CN106370736A - 一种smart柱在线净化‑hplc/uve荧光同时检测花生产品中四种黄曲霉毒素的方法 - Google Patents

一种smart柱在线净化‑hplc/uve荧光同时检测花生产品中四种黄曲霉毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种SMART柱在线净化‑HPLC/UVE荧光同时检测花生产品中四种黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：(1)样品处理；(2)SMART免疫亲和柱在线净化‑HPLC/UVE荧光检测：取提取液上SMART免疫亲和柱，淋洗，干燥，洗脱，洗脱液直接进入HPLC的色谱柱，过色谱柱的液体经过UVE柱后衍生反应器处理，最后进入荧光检测器检测，然后绘制标准曲线，外标法定量，根据峰面积对四种黄曲霉毒素进行定量。本发明前处理简单、净化效果好、灵敏度高、重复性好，适合于花生中痕量黄曲霉素的多残留快速检测。

Description

一种SMART柱在线净化-HPLC/UVE荧光同时检测花生产品中四 种黄曲霉毒素的方法
技术领域
本发明涉及食品检验技术领域，特别涉及一种SMART柱在线净化-HPLC/UVE荧光同时检测花生产品中四种黄曲霉毒素的方法。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称为AF)是目前为止发现毒性最大的真菌毒素，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍。它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重，它抑制DNA、RNA及肝脏蛋白质的合成，从而导致急性中毒，现有关黄曲霉毒素中毒事件有许多报导。该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在与霉变的粮食及粮食制品中。但由于黄曲霉毒素性质比较稳定，耐热性好，研究表明要加热至230℃以上才可破坏黄曲霉毒素，而一般烹饪加工则达到，无法去除，且也难以对毒素进行消除。另据世界卫生组织报导，黄曲霉毒素含量在30～50μg/kg时为低毒，50～100μg/kg时为中毒，100～1000μg/kg时为高毒，1000μg/kg以上为极毒。鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性，世界各国陆续制定了严格的AFT的限量标准，对黄曲霉毒素也采取了更加严格的控制措施，提高了食品中的黄曲霉毒素污染限量的新要求。如中国和美国对花生和花生油中黄曲霉毒素的检测限量≤20μg/kg，欧盟更是限定≤4g/kg(ppb)，从各国对AF的检测限量要求较高，已达ppb级，需要用最精确及高效的检测技术进行测定。
HPLC在测定食品中的真菌毒素应用越来越广泛，该方法具有高效、快速、准确性好、灵敏度高、重现性好、检测下限低等优点。但是在样品前处理技术采用传统的免疫亲和柱法，不仅增加了检测工作时间、且增加了检测过程中目标物的损失。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SMART柱在线净化-HPLC/UVE荧光同时检测花生产品中四种黄曲霉毒素的方法，简单快速、高灵敏度，可同时测定4种黄曲霉毒B1、B2、G1、G2，为黄曲霉毒素的检测方法提供一种新方法和新思路。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种SMART柱在线净化-HPLC/UVE荧光同时检测花生产品中四种黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：准确称取样品20.0g，加入2g的NaCl，同时加入100mL提取溶剂和50mL正己烷于均质机中搅拌均匀，于4℃下10000r/min离心10min，用一次性吸管取下层液并用快速定性滤纸过滤，收集滤液，稀释处理后得提取液；
(2)SMART免疫亲和柱在线净化-HPLC/UVE荧光检测：取提取液上SMART免疫亲和柱，淋洗，干燥，洗脱，洗脱液直接进入HPLC的色谱柱，过色谱柱的液体经过UVE柱后衍生反应器处理，最后进入荧光检测器检测，然后绘制标准曲线，外标法定量，根据峰面积对四种黄曲霉毒素进行定量。
作为优选，步骤(1)中所述提取溶剂为甲醇与水按照4:1的体积比混合而成。
作为优选，步骤(1)中所述稀释处理为：取14mL滤液加入86mL浓度1mM的PBS缓冲溶液进行稀释处理。
作为优选，步骤(2)中提取液上SMART免疫亲和柱，控制过柱流速在1.5mL/min，直到让所有上样样品都通过柱子流出来。
作为优选，步骤(2)中所述淋洗为采用超纯水进行柱子淋洗，淋洗流速在1.5mL/min。
作为优选，步骤(2)中所述干燥为采用抽真空方式去除柱子中残余的水。作为优选，步骤(2)中色谱柱为Agilent XDB C18，柱温：36℃；流动相：水：甲醇：乙腈体积比＝60:30:15；流速：1.0mL/min；UVE柱后衍生反应器处理的温度控制为35℃；荧光检测器参数设置为：激光波长365nm，发射波长460nm。
作为优选，步骤(2)中所述洗脱采用色谱柱的流动相：水：甲醇：乙腈体积比＝60:30:15，对SMART免疫亲和柱进行洗脱，洗脱速度在0.5mL/min。作为优选，四种黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2。
作为优选，黄曲霉毒素B1的线性方程为Y＝735.264X+1527.30，黄曲霉毒素B2的线性方程为Y＝812.627X-142.361，黄曲霉毒素G1的线性方程为Y＝445.712X+438.276，黄曲霉毒素G2的线性方程为Y＝139.511X+93.325，其中Y为荧光检测所得的峰面积，X为黄曲霉毒素的浓度。
本发明的有益效果是：检测方法灵敏度高、检测时间短、重复性好、结果准确可靠，可同时测定4种黄曲霉毒B1、B2、G1、G2，为黄曲霉毒素的检测方法提供一种新方法和新思路。
附图说明
图1是不同比例的甲醇/水体系对黄曲霉毒素的提取效果。
图2是4种黄曲霉毒素的标准色谱图。
图3是衍生前的AFT标准色谱图。
图4是衍生后的AFT标准色谱图。
图5是加标样品的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一种SMART柱在线净化-HPLC/UVE荧光同时检测花生产品中四种黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：准确称取样品20.0g，加入2g的NaCl，同时加入100mL提取溶剂(甲醇与水按照4:1的体积比混合而成)和50mL正己烷于均质机中搅拌均匀，于4℃下10000r/min离心10min，用一次性吸管取下层液并用快速定性滤纸过滤，收集滤液，取14mL滤液加入86mL浓度1mM的PBS缓冲溶液(pH7.2)进行稀释处理后得提取液。
(2)SMART免疫亲和柱在线净化-HPLC/UVE荧光检测：取提取液上SMART免疫亲和柱，淋洗，干燥，洗脱(采用流动相：水：甲醇：乙腈体积比＝60:30:15，进行洗脱)，洗脱液直接进入HPLC的色谱柱，过色谱柱的液体经过UVE柱后衍生反应器处理，最后进入荧光检测器检测，然后绘制标准曲线，外标法定量，根据峰面积对四种黄曲霉毒素进行定量。提取液上SMART免疫亲和柱，控制过柱流速在1.5mL/min，直到让所有上样样品都通过柱子流出来。所述淋洗为采用超纯水进行柱子淋洗，淋洗流速在1.5mL/min。所述干燥为采用抽真空方式去除柱子中残余的水。色谱柱为Agilent XDB C18，柱温：36℃；流动相：水：甲醇：乙腈体积比＝60:30:15；流速：1.0mL/min；UVE柱后衍生反应器处理的温度控制为35℃；荧光检测器参数设置为：激光波长365nm，发射波长460nm。四种黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2。
试验
1实验部分
1.1试剂与材料
黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)：纯度W≥99％，美国ROMER公司。甲醇、乙腈：均为色谱纯，德国Merk公司。正己烷：分析纯，北京化工厂。磷酸氢二钠十二水(Na2HPO4.12H2O)，磷酸二氢钠(NaH2PO4.1H2O)，氯化钠(NaCl)：上海安谱公司。实验用水为超纯水。花生和花生油均购自超市。
1.2仪器与设备
Agilent 1100型高效液相色谱仪：美国Agilent公司，配自动进样器、四元梯度泵、柱温箱、荧光检测器。UVETM光化学柱后衍生系统：德国LCTech公司。SMART-柱全自动净化分析联机系统：德国LCTech公司，系统配Freestyle三维移液系统、固相萃取系统SPE、ThermELUTE液相在线进样系统、精密移液泵、迷你免疫亲和柱架和盘。高速冷冻离心机：AERJSE09L31,美国。MILLI-Q纯水机：美国Milli-Q公司。SMART免疫亲和柱：AflaCLEANTM净化柱，德国LCTech公司。
1.3实验方法
1.3.1溶液的配制
(1)标准溶液的配制：分别准确称取适量AFB1、AFB2、AFG1、AFG2标准于100mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成100mg/L的标准储备溶液，-18℃避光保存备用。使用时用流动相溶逐步稀释配成适当浓度的混合标准工作溶液，现配现用。
(2)磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制：5mmol/L PBS(pH7.2)母液配制：称取50.14gNa2HPO4.12H2O溶解于700mL水中，同时称取9.66gNaH2PO4.1H2O溶解于350mL水中，最后将上述两种溶液进行混合并加入42.5gNaCl，即配制成pH7.2 5mmol磷酸盐缓冲溶液。1mmol/LPBS(pH7.2)溶液配制：取200mL的5mmol/L PBS(pH7.2)稀释于800mL水中。
1.3.2样品处理方法
准确称取样品20.0g(样品是固体的如花生米需要捣碎；样品是液体如花生油的直接使用)并加入2g的NaCl，同时加入100mL提取溶剂(甲醇/水，4/1，V/V)和50mL正己烷于均质机中高速搅拌5min。于4℃下10000r/min离心10min，用一次性吸管取下层液并用快速定性滤纸过滤，收集滤液。取14mL过滤后的提取液加入86mL的1mmol PBS缓冲溶液(pH7.2)进行稀释处理，混匀后待上免疫亲和柱净化处理。
1.3.3样品净化方法
采用SMART柱作为免疫亲和柱对提取液进行洗脱净化处理，将SMART免疫亲和柱放置于迷你免疫亲和柱架和盘。打开AflaCLEANTM净化柱上端密封盖和下端堵头后，柱中的缓冲溶液会排出，直到缓冲溶液液面达到柱中填料上层处。取5-10ml稀释后的提取液上柱，并控制过柱流速在1.5mL/min，直到让所有上样样品都通过柱子流出来。
1.3.4在线SPE-HPLC/UVE荧光检测平台条件
采取SPE模块并结合ThermELUTE模块进行真菌毒素快速在线SPE-HPLC分析联用平台在线HPLC/UVE荧光检测花生中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。
(1)高效液相色谱分析条件：色谱柱为Agilent XDB C18，柱温：36℃；流动相：水：甲醇：乙腈(60:30:15，V:V:V)溶液；流速：1.0mL/min；UVE柱后衍生反应器温度：35℃；荧光检测器：激光波长365nm，发射波长460nm。进样方式：采用Freestyle系统大体积洗脱液直接从SMART柱传输到HPLC柱，进样量为400μL。
(2)在线SPE模块条件：采用SMART-柱全自动净化分析联机洗脱，分别包括样品上样、柱子的淋洗、柱的干燥和样品洗脱四个步骤。采用超纯水进行柱子淋洗，流速在1.5mL/min，并抽真空去除柱子中残余的水进行干燥处理；最后用流动相(水：甲醇：乙腈(60:30:15，V:V:V))溶液洗脱柱子，流速在0.5mL/min。最后设定400μL洗脱液经ThermELUTE模块直接进HPLC柱进行测定。
2结果与讨论
2.1样品前处理方法的优化
真菌毒素的提取一般采用极性溶液，其中甲醇-水体系是使用较为常见的提取溶剂。本文中研究了不同比例的甲醇-水溶液的提取效果，分别是甲醇/水的体积比为1/1，2/1，3/1，4/1，5/1，以提取回收率为指标。从图1可知，随着甲醇量的提高，目标分析物的提取回收率逐步提高，但当甲醇的浓度超高80％时，提取回收率开始下降，因此，本文采用甲醇/水为4/1的体积比作为最适提取剂。
2.2色谱条件的优化
考察了黄曲霉毒素属于极性化合物，本文中采用水/甲醇/乙腈三种溶液组合及其不同配比对色谱分离效果的影响。结果表明，当流动相中乙腈比例过多时，AFB2和AFG1分不开；而当甲醇含量过多时，AFG1和AFG2峰会有部分重叠；但当流动相中水比例超过60％时，各组分出峰时间将延长；因此，选用水：甲醇：乙腈溶液(60:30:15，V:V:V)作为检测4种黄曲霉毒素的流动相。从图2标准图谱可知，目标峰和样品中的杂峰均分离良好，且4种目标峰峰形对称、相对尖锐，HPLC分析测定可在10min内完成，现有技术报道的单个样品测试时间需15min完成还快，说明本文中所选定的流动相比例不仅可以有效分离4种黄曲霉毒素，且提高了检测方法的速率。
2.3UVE光化学柱后衍生技术的应用
虽然AFB2和AFG2在荧光检测器上有很好的响应值，但是AFB1和AFG1需要进行衍生才可以在荧光检测器上有好的响应值，因此为了提高黄曲霉毒素B1和G1的检测痕量的灵敏度，需要对其进行衍生化处理。在目前HPLC方法中，以柱前衍生法和柱后衍生法居多，但柱前衍生法由于操作过程繁琐，容易影响定量的准确性，不适合用于大量样品的常规检测。而柱后衍生法操作简单、可连续反应以实现自动化分析，适用于大量样品的连续的自动化操作。
采用的UVE光化学柱后衍生设备对目标物进行衍生化处理，无需任何试剂，以HPLC流动相的水作为反应试剂，且操作简单，只要将该设备连接到HPLC柱出口和荧光检测器的进口之间即可使用。图3、图4分别是4种黄曲霉毒素经UVE光化学柱后衍生前后的标准色谱峰比较图，由两张图可以明显的看出未经衍生的AFB1和AFG1不能完成出峰，说明UVE光化学柱后衍生可有效提高目标物质的灵敏度。
2.4方法的线性及检出限
在优化条件下，用逐级稀释的混合标准溶液系列进样分析，以峰面积(Y)对个目标溶液中对应的浓度(X)作线性回归，以研究标准溶液曲线的线性范围和相关稀释。同时，在进行加标实验，以3倍信噪比(S/N)对应的添加水平作为方法的检出限，具体结果见表1和图5。
从图5所示，在加标量为10ppb时黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的分离效果良好。从表1可以看出4种组分在选定的色谱条件下均具有良好的线性关系，相关系数(r)≥0.9992。而加标法确定4种AFT的检出限：AFB1为0.070μg/Kg，AFB2为0.020μg/Kg，AFG1为0.068μg/Kg，AFG2为0.018μg/Kg。
表1 4种黄曲霉毒素的线性方程、线性范围、相关系数和检出限
黄曲霉毒素 回归方程 相关系数(r) 线性范围(μg/L) 检出限(μg/Kg)
AFB1 Y＝735.264X+1527.30 0.9997 0.010-1.000 0.070
AFB2 Y＝812.627X-142.361 0.9996 0.005-0.100 0.020
AFG1 Y＝445.712X+438.276 0.9992 0.025-1.500 0.068
AFG2 Y＝139.511X+93.325 0.9996 0.025-1.500 0.018
2.5方法的回收率和精密度
在花生和花生油中添加表2中所列的2组浓度水平的黄曲霉毒素，按上述实验条件进行回收试验，计算方法的加标回收率和精密度，每个浓度做3个平行。结果见表2可知，4种真菌毒素的回收率在花生样品加标回收率82.6％-94.6％之间，相对标准偏差(RSD)为0.424％-4.879％；花生油样品加标回收率在93.2％-99.6％之间，RSD为0.814％-2.546％。
表2花生和花生油样品中黄曲霉毒素的加标回收率和相对标准偏差(n＝3)
3结论
本文建立了SMART柱在线全自动净化系统结合高效液相色谱法串联UVE柱后衍生荧光同时测定花生和花生油中4种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法。所建立方法灵敏度高、检测时间短、重复性好、结果准确可靠，获得的目标分析物质的检出限满足国内外的限量要求，适合于食品中多种黄曲霉素毒素的同时快速检测。
利用本发明的方法检测花生及其加工制品50份，包括原料花生15份、花生油5份、花生酱10份、含花生的加工制品20份，其中3个样品中检测不同浓度水平的黄曲霉毒素：1份原料花生、1份花生油和1份花生酱，测定值分别是，52.62μg/Kg、30.12μg/Kg、45.35μg/Kg，其余47份产品中均未检出黄曲霉毒素。同采用GB/T5009.23-2006的方法检测结果一致。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种SMART柱在线净化-HPLC/UVE荧光同时检测花生产品中四种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品处理：准确称取样品20.0g，加入2g的NaCl，同时加入100mL提取溶剂和50mL正己烷于均质机中搅拌均匀，于4℃下10000r/min离心10min，用一次性吸管取下层液并用快速定性滤纸过滤，收集滤液，稀释处理后得提取液；
(2)SMART免疫亲和柱在线净化-HPLC/UVE荧光检测：取提取液上SMART免疫亲和柱，淋洗，干燥，洗脱，洗脱液直接进入HPLC的色谱柱，过色谱柱的液体经过UVE柱后衍生反应器处理，最后进入荧光检测器检测，然后绘制标准曲线，外标法定量，根据峰面积对四种黄曲霉毒素进行定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述提取溶剂为甲醇与水按照4:1的体积比混合而成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述稀释处理为：取14mL滤液加入86mL浓度1mM的PBS缓冲溶液进行稀释处理。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中提取液上SMART免疫亲和柱，控制过柱流速在1.5mL/min，直到让所有上样样品都通过柱子流出来。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述淋洗为采用超纯水进行柱子淋洗，淋洗流速在1.5mL/min。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述干燥为采用抽真空方式去除柱子中残余的水。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中色谱柱为Agilent XDB C18，柱温：36℃；流动相：水：甲醇：乙腈体积比＝60:30:15；流速：1.0mL/min；UVE柱后衍生反应器处理的温度控制为35℃；荧光检测器参数设置为：激光波长365nm，发射波长460nm。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述洗脱采用色谱柱的流动相：水：甲醇：乙腈体积比＝60:30:15，对SMART免疫亲和柱进行洗脱，洗脱速度在0.5mL/min。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：四种黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：黄曲霉毒素B1的线性方程为Y＝735.264X+1527.30，黄曲霉毒素B2的线性方程为Y＝812.627X-142.361，黄曲霉毒素G1的线性方程为Y＝445.712X+438.276，黄曲霉毒素G2的线性方程为Y＝139.511X+93.325，其中Y为荧光检测所得的峰面积，X为黄曲霉毒素的浓度。
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