CN110579550A - 一种干酪中黄曲霉毒素m1的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干酪中黄曲霉毒素M1的检测方法。研究干酪中黄曲霉毒素的提取、净化及富集方法，结合亲水亲脂平衡柱萃取高效液相色谱法检测干酪中的黄曲霉毒素M1。本研究利用一种亲水亲脂平衡柱萃取黄曲霉毒素M1。与现有标准中黄曲霉毒素测方法相比，OASIS HLB固相萃取净化柱对于黄曲霉毒素M1的分离纯化效果很好；干酪中的黄曲霉毒素在8min内被快速检出，平均回收率较高，相对标准偏差(RSD)为1.4％～5.7％，最低检出限为0.037μg/kg。对比现行国标GB5413.37‑2010中第二法的分析时间(100min)，本方法检测速度提高了40min。本发明具有检测所用有分析时间短，操作简单、快捷、检测成本低、准确等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域和食品安全检测领域，具体涉及一种干酪中黄曲霉毒素M1的快速检测方法。
背景技术
干酪是由牛奶经发酵制成的一种营养价值很高的食品。近年来由于我国人民生活水平提高，干酪的人均消费量也在逐年增加。但是，干酪在制作、成熟过程中由于原料、工艺参数控制等原因易产生危害人体健康的生物毒素，其中黄曲霉毒素M1(AFM1)是干酪中较常见生物毒素，是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，对人体的危害较大。
黄曲霉毒素的产生主要是由于含有这些真菌的食品以及饲料等基质在适宜的温度与湿度条件下，加工或保藏过程中所分泌的。食品污染中最常见的黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)。其中黄曲霉毒素B1是最为常见的种类。AFM1就是由黄曲霉毒素B1在生物体内产生的主要代谢产物，是一种强烈的致癌物。哺乳类动物摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料或食品后，黄曲霉毒素B1在体内经过一系列的代谢过程而生成AFM1。由于其易于在牛乳中出现，如果被AFM1污染的原料乳应用于干酪的制作，对于干酪消费者的身体健康必然带来极大危害。因此针对干酪中AFM1的检测和监控十分有必要。
目前国内外形成了很多针对黄曲霉毒素的检测技术，主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析。TLC虽然简便，但灵敏度差。ELISA方法具有重复性差、试剂寿命短需要低温保存的缺点。目前对于黄曲霉毒素M1的定性，定量检测主要采用免疫亲和层析高效液相色谱法。此方法检测灵敏度高，检测限低。但是存在检测结果易受免疫亲和柱柱效的影响，亲和柱成本过高等问题。本发明利用一种成本更低，柱效时间更长的，亲水亲脂平衡柱对黄曲霉毒素M1进行分离纯化，采用高效液相色谱仪对干酪中的黄曲霉毒素M1进行定性，定量分析。通过对干酪中黄曲霉毒素M1的提取，净化等步骤进行改良优化，以达到快速，准确检测干酪中黄曲霉毒素M1的目的。
发明内容
有鉴于此，通过对黄曲霉毒素M1的提取、净化等步骤进行优化，以达到快速、准确检测干酪中黄曲霉毒素M1的目的。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种干酪中黄曲霉毒素M1的快速检测方法：包括以下步骤：
(1)黄曲霉毒素M1标准工作液的配制：AFM1标准储备液浓度为10μg/ml。
(2)以10％乙腈溶液分别配制质量浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL的黄曲霉毒素M1标准工作液，进行色谱分析，通过色谱分析得出相应的质量浓度所对应的峰面积平均值。再按照标准曲线得到食品样品中黄曲霉毒素M1的含量。
其中所述的高效液相色谱法包括以下条件：色谱柱：大连依利特Hypersil ODS2(5μm，250mm×4.6mm)。柱温为30℃；流动相为25％乙腈水溶液；流速为1mL/min梯度洗脱，在25min内乙腈质量分数从30％升到100％。进样量为10μL；荧光检测器波长为Ex＝365nm，Em＝450nm；
(3)干酪中黄曲霉毒素M1的提取：称取5g干酪样品于匀浆杯中，加入30mL乙腈，置于匀浆机中，匀浆5min，收集液相，离心(8000r/min、10min)，收集上清液，用滤纸过滤。收集滤液并移入250mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30mL石油醚，振摇2min，待分层后，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100mL圆底烧瓶中，30～50℃减压浓缩至约2mL，浓缩液倒入50mL容量瓶中加水定容至刻度。
优选的，步骤(3)中的减压温度为45℃。
优选的，步骤(3)中的乙腈浓度为1～4ng/mL。
(4)黄曲霉毒素M1提取液的固相萃取条件：先用5mL乙腈淋洗HLB固相萃取柱再用5mL水洗柱。然后将AFM1的提取液样液上柱萃取，待样液全部萃取完毕，用20mL乙腈-水溶液对固相萃取小柱进行淋洗，待淋洗液全部过柱之后，用5mL乙腈将黄曲霉毒素M1洗脱，将乙腈洗脱液收集，在40℃水浴条件下氮气吹干。吸取1mL乙腈溶解残留物，用0.22μm有机膜过滤，以备进行色谱分析。
优选的，步骤(4)中，固相萃取的淋洗液乙腈-水溶液的质量分数为20％～25％。
优选的，步骤(4)中的柱子还可以采用免疫亲和柱。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1附图为本发明黄曲霉毒素M1标准样品色谱检测图
图2附图为本发明HLB柱净化干酪样品中黄曲霉毒素M1色谱检测图
本发明的优点是：
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用一种成本更低，柱效时间更长的，亲水亲脂平衡柱对黄曲霉毒素M1进行分离纯化，采用高效液相色谱仪对干酪中的黄曲霉毒素M1进行定性，定量分析。通过对干酪中黄曲霉毒素M1的提取，净化等步骤进行改良优化，以达到快速，准确检测干酪中黄曲霉毒素M1的目的。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来进一步清楚、完整地描述本发明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实例1
称取5g干酪样品于匀浆杯中，加入浓度为1ng/mL的乙腈30mL，置于匀浆机中，匀浆5min，收集液相，离心(8000r/min、10min)，收集上清液，用滤纸过滤。收集滤液并移入250mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30mL石油醚，振摇2min，待分层后，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100mL圆底烧瓶中，45℃减压浓缩至约2mL，浓缩液倒入50mL容量瓶中加水定容至刻度。
先用5mL乙腈淋洗HLB固相萃取柱再用5mL水洗柱。然后将AFM1的提取液样液上柱萃取，待样液全部萃取完毕，用20mL浓度为25％的乙腈-水溶液对固相萃取小柱进行淋洗，待淋洗液全部过柱之后，用5mL乙腈将黄曲霉毒素M1洗脱，将乙腈洗脱液收集，在40℃水浴条件下氮气吹干。吸取1mL乙腈溶解残留物，用0.22μm有机膜过滤，以备进行色谱分析。
实例2
称取5g干酪样品于匀浆杯中，加入浓度为4ng/mL的乙腈30mL，置于匀浆机中，匀浆5min，收集液相，离心(8000r/min、10min)，收集上清液，用滤纸过滤。收集滤液并移入250mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30mL石油醚，振摇2min，待分层后，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100mL圆底烧瓶中，45℃减压浓缩至约2mL，浓缩液倒入50mL容量瓶中加水定容至刻度。
先用5mL乙腈淋洗HLB固相萃取柱再用5mL水洗柱。然后将AFM1的提取液样液上柱萃取，待样液全部萃取完毕，用20mL浓度为25％的乙腈-水溶液对固相萃取小柱进行淋洗，待淋洗液全部过柱之后，用5mL乙腈将黄曲霉毒素M1洗脱，将乙腈洗脱液收集，在40℃水浴条件下氮气吹干。吸取1mL乙腈溶解残留物，用0.22μm有机膜过滤，以备进行色谱分析。
实例3
称取5g干酪样品于匀浆杯中，加入浓度为1ng/mL的乙腈30mL，置于匀浆机中，匀浆5min，收集液相，离心(8000r/min、10min)，收集上清液，用滤纸过滤。收集滤液并移入250mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30mL石油醚，振摇2min，待分层后，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100mL圆底烧瓶中，45℃减压浓缩至约2mL，浓缩液倒入50mL容量瓶中加水定容至刻度。
先用5mL乙腈淋洗HLB固相萃取柱再用5mL水洗柱。然后将AFM1的提取液样液上柱萃取，待样液全部萃取完毕，用20mL浓度为20％的乙腈-水溶液对固相萃取小柱进行淋洗，待淋洗液全部过柱之后，用10mL乙腈将黄曲霉毒素M1洗脱，将乙腈洗脱液收集，在40℃水浴条件下氮气吹干。吸取1mL乙腈溶解残留物，用0.22μm有机膜过滤，以备进行色谱分析。
实例4
称取5g干酪样品于匀浆杯中，加入浓度为1ng/mL的乙腈30mL，置于匀浆机中，匀浆5min，收集液相，离心(8000r/min、10min)，收集上清液，用滤纸过滤。收集滤液并移入250mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30mL石油醚，振摇2min，待分层后，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100mL圆底烧瓶中，45℃减压浓缩至约2mL，浓缩液倒入50mL容量瓶中加水定容至刻度。
先用5mL乙腈淋洗HLB固相萃取柱再用5mL水洗柱。然后将AFM1的提取液样液上柱萃取，待样液全部萃取完毕，用20mL浓度为25％的乙腈-水溶液对固相萃取小柱进行淋洗，待淋洗液全部过柱之后，用5mL乙腈将黄曲霉毒素M1洗脱，将乙腈洗脱液收集，在40℃水浴条件下氮气吹干。吸取1mL乙腈溶解残留物，用0.22μm有机膜过滤，以备进行色谱分析。
对上述实施例1～4中黄曲霉毒素M1的检测方法进行评价
(1)黄曲霉毒素M1的线性回归方程和相关系数
分别配制质量浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL的黄曲霉毒素M1标准工作液，进行色谱分析，通过色谱分析得出相应的质量浓度所对应的峰面积平均值。由此，得出黄曲霉毒素M1的标准曲线，线性回归方程为y＝14411x-641.81，相关系数R2＝0.9995。
由此可知，黄曲霉毒素M1的浓度和峰面积在本方法的条件下，线性关系良好。
(2)干酪样品中黄曲霉毒素M1提取溶剂的确定
在干酪样品中分别添加1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL 3个水平质量浓度的黄曲霉毒素M1，采用乙腈、甲醇、丙酮分别提取干酪样品中的黄曲霉毒素M1。
表1干酪中三种添加水平下黄曲霉毒素M1的添加回收率(n＝5)
由表1可知，采用乙腈对干酪样品中的AFM1进行提取无论在哪个添加水平下，回收率都显著高于其他两种试剂的提取回收率。回收率分别为92.6％、87.2％、90.3％；RSD≤5.7％。乙腈为最适宜的AFM1提取试剂。
(3)干酪样品中黄曲霉毒素M1的添加回收率以及相对标准偏差
在干酪样品中分别添加1、2、4ng/mL 3个水平质量浓度的AFM1，每个水平作5次平行试验，按上述方法进行分析。计算AFM1的平均回收率，以及相对标准偏差，试验结果如表2所示。
表2黄曲霉毒素M1的添加回收率(n＝5)
由表2可以看出，可知AFM1的平均回收率在87.1％以上，相对标准偏差小于5.7％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (6)
1.一种快速检测干酪中黄曲霉毒素M1的方法：具体包括以下步骤(1)标准曲线方程式的制备：将黄曲霉毒素M1标准储备液采用高效液相色谱法得到标准曲线方程式；(2)提取溶剂对干酪样品中的黄曲霉毒素M1进行提取，利用一种亲水亲脂平衡柱对黄曲霉毒素M1进行萃取，然后上机检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法包括以下条件：进样量10μL，采用大连依利特Hypersil ODS2(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱。柱温为30℃；流动相为乙腈-水溶液；荧光检测器波长为Ex＝365nm，Em＝450nm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，乙腈-水溶液质量分数为20％～25％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取溶剂为乙腈。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，乙腈质量浓度为1～4ng/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，萃取柱为OASIS HLB固相萃取净化柱。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113533608A (zh) * | 2021-06-16 | 2021-10-22 | 湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109781889A (zh) * | 2019-02-14 | 2019-05-21 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种婴幼儿营养米粉中的24种真菌毒素的测定方法 |
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| 张国梁 等: "亲水亲脂平衡柱萃取高效液相色谱法快速测定干酪中的黄曲霉毒素M1", 中国酿造 * |
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