CN107677748A - 一种母乳中全氟化合物的快速筛查检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种母乳中全氟化合物的快速筛查检测方法，包括样品提取、样品净化和液相色谱‑四级杆质谱/质谱测定，通过增强型脂质快速净化策略QuEChERS EMR‑Lipid除去母乳中的脂质体基质干扰，通过乙腈沉淀蛋白去除母乳中的蛋白基质干扰，直接省去了现有技术中固相萃取方法带来的复杂操作步骤，极大简化操作难度且能保证分析灵敏度，实现了母乳中九种全氟化合物的快速筛查。

Description

一种母乳中全氟化合物的快速筛查检测方法

技术领域

本发明涉及母乳检测技术领域，特别是涉及一种母乳中全氟化合物的快速筛查检测方法。

背景技术

全氟化合物(PFCs)是一类用途广泛的人工合成化合物，由于其具有强疏水性和独特的物理化学特性，被广泛应用于厨具不粘涂料、纺织面料、皮革制品等领域。但由于其化学性质稳定，在自然环境中难以被降解，大量含有PFCs的生活废弃物进入环境后极易进入食物链而产生累积放大效应，并通过食物及饮用水被人体摄入。目前已知的研究中显示，PFCs可广泛的分布于人体的多个脏器器官，对神经系统、生殖系统、免疫系统等各个重要器官产生危害。PFCs主要通过蛋白质结合累积于人体内，暴露于PFCs污染环境下的人体分泌母乳中的PFCs含量会显著升高，母乳作为新生儿重要的食物来源，其中PFCs污染物的暴露水平直接决定了新生儿PFCs的暴露水平及健康影响状况。因此，建立一套能够快速筛查母乳中PFCs化合物的方法就显得尤为重要。

目前国内外所报道的母乳中全氟化合物的检测方法主要依赖于固相萃取法(SPE)提取和净化，使用液相色谱串联质谱技术进行分析检测。传统的SPE净化虽然结果重现性好，但操作较为繁琐，耗时长，无法满足快速筛查的要求。本研究基于QuEChERS快速处理净化的方法上，使用增强型脂质快速净化(QuEChERS EMR-Lipid)前处理方法对母乳进行净化后测定九种全氟化合物(PFCs)，极大简化了前处理方法，降低了分析成本。

发明内容

本发明为解决上述现有技术存在的问题，提供一种母乳中全氟化合物的快速筛查检测方法，采用将母乳直接加入QuEChERS EMR-Lipid净化试剂中活化试剂，再加入乙腈进行蛋白沉淀及除脂操作，使用高盐反萃包QuEChERS Final Polish EMR-Lipid获得乙腈层后，氮气吹干定容，进行目标物分析。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种母乳中全氟化合物的快速筛查检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，样品提取：

取5.0g母乳样品于聚丙烯离心管中，加入内标物，漩涡混匀，混匀后离心取上清液；

步骤2，样品净化：

将步骤1离心后的上清液转移至含有QuEChERS dSPE EMR-Lipid试剂包的聚丙烯离心管中，混匀后加入5.0mL乙腈，控温离心，离心温度为25℃，离心后的上清液转移至含有高盐反萃包QuEChERS Final Polish EMR-Lipid的15mL聚丙烯离心管中，混匀后离心，取4.0mL上层乙腈层用氮气吹干，用浓度为70％含乙酸铵的乙腈溶液定容至1mL，然后用0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测液；

步骤3，液相色谱-四级杆质谱/质谱测定：

液相色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil Gold，200mm×2.1mm,1.9μm；柱温30℃；流速0.2mL/min；进样量10μL；流动相：A为10mmol/L的乙酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱；

质谱条件：电喷雾离子源：ESI+模式；多反应监测：MRM模式；喷雾电压：正离子模式3000V；离子源温度320℃；脱溶剂温度270℃；鞘气：氮气，40arb；辅助气：氮气，8arb；

根据步骤3的测定条件对步骤2的待测液进行测定。

在上述色谱条件、质谱条件下，将全氟化合物的混合标准溶液与步骤2中得到的待测液依次进行测定，以标准溶液中的待测目标物响应强度峰面积为纵坐标(Y)，各组分质量浓度为横坐标(X)进行线性回归分析，将待测物响应峰面积带入回归方程，以内标法计算目标物的含量。

优选的，乙腈为色谱纯，乙酸铵溶液为分析纯。

优选的，全氟化合物的标准溶液为全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟丁烷磺酸、全氟庚酸、全氟壬酸、全氟己烷磺酸、全氟癸酸、¹³C₄-全氟辛酸、¹³C₄-全氟辛烷磺酸。

本发明与常规固相萃取法相比，实现了QuEChERS简洁的操作获得稳定实验结果的良好特性，将所需分析的目标物通过超高效液相色谱-四级杆质谱/质谱测定，借助四级杆质谱/质谱的定性定量特性及前处理的简单快速的操作，实现了快速筛查母乳中九种PFCs化合物的方法，极大的简化了传统固相萃取法的操作，大幅缩减了分析时间及成本，为母乳基质中PFCs快速筛查工作提供了全新的思路。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

(1)本发明通过增强型脂质快速净化策略QuEChERS EMR-Lipid除去母乳中的脂质体基质干扰，通过乙腈沉淀蛋白去除母乳中的蛋白基质干扰，直接省去了现有技术中固相萃取方法带来的复杂操作步骤，极大简化操作难度且能保证分析灵敏度，实现了母乳中九种全氟化合物的快速筛查；

(2)本发明采用10mmol/L的乙酸铵溶液与乙腈溶液作为流动相，通过色谱条件，实现了干扰组之间的分离并且保证了分析过程中的离子化效率，在色谱条件上保证了母乳中九种全氟化合物同时筛查的条件；

(3)本发明使用增强型脂质快速净化策略的快速筛查方法的建立，拓展了在复杂基质样品中的全氟化合物检测方法，为母乳中的全氟化合物检测提供了全新的技术手段。

附图说明

图1为本发明中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、全氟戊酸、全氟己酸标准溶液测定色谱图；

图2为本发明中全氟丁烷磺酸、全氟庚酸、全氟己烷磺酸、全氟壬酸标准溶液测定色谱图；

图3为本发明中全氟癸酸标准溶液测定色谱图；

图4为本发明母乳加标测定总离子流图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明提供一种母乳中全氟化合物的快速筛查检测方法，包括以下步骤：

步骤1，样品提取：

取5.0g母乳样品于15mL聚丙烯离心管中，加入100μg/L混合内标液100μL，漩涡混匀后在4℃下转速为10000r/min离心15min，离心后取上清液；

步骤2，样品净化：

将步骤1离心后的上清液转移至含脂质快速净化包QuEChERS dSPE EMR-Lipid的15mL聚丙烯离心管中，漩涡混匀后加入5.0mL乙腈，继续漩涡混匀2min，静置1min后于25℃下，转速为7000r/min离心10min，将离心后的上清液转移至含有高盐反萃包QuEChERSFinal Polish EMR-Lipid的15mL聚丙烯离心管中混匀后，于7000r/min离心10min，离心后取4.0mL上层乙腈层在水浴锅中经水浴氮气吹干，然后用浓度为70％含乙酸铵的乙腈溶液定容至1mL，用0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测液；

步骤3，液相色谱-四级杆质谱/质谱测定：

液相色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil Gold，200mm×2.1mm,1.9μm；柱温30℃；流速0.2mL/min；进样量10μL；流动相：A为10mmol/L的乙酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱；

梯度洗脱程序为：0～2.0min，70％流动相A，30％流动相B；2.0～14.0min，流动相B从30％线性增加至90％；14.0～15.0min，10％流动相A，90％流动相B；15.0～15.1min，流动相B从90％线性递减至30％；15.1～19.0min，70％流动相A，30％流动相B；

质谱条件：电喷雾离子源：ESI+模式；多反应监测：MRM模式；喷雾电压：正离子模式3000V；离子源温度320℃；脱溶剂温度270℃；鞘气：氮气，40arb；辅助气：氮气，8arb；

根据步骤3的测定条件对步骤2的待测液进行测定。

目标化合物、对应的内标物与质谱分析参数见下表1

表1目标化合物、对应的内标物与质谱分析参数

在上述色谱条件、质谱条件下，将全氟化合物的混合标准溶液与步骤2中得到的待测液依次进行测定，以标准溶液中的待测目标物响应强度峰面积为纵坐标(Y)，各组分质量浓度为横坐标(X)进行线性回归分析，得出线性回归方程、线性范围和相关系数，见表2，将待测物响应峰面积带入回归方程，以内标法计算目标物的含量。结果表明，九种全氟化合物的线性良好，相关度高，检出限为0.02～0.05μg/kg，检出限低，实验结果误差小。

表2目标化合物检测的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

选择经过测试的3份空白母乳样品继续加标回收实验，分别添加0.025μg/kg、0.25μg/kg和2.5μg/kg质量浓度的混合标准物质进行测定，每个浓度设6个平行样品。按照上述步骤1和步骤2中样品的处理方法进行处理后测定加标回收率及精密度，测定结果见表3。结果表明，该方法的样品的加标回收率、准确度和精密度高，实验结果准确，误差小，能满足对目标化合物的快速筛查，并且检测结果准确。

表3母乳样品中不同添加水平的回收率和精密度

实际样品的筛查

应用本方法筛查了120例孕9～22周妇女母乳中全氟化合物含量水平，结果显示PFOS检出率达到78.3％，平均检出值为1.16±1.07μg/kg；PFOA检出率为81.7％，平均检出值6.24±1.33μg/kg，而其余的全氟化合物的污染水平则相对较低。

进一步的，乙腈为色谱纯，乙酸铵溶液为分析纯。

进一步的，全氟化合物的标准溶液为全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟丁烷磺酸、全氟庚酸、全氟壬酸、全氟己烷磺酸、全氟癸酸、¹³C₄-全氟辛酸、¹³C₄-全氟辛烷磺酸。

进一步的，本发明使用的设备为TSQ Quantum三重四级杆串联质谱仪、戴安U3000超高效液相色谱仪、3-30KS型高速离心机、SB25-12YDTD型超声水浴锅、IKA MS3Basic型漩涡混匀器、Milli-Q超纯水机。

采用本发明的方法对母乳中全氟化合物进行检测，在简化了操作难度和步骤的同时保证了分析的灵敏度，实验准确度和精确度高，实验误差小，能对母乳中九种全氟化合物进行同时筛查，并能满足对九种全氟化合物的快速筛查。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种母乳中全氟化合物的快速筛查检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，样品提取：

取5.0g母乳样品于聚丙烯离心管中，加入内标物，漩涡混匀，混匀后离心取上清液；

步骤2，样品净化：

将步骤1离心后的上清液转移至含有QuEChERS dSPE EMR-Lipid试剂包的聚丙烯离心管中，混匀后加入5.0mL乙腈，控温离心，离心温度为25℃，离心后的上清液转移至含有高盐反萃包QuEChERS Final Polish EMR-Lipid的15mL聚丙烯离心管中，混匀后离心，取4.0mL上层乙腈层用氮气吹干，用浓度为70％含乙酸铵的乙腈溶液定容至1mL，然后用0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测液；

步骤3，液相色谱-四级杆质谱/质谱测定：

液相色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil Gold，200mm×2.1mm,1.9μm；柱温30℃；流速0.2mL/min；进样量10μL；流动相：A为10mmol/L的乙酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱；

质谱条件：电喷雾离子源：ESI+模式；多反应监测：MRM模式；喷雾电压：正离子模式3000V；离子源温度320℃；脱溶剂温度270℃；鞘气：氮气，40arb；辅助气：氮气，8arb；

根据步骤3的测定条件对步骤2的待测液进行测定。