3.0 μm；
柱温箱温度：35℃；
流动相A：水-甲酸（999:1）+5 mmol/L乙酸铵；
流动相B：甲醇；
洗脱程序：0 ~ 3.0 min，45% ~ 95% B；3.0 ~3.1 min，95% B；3.1 ~ 5.0 min，95% ~45% B；5.0 ~ 6.5 min，45% B；
流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL；
质谱条件为：
MRM扫描模式：正离子扫描模式（ESI+）；
碰撞气：氩气；加热气：空气；干燥气：氮气；雾化气：氮气；干燥气流量：10 L/min；雾化气流量：3 L/min；加热气流量：10 L/min；加热块温度：400 ℃；DL温度：250 ℃；接口温度：300 ℃；接口电压4 kv；
Q1和Q3分辨率为unit；
最大扫描速度：30000 u/sec；
S4、对步骤S3得到的色谱图和质谱图进行处理，对八种黄曲霉毒素及其同系物进行定性、定量检测，分别得到婴幼儿辅助食品待测样品的中八种黄曲霉毒素及其同系物质量浓度，然后计算得到婴幼儿辅助食品待测样品中八种黄曲霉毒素及其同系物的含量。
2.如权利要求1所述的一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，步骤S3中，质谱条件的优化方法为：先确定八种黄曲霉毒素及其同系物的产物离子范围，分别将各自毒素标准品1 mg/L放入进样瓶，用双通代替色谱柱，流动相等度洗脱，甲醇:水的体积比为1:1，自动进样器1 μL进样；在正离子模式扫描下通过前体离子扫描，先找到各个目标化合物的前体离子，进一步扫描确定各个目标化合物响应值最高的两个产物离子；通过各自目标物确定的前体离子和产物离子对选择多反应监测模式优化电压，随着设置电压从低到高不断增加，选择色谱图中最高丰度子离子的电压作为最适电压，并根据产物离子最高丰度分别确定为定量离子和定性离子，再确定电压的基础上继续优化前体离子和产物离子，通过两轮的优化，建立最佳的前体离子/产物离子对和电压。
3.如权利要求1所述的一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，步骤S3中，八种黄曲霉毒素及其同系物质谱条件见下表：
No. 化合物 前体离子(m/z) 产物离子(m/z) 保留时间 (min) 电压 （eV） 1 AFB<sub>1</sub> 313.0 241.0<sup>*</sup>, 285.0 2.89 -38, -24 2 AFB<sub>2</sub> 315.0 259.0<sup>*</sup>, 287.0 3.15 -30, -27 3 AFG<sub>1</sub> 329.0 243.0<sup>*</sup>, 283.0 3.12 -29, -25 4 AFG<sub>2</sub> 331.0 245.0<sup>*</sup>, 257.0 2.73 -31, -31 5 MST 339.1 306.1<sup>*</sup>, 295.1 3.36 -29, -31 6 ST 325.0 310.1<sup>*</sup>, 281.1 2.59 -25, -36 7 AFM<sub>1</sub> 329.0 273.0<sup>*</sup>, 229.0 2.18 -25, -43 8 AFM<sub>2</sub> 331.0 259.0<sup>*</sup>, 273.0 1.21 -26, -25
。
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