CN109781889A - 一种婴幼儿营养米粉中的24种真菌毒素的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种婴幼儿营养米粉中的24种真菌毒素的测定方法，涉及的目标化合物有黄曲霉毒素类、镰刀菌烯醇类、伏马毒素类、赭曲霉毒素类、T‑2毒素及HT‑2毒素、玉米赤霉烯酮及其衍生物、杂色曲霉素和O‑甲基杂色曲霉素。该方法采用在米粉中加入乙腈、甲酸、水的混合提取剂，再依次加入MgSO₄、醋酸钠复合盐包将目标物富集至有机层后，采用PRIME HLB净化后氮吹近干，复溶后过膜，超高效液相色谱‑串联质谱仪进行检测分析。本发明提供的方法，前处理简单经济、省时省力，方法灵敏度高、检出限低、回收率好、通量高、基质效应低，适用于婴幼儿营养米粉中真菌毒素的高通量检测。

Description

一种婴幼儿营养米粉中的24种真菌毒素的测定方法

技术领域

本发明属于食品分析技术领域，涉及一种婴幼儿营养米粉中24种真菌毒素的测定方法，具体涉及基于QuEChERS净化技术-超高效液相色谱串联质谱法测定婴幼儿营养米粉中的24种真菌毒素的方法。

背景技术

真菌毒素(mycotoxins)是广泛存在于谷物及其制品中的一类生物毒素，是真菌产生的一类有毒次生代谢产物。由于真菌毒素的毒性差别较大，所以作用的靶器官也不同。轻微真菌毒素中毒可导致恶心，呕吐，头晕，腹泻等，严重的导致肝肾衰竭，甚至死亡。不同的真菌毒素产毒基质也不同，而且常存在于多种基质中。如玉米常受玉米赤霉烯酮、伏马菌素、黄曲霉毒素、呕吐毒素多种真菌毒素污染；小麦常受呕吐毒素、杂色曲霉毒素等多种毒素污染。

婴幼儿营养米粉是6月龄以上婴儿和幼儿食用的主要婴幼儿谷类辅助食品。 GB10769-2010《婴幼儿谷类辅助食品》规定此类食品的原料不仅可以采用一种谷物而且可以采用多种谷物(如：大米、玉米、大麦、小麦、黑麦、燕麦等)，并且谷物占干物质比不得少于25％。婴幼儿营养米粉中谷物原料种类繁多，大大增加了受多种真菌毒素污染的风险，而目前现有标准常只针对一类毒素检测，通量低。所以建立婴幼儿营养米粉中真菌毒素高通量检测的方法尤为必要。

由于高效液相色谱串联质谱法结合了液相色谱高分离度和三重四级杆质谱高分辨力的优点，越来越被广泛用于真菌毒素高通量的检测中。然而真菌毒素高通量检测的技术难点主要在于前处理方法。真菌毒素的化学结构不同，极性差别较大。婴幼儿营养米粉除了谷物原料，还允许添加适量的营养强化剂如维生素(维生素A、D、E；维生素B1、B2；烟酸等)、矿物质(钙、铁、锌等)和其他辅料如蔬菜粉、全脂奶粉等。所以针对婴幼儿营养米粉不仅存在目标化合物真菌毒素共提取、富集存在困难，而且去除富含的多种干扰物、减少基质效应也是另一困难。

目前报道的样品前处理方法有复合免疫亲和柱净化法，此方法去除干扰能力强，灵敏度高，但价格昂贵，而且为了保护免疫亲和柱的活性，需高倍稀释提取液，导致上样量大、耗时长。多功能净化柱(如MycoSep226)价格适宜，但对伏马菌素极性较强的真菌毒素有吸附，导致回收率低，所以报道采用此类净化柱的文献多不含伏马菌素类物质。QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、 Rugged、Safe)净化技术，起初主要用于多农残检测，具有分析范围广、分析速度快、操作简便、成本低等优点。目前针对婴幼儿米粉中24种真菌毒素采用 QuEChERS-PRIME HLB净化技术同时检测的方法未见报道。

发明内容

本发明针对婴幼儿营养米粉这一经高温膨化工艺样品在现有前处理技术中存在的成本高、灵敏度低、基质效应严重、伏马菌素等强极性真菌毒素不能同时提取等问题，提供一种利用QuEChERS-PRIME HLB净化技术同时测定婴幼儿营养米粉中的24种真菌毒素的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种婴幼儿营养米粉中24种真菌毒素的测定方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：称取样品加入乙腈、甲酸、水的混合提取剂，再依次加入MgSO4、醋酸钠复合盐包，采用PRIME HLB净化，氮吹近干，复溶后过膜上机测定；

(2)标准储备液和标准工作溶液配制；标准溶液配制：首先，分别准确称量或移取一定量的24种真菌毒素标准物质，用乙腈：水体积比1:1溶解并定容，制成100μg/mL的标准储备液，分别吸取适量上述标准储备液用乙腈：水体积比 1:1稀释，制成1μg/mL混合标准中间液；

(3)基质匹配工作溶液：移取标准中间液，用空白婴幼儿营养米粉处理液稀释成浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0 ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的工作溶液，备用；

(4)样品分析检测：将待测溶液采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱法进行定性定量分析检测。

本方法中样品前处理的具体步骤为：称取2.5g样品加入20mL提取液，涡旋混匀；依次加入硫酸镁、醋酸钠复合盐包，涡旋混匀，震荡充分萃取，超声，离心，取有机层4mL，过PRIME HLB净化柱，40℃下氮吹至近干，用定溶液定容至1mL，涡旋混匀，超声，过有机滤膜，上机测定。

其中优选地，提取剂是乙腈、甲酸、水体积比为45:5:50的混合溶液。我们尝试采用文献报道的常用提取液乙腈：水(84:16，V:V)、乙腈：水(70:30，V:V) 高比例的有机溶剂时，样品发生严重结块。由于婴幼儿营养米粉的工艺多采用真空脱水工艺，含水量远远低于日常所食用的谷物如大米、玉米、小麦等，当加入乙腈：水(50:50，V:V)时样品分散均匀，但加入上述复合盐包后赭曲霉素A/B 有机层中回收率在20％以下，伏马菌素B₁、B₂、B₃未富集到有机层，当酸度逐步增加到5％的比例时，两类毒素的回收率才达到80％以上。

其中优选地，样品与硫酸镁、醋酸钠的质量比为2.5:6:1.5，无水硫酸镁溶解于水释放大量的热量有助于增加提取效率；并增加了水相的离子强度迫使乙腈和水分层，大部分有机物被赶到有机相，即所谓的盐析原理。醋酸钠与提取液中的酸形成缓冲液，pH值在3.3-3.4，可使赭曲霉毒素A和B，伏马菌素B₁、B₂、 B₃强碱性化合物以分子状态存在，转移至乙腈层。我们尝试采用文献报道的4g MgSO4、1gNaCl复合盐包，4g MgSO4、1g NaCl、1g无水柠檬酸钠、0.5g柠檬酸二钠盐水合物复合盐包，两种盐包导致黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素G₁、杂色曲霉毒素，O-甲基杂色曲霉毒素四种毒素在氮吹过程中损失严重，回收率在 40％左右。

PRIME HLB净化柱无需活化、淋洗，洗脱，直接上样接液，操作简单，而且有效去除磷脂类物质，降低基质效应，使上机溶液更洁净。因此增加PRIME HLB净化柱。

本方法中采用的超高效液相色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T₃色谱柱，柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.8μm。流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流速0.3mL/min，进样体积：5μL；柱温40℃；洗脱方式：梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为表1：

表1：

质谱法的条件为：离子源：电喷雾电离源(ESI源)；扫描方式：多反应监测；喷雾电压：5.5kV(ESI+)、4.5kV(ESI-)；雾化气温度：600℃；雾化气压力：55psi；辅助气压力：55psi；碰撞气压力：8psi；气帘气压力：35psi；所述24种真菌毒素的质谱参数及保留时间为表2。

表2：

*:定量离子

有益效果

(1)方法前处理省时省力，成本低。样品经盐析不仅去除亲水性干扰物质，而且将强极性的赭曲霉毒素及伏马菌素在内的24种目标化合物同时转移至乙腈层，后又经PRIME-HLB净化除去磷脂类物质，灵敏度大大提高，基质效应明显降低。

(2)方法选用Waters ACQUITY UPLC HSS T₃色谱柱对水溶性极性大的小分子有很好的保留，对非极性化合物也不会产生过强保留，提供优异的色谱峰。24种真菌毒素在此色谱柱上保留好，分离效果佳。

(3)方法只选用甲醇-0.1％甲酸水为流动相，正负谱同时扫描，13min内一次完成对24种真菌毒素的全部检测，分析速度快。

(4)本发明方法中24真菌毒素的定量限在0.5μg/kg-2μg/kg，回收率在 70％～120％之间，相对标准偏差在10％以内。本发明方法不仅通量高，而且检出限低，回收率和精密度佳。

附图说明

图1为24种真菌毒素的总离子流图ESI+(A)和ESI-(B)模式下的MRM色谱图(100ng/mL)。

图2为DON、3-ADON和15-ADON在ESI+(A1，B1，C1)和ESI-(A2， B2，C2)模式下的MRM色谱图(100ng/mL)。

图3为T2和HT2毒素在[M+Na]⁺(A1，B1)和[M+H]⁺(A2，B2)下的 MRM色谱图(10ng/mL)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

实施例1

1、仪器与材料

AB SCIEX Triple Quad 5500超高效液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾电离源)；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T₃色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)， BT 125D电子天平(德国Sartorius公司)；MS3型涡旋混合器(德国IKA公司)； SB-800DTD超声清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Mili-Q超纯水机制备。

黄曲霉毒素混标(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)、黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀赤霉菌烯醇、玉米赤霉烯酮(美国O2si公司)；黄曲霉毒素M2、伏马菌素B3、HT-2毒素、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(北京曼哈格公司)；伏马菌素B1、伏马菌素B2(加拿大TRC 公司)；赭曲霉毒素B、杂色曲霉素、玉米赤霉酮(以色列fermentek公司)；T-2 毒素(美国ROMER公司)；O-甲基杂色曲霉素(上海甄准生物科技有限公司)；α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇(德国Witega 公司)；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；DisQuE提取盐包、 Oasis PRIME HLB固相萃取柱(200mg，6mL)购于美国WATERS公司；

2、前处理

2.1标准储备液和标准中间液

分别准确称取或移取24种真菌毒素标准品，用乙腈：水(1:1，V:V)溶解并定容，配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，于-18℃避光保存。

分别准确移取各真菌毒素标准储备液，用乙腈：水(1:1，V:V)稀释至刻度，摇匀，制成真菌毒素浓度均为1μg/mL的混合标准中间液。

2.2基质匹配工作溶液

采用基质匹配的曲线进行定量，即采用空白样品(不含真菌毒素)处理液稀释标准中间液，得到基质匹配工作曲线。移取适量的标准中间液，用空白处理液稀释成浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0 ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的工作溶液。

2.3样品前处理

提取：称取2.5g样品(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入20mL提取液(乙腈、甲酸、水体积比为45:5:50)，涡旋混合15min，超声提取15min。

盐析：加入复合盐包(6g硫酸镁、1.5g醋酸钠)，涡旋混匀，震荡充分萃取，超声，离心，取4mL有机层，待净化。

净化：取4mL上层有机相，置于PRIME-HLB柱，直接接液，40℃氮吹近干，用乙腈：水(1:1，V:V)定容至1mL，过0.22μm有机滤膜，供液相色谱- 串联质谱仪测定。

3、液相色谱和质谱条件

3.1色谱条件：色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T₃色谱柱，柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.8μm；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流速0.3mL/min，进样体积：5μL；柱温40℃；洗脱方式：梯度洗脱见表3。

表3：

3.2质谱条件：离子源：电喷雾电离源(ESI源)；扫描方式：多反应监测；喷雾电压5.5kV(ESI⁺)、4.5kV(ESI^-)；雾化气温度：600℃；雾化气压力：55 psi；辅助气压力：55psi；碰撞气压力：8psi；气帘气压力：35psi。24种真菌毒素的质谱参数见表4。

表4：

*:定量离子

4、结果

4.1方法的线性范围与标准曲线

将2.2配制的基质匹配标准工作溶液用超高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，获得24种真菌毒素标准溶液的总离子流图(图1)。以峰面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为纵坐标，绘制标准曲线。24种真菌毒素在其浓度范围内，峰面积与浓度之间呈良好的线性关系，线性相关系数均大于0.99。

4.2方法回收率和精密度

根据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检验》中检验方法确认的要求，选用了高、中、低三个浓度水平的加标量评价方法的精密度和回收率。每一浓度水平平行测定6次，按步骤2、3进行检测，按步骤4进行定量，得到24种真菌毒素的回收率与精密度，具体结果见表5。由表5可以看出对于不同品牌及口味的婴幼儿营养米粉，24种真菌毒素的回收率都在75％以上，6 次平行测定的结果相对标准偏差小于10％，测定结果的重现性良好。

表5 24种真菌毒素的检出限、定量限、线性范围及加标回收和精密度

4.3方法的检出限与定量限

采用在空白婴幼儿营养米粉中添加目标化合物的方法，确定方法的检出限与定量限。以对应色谱峰响应值3倍信噪比的质量浓度作为方法检出限，以能够准确定量的曲线浓度最低点作为方法的定量限，得到24种真菌毒素的检出限和定量限见表5。

对比例1

将实施例1中的提取剂改为乙腈：水(84:16，V:V)、乙腈：水(70:30，V:V) 高比例的有机溶剂时，其他条件同实施例1。

结果：样品发生严重结块

对比例2

将实施例1中的提取剂改为提取剂1乙腈：水(50:50，V:V)、提取剂2乙腈：甲酸：水(49.5:0.5:50，V:V:V)、提取剂3乙腈：甲酸：水(47.5：2.5:50，V:V:V)时，其他条件同实施例1。

结果：提取剂1赭曲霉素A/B有机层中回收率在20％以下，伏马菌素B₁、 B₂、B₃未富集到有机层，提取剂2赭曲霉素A/B有机层中回收率约50％，伏马菌素B₁、B₂、B₃未富集到有机层，提取剂3赭曲霉素A/B，伏马菌素B₁、B₂、 B₃约70％。

对比例3

将实施例1中盐析条件改为在上述提取液中加入提取盐包方法1(4g硫酸镁，1g氯化钠)和提取盐包方法2(4g硫酸镁，1g氯化钠，1g无水柠檬酸钠， 0.5g柠檬酸二钠盐水合物)，涡旋混合15min，超声提取15min，8000r/min离心6min。其他条件同实施例1。

结果：黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素G₁、杂色曲霉毒素，O-甲基杂色曲霉毒素四种毒素在氮吹过程中损失严重，回收率在40％左右。

对比例4

比较甲醇-水、甲醇-甲酸水两种流动相系统，结果显示当采用甲醇-水为流动相时，伏马菌素类真菌毒素无响应。当换为甲醇-甲酸水时，24种真菌毒素都能出峰，虽然玉米赤霉烯酮及其衍生物在酸性条件下响应值不如纯水高，但也能达到标准所规定的检出限。由于呕吐毒素及其衍生物在正负扫描下都能电离，我们比较了在两种流动相系统下，两种扫描模式的灵敏度。由图2可以得出，甲醇- 甲酸水流动相条件下[M+H]+的响应值(A1、B1、C1)远高于甲醇-水流动相条件[M-H]-的响应值(A2、B2、C2)。综合考虑24种真菌毒素的响应情况，故最终选择甲醇-甲酸水作为流动相。

对比例5

对24种真菌毒素的质谱条件进行优化，分别在正、负离子模式下进行全扫描，T2毒素和HT2毒素的[M+NA]+离子丰度比[M+H]+丰度高，我们比较了在甲醇-甲酸水条件下，两种电离模式下，MRM谱图响应值的比较，见图3。 [M+NA]+电离模式下的两对子离子(A1、B1)灵敏度明显高于[M+H]+ 电离模式下的两对子离子。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种婴幼儿营养米粉中24种真菌毒素的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品前处理：称取样品加入提取液，涡旋混匀，再加入硫酸镁、醋酸钠复合盐包，采用PRIME HLB净化，氮吹近干，复溶后过膜上机测定；

(2)标准储备液和标准工作溶液配制：首先，分别准确称量或移取一定量的24种真菌毒素标准物质，用乙腈：水体积比1:1溶解并定容，制成100μg/mL的标准储备液，分别吸取适量上述标准储备液用乙腈：水体积比1:1稀释，制成1μg/mL混合标准中间液；

(3)基质匹配工作溶液：移取标准中间液，用空白婴幼儿营养米粉处理液稀释成浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的工作溶液，备用；

(4)样品分析检测：将待测溶液采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪进行定性定量分析检测。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，样品前处理的步骤为：称取2.5g样品加入20mL提取液，涡旋混匀，依次加入硫酸镁、醋酸钠复合盐包，涡旋混匀，震荡充分萃取，离心，取有机层4mL，过PRIME HLB柱，40℃下氮吹至近干，用定溶液定容至1mL，涡旋混匀，超声，过有机滤膜，上机测定。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，提取液为乙腈、甲酸、水体积比为45:5:50的混合溶液。

4.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，样品与硫酸镁、醋酸钠的质量比为2.5:6:1.5。

5.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，PRIME HLB柱容量为200mg，6mL。

6.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱柱:WatersACQUITY UPLC HSS T₃色谱柱，柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.8μm。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流动相A：0.1％甲酸水(v/v)溶液；流动相B：甲醇；流速0.3mL/min，进样体积：5μL；柱温40℃；洗脱方式：梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述质谱法的条件为：离子源：电喷雾电离源(ESI源)；扫描方式：多反应监测；喷雾电压：5.5kV(ESI+)、4.5kV(ESI-)；雾化气温度：600℃；雾化气压力：55psi；辅助气压力：55psi；碰撞气压力：8psi；气帘气压力：35psi；所述24种真菌毒素的质谱参数及保留时间为：

*:定量离子。