CN112684030A - 一种富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富集净化‑液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法与应用，属于水产品质量安全检测技术领域。包括以下步骤：均质分散沉淀蛋白；涡旋离心萃取；基质增强脂质去除柱净化；液相色谱‑串联质谱检测。本发明以盐酸酸化乙腈为溶剂，采用高速均质将样品充分分散沉淀蛋白，加入氯化钠、无水硫酸镁涡旋，离心萃取，将水产品中的全氟烷酸化合物富集到上层有机相溶液中，之后上清液采用基质增强脂质去除柱进行固相萃取，净化去除干扰物，净化液经氮吹浓缩后用甲醇‑水复溶，利用液相色谱‑串联质谱多反应监测模式检测，内标法定量。该方法操作简便、定性准确，灵敏度高，能同时检测水产品中18种全氟烷酸化合物。

Description

一种富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸 化合物的方法与应用

技术领域

本发明属于水产品质量安全检测技术领域，具体涉及一种富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法与应用。

背景技术

全氟烷酸化合物(PFCs)是一类人工合成的化合物，其分子结构由不同碳链长度的疏水骨架([F(CF₂)_x])和亲水官能团羧基或磺酸基构成，主要包括全氟烷基羧酸(PFCAs)和全氟烷基磺酸(PFSAs)等。PFCs具有表面活性高、热稳定性和化学稳定性好等特点而广泛用于生产生活等领域，由于PFCs具有环境持久性、生物毒性和远距离迁移性而在多种环境介质中持续存在，并在生物体内富集。

毒理学研究表明，PFCs具有多器官毒性和疑似致癌性，通过食物链传递最终蓄积在人体肝脏、血清等组织中，对人类健康造成潜在风险。2009年，全氟辛烷磺酸(盐)被列入《斯德哥尔摩公约》优控名单；2010年欧盟发布2010/161/EU号议案，提议开展食品中PFCs的监控；2011年，欧盟发布食品中PFCs污染的调查报告，发现水产动物源性食品中PFCs残留水平明显高于陆源食品，提出要对水产动物源性食品进行PFCs常态化监控；2017年欧盟法规2017/1000将全氟辛酸(PFOA)列为限制物质，规定PFOA及其盐类含量应小于25μg/kg，PFOA相关物质总含量应小于1mg/kg。

PFCs及其相关物质检测多采用液相色谱-串联质谱法，水产品是人体PFCs的主要暴露源之一，然而由于水产品组成相对复杂，含有丰富蛋白质、脂类等基质干扰，严重影响PFCs检测的准确性和可靠性，建立便捷高效的样品前处理技术是准确监控水产品中PFCs化合物含量的首要基础。

文献报道，水产品中PFCs检测的前处理过程主要采用有机溶剂涡旋混合、震荡提取，固相萃取(SPE)或分散固相萃取净化的方法。固相萃取过程需要经过预处理、上样、洗去干扰物质、洗脱及收集分析物等步骤，消耗一定量有机溶剂及预处理时间；分散固相萃取步骤相对简单，但由于分散剂组成多样而产生不同的基质去除效果，最终影响检测结果的重复性。因此，高效快速地提取净化PFCs，并得到稳定检测结果对水产品中PFCs化合物的定量分析有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速、简便、灵敏度高的水产品中PFCs化合物的测定方法，以实现水产品中PFCs的同时定性及定量检测。

为实现以上目的，技术方案如下：

一种富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，包括以下步骤：

(1)均质分散沉淀蛋白：取水产品试样粉碎制成肉糜，放入容器中，加水涡旋混合，之后加入盐酸酸化的乙腈溶液，均质分散，分散液静置沉淀蛋白；均质器上的剩余残渣，可采用乙腈清洗并与原液混合；

(2)涡旋离心萃取：向步骤(1)所得蛋白溶液中加入氯化钠和无水硫酸镁，涡旋混合后高速离心，分离出上层乙腈溶液，加热氮吹浓缩至一定体积，得到浓缩液；

(3)基质增强脂质去除柱净化：向步骤(2)所得浓缩液中加入一定量水，涡旋混合后经过基质增强脂质去除柱过滤，容器用乙腈-水混合溶液清洗，并用基质增强脂质去除柱过滤，合并滤液，加热氮吹浓缩至一定体积，加入同位素内标混合溶液，加甲醇-水混合溶液定容；

(4)液相色谱-串联质谱检测：定容后的溶液经有机滤膜过滤后，进行液相色谱串联质谱检测，绘制标准工作曲线，以保留时间和特征离子对定性，内标法定量，根据峰面积计算全氟烷酸化合物的浓度。

进一步地，上述技术方案中，所述容器的材质中不含聚四氟乙烯成分。

进一步地，上述技术方案中，所述容器的材质为聚丙烯。

进一步地，上述技术方案中，所述全氟烷酸化合物包括全氟羧酸和全氟磺酸，所述全氟羧酸碳原子数为4～13个，全氟磺酸为全氟十二烷磺酸及碳原子数为4～10个的全氟磺酸。

进一步地，上述技术方案中，所述待测水产品样品与盐酸酸化的乙腈溶液的比例为每5g待测水产品试样中加入盐酸酸化的乙腈溶液的量为10～20mL，优选为10mL；所述盐酸酸化的乙腈溶液中盐酸占体积比为0.1～2.0％，优选为0.3％。

进一步地，上述技术方案中，每5g待测水产品试样加入1～2g氯化钠、4～6g无水硫酸镁，优选为每5g待测水产品试样加入1g氯化钠、4g无水硫酸镁；步骤(2)所述离心的速度为8000～15000r/min，离心的时间为5～10min。

进一步地，上述技术方案中，均质分散的条件为8000～12000r/min转速下均质时间≥1min。

进一步地，上述技术方案中，步骤(2)中加热氮吹浓缩至一定体积，体积为小于等于2mL，优选为2mL；步骤(3)中加热氮吹至一定体积，体积为小于等于200μL，优选为100～200μL。

进一步地，上述技术方案中，步骤(2)和步骤(3)中加热氮吹浓缩，氮吹温度为室温至45℃。

进一步地，上述技术方案中，所述向步骤(2)所得浓缩液中加入一定量水，所述乙腈-水混合溶液中乙腈与水的体积比为4:1；步骤(3)所述甲醇-水混合溶液中甲醇和水的体积比为1:1。

进一步地，上述技术方案中，所述同位素内标混合溶液为含有相同体积比的¹³C₄-全氟丁酸(MPFBA)、1,2,3,4,6-¹³C₅-全氟己酸(M5PFHxA)、¹³C₈-全氟辛酸(M8PFOA)、1,2,3,4-¹³C₄-全氟辛烷磺酸钠(MPFOS)、1,2,3,4,5,6-¹³C₆-全氟癸酸(M6PFDA)和1,2-¹³C₂-全氟十二烷酸(MPFDoA)混合液。

作为优选，步骤(4)中，

色谱条件为：采用X Terra MS C₁₈柱(100mm×2.1mm，3.5μm)分离，流动相：A相5mM醋酸铵；B相：乙腈；柱温40℃，进样体积10μL，流速0.25mL/min；梯度洗脱：0～0.5min，10％B～40％B；0.5min～8.0min，40％B～95％B；8min～15.0min，95％B；15.01min～25.0min，10％B。

质谱条件为：采用ESI^-电离模式；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：-4.0kV；干燥气流速：8L/min；干燥器温度：350℃。

本发明还提供了所述的方法在检测水产品中全氟烷酸化合物中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)沉淀蛋白过程，在样品中加入盐酸酸化乙腈后，高速均质搅拌沉淀蛋白，确保有机溶剂与样品充分接触，与常用的振荡方法相比，萃取效率高，时间短。(2)采用基质增强脂质去除柱(EMR-Lipid)净化省略了固相萃取过程的复杂步骤，操作简单，耗时短，净化效果好，有效降低酯类化合物等杂质对液相-串联质谱测定过程的干扰。

(3)采用液相色谱-串联质谱法进行多反应监测，具有较高的准确度和灵敏度。(4)本发明操作简单，准确灵敏，能同时定性和定量分析水产品中18种PFCs化合物。

附图说明

图1为PFCs化合物及对应同位素内标的总离子流图(TIC)。

图2为18种PFCs化合物的MRM色谱图。

图3为6种同位素内标化合物的MRM色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例1

1.仪器、材料及溶液配制

1.1仪器与材料

液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(6410B，美国安捷伦公司)；均质机(IKA公司)；基质增强脂质去除柱(EMR-Lipid，6mL，600mg，美国安捷伦公司)；全氟烷酸化合物标准物质(2μg/mL，1.2mL，加拿大威灵顿实验室)；全氟烷酸化合物对应系列同位素内标物质(包含¹³C₄-全氟丁酸(MPFBA)、1,2,3,4,6-¹³C₅-全氟己酸(MPFHxA)、¹³C₈-全氟辛酸(M8PFOA)、1,2,3,4-¹³C₄-全氟辛烷磺酸钠(MPFOS)、1,2,3,4,5,6-¹³C₆-全氟癸酸(M6PFDA)和1,2-¹³C₂-全氟十二烷酸(MPFDoA)的混合液)(2μg/mL，1.2mL，加拿大威灵顿实验室)。

本发明所使用的甲醇、乙腈、乙酸铵为色谱纯，其他试剂为分析纯。

本发明采用的离心管、样品瓶、试剂瓶等PFCs可接触到的材料中均不含聚四氟乙烯成分。

本发明采用的液相色谱-串联质谱系统中，在液相部分流动相混合器与六通阀之间加一根预柱，以避免系统管路中引入的PFCs干扰检测结果。

1.2标准溶液配制

PFCs混合系列标准溶液配制：将2μg/mL的全氟烷酸化合物标准物质用甲醇稀释，配成浓度依次为0.1μg/L、0.5μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的PFCs混合系列标准溶液，于-18℃环境下避光保存。

同位素内标混合溶液配制：将2μg/mL的全氟烷酸化合物对应系列同位素内标混合标准溶液用甲醇稀释，分别配制成50μg/L和5μg/L的同位素内标混合溶液，于-18℃环境下避光保存。

含有同位素内标的PFCs混合系列标准溶液配制：吸取PFCs标准物质及同位素内标混合溶液混合，用甲醇稀释配成PFCs浓度分别为0.1μg/L、0.5μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L，以及同位素内标混合溶液浓度分别为0.4μg/L和2μg/L的混合系列标准溶液，于-18℃环境下避光保存。

2.仪器条件

2.1色谱条件

色谱柱：X Terra MS C18柱(100mm×2.1mm，3.5μm)；流动相：A相5mM醋酸铵，B相乙腈，柱温40℃，进样体积10μL，流速0.25mL/min，梯度洗脱：0～0.5min，10％B～40％B；0.5min～8.0min，40％B～95％B；8min～15.0min，95％B；15.01min～25.0min，10％B。

2.2质谱条件

采用ESI-电离模式；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：-4.0kV；干燥气流速：8L/min；干燥器温度：350℃。MRM监测模式下18种PFCs和6种同位素内标化合物的液相色谱-串联质谱参数如表1。

表1目标化合物及同位素内标的多反应监测质谱参数

^*定量离子

3.实验方法

以空白黄颡鱼肉试样进行加标回收和精密度实验，以不同浓度的PFCs混合标准溶液作为回收率指示物，添加水平为全氟羧酸化合物0.4μg/kg和2μg/kg，全氟磺酸化合物2μg/kg和10μg/kg，每个添加浓度准备6个平行样，对应同位素内标分别在样品前处理完成后，定容之前加入。实验过程如下：

称取5.0g匀浆后的黄颡鱼肉试样于50mL聚丙烯离心管中，加入50μg/L的PFCs标准混合液40μL，加水5mL，涡旋混合1min；加入10mL盐酸酸化的乙腈(盐酸浓度占混合液体积比为0.3％)，10000r/min均质1min，另取2mL乙腈在10000r/min转速下均质1min以清洗均质器刀头，将清洗液及残渣转移至上述50mL离心管，静置沉淀蛋白。

加入1g氯化钠，4g无水硫酸镁，迅速混合涡旋1min，之后在10000r/min离心10min。分离上层乙腈溶液于另一个聚丙烯离心管中，在40℃水浴中氮气吹至溶液剩余2mL。

在上述2mL溶液中加0.5mL水，涡旋混合1min，上样至基质增强脂质去除柱过滤，用1mL乙腈-水的混合溶液(乙腈：水体积比为4:1)清洗残留在离心管壁上的试样，转移至同一基质增强脂质去除柱过滤，滤液在40℃水浴中氮气吹至100μL，加入50μg/L的同位素内标混合溶液40μl，加甲醇-水(甲醇：水体积比为1:1)混合溶液定容至1mL。

定容后的溶液吸入1mL注射器，经0.22μm有机滤膜过滤后，进行液相色谱串联质谱检测(色谱及质谱条件如上)，绘制标准工作曲线，以保留时间和特征离子对定性，内标法定量，根据峰面积计算PFCs的浓度。

4.结果分析

4.1分析方法线性范围及检出限

将上述18种PFCs标准混合物溶液的质量浓度设置为0.1～50μg/L，采用内标法，以待测物的质量浓度与同位素内标物质量浓度比作为横坐标，以待测物定量离子峰面积与内标物峰面积之比作为纵坐标，绘制标准曲线；此外，利用上述方法在空白黄颡鱼肉样品中加入18种PFCs的标准溶液，经过提取净化后进行仪器检测，以3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限。18种PFCs的线性方程、相关系数如表2所示。10种PFCAs的检出限和定量限分别为0.002μg/kg、0.01μg/kg；8种PFSAs的检出限和定量限分别为0.02μg/kg、0.1μg/kg。目前，我国食品安全国家标准GB 5009.253-2016《动物源性食品中全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)的测定》中PFOA和PFOS的检测限分别为0.002μg/kg和0.02μg/kg，定量限分别为0.01μg/kg和0.1μg/kg，因此，本方法建立的PFCs检测方法符合国内检测的要求，并且满足同时检测多种PFCs化合物的要求。

表2线性方程及相关系数

4.2方法回收率和精密度结果

以空白黄颡鱼为样品基质，分别在0.4μg/kg、2μg/kg(全氟羧酸，PFCAs)和2μg/kg、10μg/kg(全氟磺酸，PFSAs)含量水平上添加PFCs的混合标准溶液，按上述方法测定并计算回收率，每个添加水平测定6个平行样品，利用上述实验方法进行回收率实验。结果如表3和表4，显示在空白黄颡鱼样品中PFCs的回收率在70.9％～119.8％之间，相对标准偏差(RSD)小于15％。以上实验结果表明本检测方法的回收率高，结果可靠，适用于水产品中18种PFCs的同时检测。

表3黄颡鱼中18种PFCAs化合物的添加回收率和精密度(n＝6)

表4黄颡鱼中18种PFSAs化合物的添加回收率和精密度(n＝6)

Claims (10)

1.一种富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)均质分散沉淀蛋白：将水产品试样粉碎制成肉糜，放入容器中，加水涡旋混合，之后加入盐酸酸化的乙腈溶液，均质分散，分散液静置沉淀蛋白；

(2)涡旋离心萃取：向步骤(1)所得蛋白溶液中加入氯化钠和无水硫酸镁，涡旋混合后高速离心，分离出上层乙腈溶液，加热氮吹浓缩至一定体积，得到浓缩液；

(3)基质增强脂质去除柱净化：向步骤(2)所得浓缩液中加入一定量水，涡旋混合后经过基质增强脂质去除柱过滤，容器用乙腈-水混合溶液清洗，并用基质增强脂质去除柱过滤，合并滤液，加热氮吹浓缩至一定体积，加入同位素内标混合溶液，加甲醇-水混合溶液定容；

(4)液相色谱-串联质谱检测：定容后的溶液经有机滤膜过滤后，进行液相色谱串联质谱检测，绘制标准工作曲线，以保留时间和特征离子对定性，内标法定量，根据峰面积计算全氟烷酸化合物的浓度。

2.根据权利要求1所述富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，其特征在于，所述容器的材质中不含聚四氟乙烯成分。

3.根据权利要求1所述富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，其特征在于，所述全氟烷酸化合物包括全氟羧酸和全氟磺酸，所述全氟羧酸碳原子数为4～13个，全氟磺酸为全氟十二烷磺酸及碳原子数为4～10个的全氟磺酸。

4.根据权利要求1所述富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，其特征在于，每5g待测水产品试样中加入盐酸酸化的乙腈溶液的量为10～20mL；所述盐酸酸化的乙腈溶液中盐酸占体积比为0.1～2.0％；每5g待测水产品试样加入1～2g氯化钠、4～6g无水硫酸镁；步骤(2)所述离心的速度为8000～15000r/min，离心的时间为5～10min。

5.根据权利要求1所述富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，其特征在于，均质分散的条件为8000-12000r/min转速下均质。

6.根据权利要求1所述富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中加热氮吹浓缩至一定体积，体积为小于等于2mL；步骤(3)中加热氮吹至一定体积，体积为小于等于200μL。

7.根据权利要求1所述富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中加热氮吹浓缩，氮吹温度为室温至45℃。

8.根据权利要求1所述富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，其特征在于，所述向步骤(2)所得浓缩液中加入一定量水，所述乙腈-水混合溶液中乙腈与水的体积比为4:1；步骤(3)所述甲醇-水混合溶液中甲醇和水的体积比为1：1。

9.根据权利要求1所述富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法，其特征在于，所述同位素内标混合溶液为含有相同体积比的¹³C₄-全氟丁酸(MPFBA)、1,2,3,4,6-¹³C₅-全氟己酸(M5PFHxA)、¹³C₈-全氟辛酸(M8PFOA)、1,2,3,4-¹³C₄-全氟辛烷磺酸钠(MPFOS)、1,2,3,4,5,6-¹³C₆-全氟癸酸(M6PFDA)和1,2-¹³C₂-全氟十二烷酸(MPFDoA)混合液。

10.权利要求1-9中任一项所述的方法在检测水产品中全氟烷酸化合物中的应用。

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