CN107462650B

CN107462650B - 人体尿液中环境激素的检测方法

Info

Publication number: CN107462650B
Application number: CN201710732409.6A
Authority: CN
Inventors: 童鸿斌; 黎伦智
Original assignee: Hangzhou Health Bank Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Hangzhou Health Bank Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2017-08-23
Filing date: 2017-08-23
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2037-08-23
Also published as: CN107462650A

Abstract

本发明提供了一种人体尿液中环境激素的检测方法，涉及环境激素检测技术领域，该检测方法将人体尿液与含有环境激素同位素内标的内标液混合，随后对混合液依次进行有机溶剂萃取和反相SPE净化，上述处理方法可使得人体尿液中各个组分充分溶出，使得检测结果的准确性和稳定性大大提高。同时，上述检测方法采用了液相分离和质谱分析联用的检测方法，实现对人体尿液中环境激素的定性和定量分析，具有灵敏度高、精度高、检测速度快及检测成本低的优点，该检测方法适用于人体尿液中的15种环境激素检测，并能对上述15种环境激素同步进行批量检测，充分满足了实际检测的需要，具有较高的应用价值。

Description

人体尿液中环境激素的检测方法

技术领域

本发明涉及环境激素检测技术领域，尤其是涉及一种人体尿液中环境激素的检测方法。

背景技术

环境激素是指环境中存在的一些干扰生物体内分泌的化学物质。其能被生物体吸收，并且会通过食物链不断富集，导致人与动物的生殖系统、内分泌系统、神经系统、免疫系统等出现多种病变、癌变、畸变。近几年来，国内外在研究食品中环境激素方面比较成熟，但关于环境激素人体暴露水平的研究较少。

现有的环境激素的分析检测还没有统一的标准技术方法。同时，人体体液中环境激素类污染物通常是以ppt级甚至是ppb级存在，对于监测分析的技术要求较高。现有的人体尿液中环境激素的检测方法往往存在检测速度慢、检测成本高、无法进行批量检测的缺点。

因此，研究开发一种环境激素在人体中暴露水平的检测方法，该方法具有检测速度快、检测成本低，可以进行批量检测的优点，能很好的对环境激素在人体中的暴露水平进行检测，具有非常好的科研和商业应用前景。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种人体尿液中环境激素的检测方法，所述检测方法具有检测速度快、检测成本低，可以进行批量检测的优点，能很好的对环境激素在人体中的暴露水平进行检测。

本发明提供的一种人体尿液中环境激素的检测方法，包括如下步骤：

(1)将人体尿液与含有环境激素同位素内标的内标液混合，随后对混合液依次进行有机溶剂萃取和反相SPE净化得到待测样本；

(2)将所述待测样本通过液质联用检测，得到环境激素的种类和含量。

进一步的，上述内标液是通过将环境激素同位素内标溶于低碳醇溶液并定容制得。

更进一步的，所述低碳醇溶液为甲醇溶液。

进一步的，上述步骤(1)中有机溶剂萃取的溶剂为乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基甲醚中的一种。

更进一步的，所述有机溶剂萃取的溶剂为乙酸乙酯。

进一步的，上述步骤(1)中反相SPE的洗脱溶剂为甲醇。

进一步的，上述步骤(2)具体包括如下步骤：

步骤(a)：称取环境激素标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；

步骤(b)：称取上述甲醇定容后的内标液，随后将内标液分别加入步骤(a)得到的标准液中，超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；

步骤(c)：将步骤(b)得到的待测标准液和上述步骤(1)得到的待测样本通过液质联用检测，得到环境激素的种类和含量。

进一步的，上述步骤(c)液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为乙酸铵水溶液，B为乙腈甲醇混合溶液，流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：

0～3min，A：30～100％、B：70～0％；

3.1～5min，A：10～60％、B：90～60％；

5.1～7min，A：0～50％、B：100～50％；

7.1～9min，A：50～100％、B：50～0％；

9.1min，A：30～100％、B：70～0％。

更进一步的，上述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为(50～100)mm×(1.8～3)mm，(1.8～3)μm。

更进一步的，液相色谱条件中，流动相A为5～10mmol/L的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇两者的质量比为9～1：1～9。

进一步的，所述步骤(c)中液质联用检测的质谱条件为：采用ESI离子源，负离子MRM扫描，雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～20L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2000～4500V，离子源温度：200～400℃。

进一步的，所述环境激素包括邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、双酚A、对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、17α-乙炔基雌二醇、双酚B、己烯雌酚、对羟基苯甲酸丁酯、4-辛基酚和壬基苯酚。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的人体尿液中环境激素的检测方法将人体尿液与含有环境激素同位素内标的内标液混合，随后对混合液依次进行有机溶剂萃取和反相SPE净化，上述处理方法可使得人体尿液中各个组分充分溶出，从而真实地反应待测样品中环境激素的情况，使得检测结果的准确性和稳定性大大提高。

(2)本发明提供的人体尿液中环境激素的检测方法，采用了液相分离和质谱分析联用的检测方法，实现对人体尿液中环境激素的定性和定量分析，具有灵敏度高、精度高、检测速度快及检测成本低的优点。

(3)本发明提供的人体尿液中环境激素的检测方法适用于人体尿液中的15种环境激素检测，并能对上述15种环境激素同步进行批量检测，充分满足了实际检测的需要，具有较高的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1提供的检测谱图。

图1中各数字表示的组分为：1、邻苯二甲酸单甲基酯(MMP)；2、邻苯二甲酸单乙基酯(MEP)；3、邻苯二甲酸单丁基酯(MBP)；4、邻苯二甲酸单苄基酯(MBzP)；5、对羟基苯甲酸甲酯(MP)；6、对羟基苯甲酸乙酯(EP)；7、双酚A(BPA)；8、对羟基苯甲酸丙酯(PP)；9、邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)；10、17α-乙炔基雌二醇(EE2)；11、双酚B(BPB)；12、己烯雌酚(DES)；13、对羟基苯甲酸丁酯(BP)；14、4-辛基酚(4-OP)；15、壬基苯酚(NP)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，一种人体尿液中环境激素的检测方法，包括如下步骤：

本发明人体尿液中环境激素的检测方法将人体尿液与含有环境激素同位素内标的内标液混合，随后对混合液依次进行有机溶剂萃取和反相SPE净化，上述处理方法可使得人体尿液中各个组分充分溶出，从而真实地反应待测样品中环境激素的情况，使得检测结果的准确性和稳定性大大提高。同时，上述检测方法采用了液相分离和质谱分析联用的检测方法，实现对人体尿液中环境激素的定性和定量分析，具有灵敏度高、精度高、检测速度快及检测成本低的优点，该检测方法适用于人体尿液中的15种环境激素检测，并能对上述15种环境激素同步进行批量检测，充分满足了实际检测的需要，具有较高的应用价值。本发明检测方法实现了对多组分内分泌干扰物环境激素的浓缩富集、定性、定量分析，能够高效、高通量、高重复性的检测尿液中环境激素，具有检测速度快、检测成本低，可以进行批量检测的优点，为环境激素人体暴露水平的分析及监控提供了科学、准确、快速的检测方法。

在本发明的一种优选实施方式中，上述内标液是通过将环境激素同位素内标溶于低碳醇溶液并定容制得。

在上述优选实施方式中，上述低碳醇溶液为甲醇溶液。

作为一种优选的实施方式，环境激素同位素内标溶于甲醇溶液制得内标液，同位素内标具有易被色谱柱分离、不易受干扰的特点，更利于后续测量时进行定量分析。

在本发明的一种优选实施方式中，上述步骤(1)中有机溶剂萃取的溶剂为乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基甲醚中的一种。

在上述优选实施方式中，上述有机溶剂萃取的溶剂为乙酸乙酯。

优选的，在萃取前对混合液进行预处理，具体的方法为：取0.1～3mL尿液于15mL玻璃试管中，并加入含内标甲醇溶液，然后加入50～500μL1～20mmol/L乙酸铵调PH至3.0～7.0，之后加入5～50μLβ-葡萄糖醛酸苷酶混匀，于20～50℃水浴振荡30～150min，取出冷却至室温，加1～20μL甲酸调PH至1.0～5.0。

优选的，步骤(1)中乙酸乙酯萃取的方法为用1～15mL乙酸乙酯萃取，1000～5000r/min离心1～30min后取上清于另一离心管中，下层液体用5～50μL氨水调PH至7.0～12.0，再用1～15mL乙酸乙酯萃取一次，合并上清液，于20～60℃水浴并干燥。

更优选的，所述萃取后干燥的方法为氮气吹干。

在本发明的一种优选实施方式中，上述步骤(1)中反相SPE净化的洗脱溶剂为甲醇。

优选的，所述反相SPE净化的方法为：SPE类柱子如HLB固相萃取柱使用前用1～20mL甲醇、1～20mL水活化，

将上述复溶液转移至小柱中，样品过柱后，分别用1～20mL水、1～20mL 5％甲醇淋洗小柱，然后抽干小柱，用1～20mL甲醇洗脱，收集洗脱液20～60℃水浴氮气吹干，用甲醇定容至1～5.0mL，混匀10000～18000r/min离心，取上清液质联用检测分析。

在本发明的一种优选实施方式中，上述步骤(2)具体包括如下步骤：

步骤(a)：称取环境激素标准品，用甲醇溶解，得到标准液；

步骤(b)：称取上述的甲醇定容后的内标液，随后将内标液分别加入步骤(a)得到的标准液中，超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；

作为一种优选的实施方式，本发明提供的检测方法采用内标法对尿液中的环境激素的含量进行检测。在检测过程中，配置待测标准液和检测液，使用液相分离-质谱联用检测仪进行检测，以各环境激素的峰面积与环境激素同位素内标的峰面积之比对尿液样本中各激素的浓度进行线性回归，得到各环境激素的线性方程，从而对血液中各环境激素进行定量检测。

在上述优选实施方式中，上述步骤(c)液质联用检测的液相色谱条件为：

0～3min，A：30～100％、B：70～0％；

3.1～5min，A：10～60％、B：90～60％；

5.1～7min，A：0～50％、B：100～50％；

7.1～9min，A：50～100％、B：50～0％；

9.1min，A：30～100％、B：70～0％。

在上述优选实施方式中，上述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为(50～100)mm×(1.8～3)mm，(1.8～3)μm。

在上述优选实施方式中，液相色谱条件中，流动相A为5～10mmol/L的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇两者的质量比为9～1：1～9。

优选的，上述乙腈甲醇的混合溶液两者的质量比为7～3：3～7。

更优选的，上述乙腈甲醇的混合溶液两者的质量比为6：4。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(c)中液质联用检测的质谱条件为：采用ESI离子源，负离子MRM扫描，雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～20L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2000～4500V，离子源温度：200～400℃。

在本发明的一种优选实施方式中，所述环境激素包括邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、双酚A、对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、17α-乙炔基雌二醇、双酚B、己烯雌酚、对羟基苯甲酸丁酯、4-辛基酚和壬基苯酚。

本发明检测方法分析速度快，能在9min内完成所有环境激素的检测。在该实验条件下，尿液基质下15种环境激素及其相应内标能完全达到基线分离，选择性特异性好，能准确的对各化合物进行定性定量。

以下结合实施例对本发明的血液中激素的检测方法作进一步的详细描述。

实施例1

(一)仪器和材料：

美国AB Sciex串联质谱仪；

Angilent 1290液相色谱仪；

Agilent C18柱(2.1×50mm，1.8μm)；

ThermoFisher高速台式冷冻离心机；

SCANSPEED冻干机；

Waters Oasis HLB固相萃取小柱(60mg/3mL)。

(二)药品与试剂：

环境激素标准品：邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、双酚A、对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、17α-乙炔基雌二醇、双酚B、己烯雌酚、对羟基苯甲酸丁酯、4-辛基酚和壬基苯酚

甲酸：色谱纯(MERCK公司)；

乙腈、甲醇：色谱纯(MERCK公司)；

乙酸铵：分析纯购买自国药集团(上海)；

双蒸水：Thermo公司；

尿样：志愿者尿液。

(三)检测用溶液

对照品储备液：15种环境激素标准品先分别配成100～1000μg/mL的甲醇溶液，再混合成各标准品浓度为5～10μg/mL混合储备液。

内标液：取适量同位素内标用甲醇溶解并稀释为5～10μg/mL的储备液，再用甲醇稀释至含量为0.01～0.1μg/mL的内标工作溶液。

待测标准液：分别精取一定体积的混合储备液，分别加入20μL内标液，用甲醇稀释至浓度为1、2、5、10、20、25、50ng/mL的待测标准液，

(四)待测样本(待测定环境激素含量的样品溶液)的制备

1、配制内标液混合

取0.1～3mL尿液于15mL玻璃试管中，并加入含内标甲醇溶液，然后加入50～500μL1～20mmol/L乙酸铵调PH至3.0～7.0，之后加入5～50μLβ-葡萄糖醛酸苷酶混匀，于20～50℃水浴振荡30～150min，取出冷却至室温，加1～20μL甲酸调PH至1.0～5.0。

2、有机溶剂萃取

用1～15mL乙酸乙酯萃取，1000～5000r/min离心1～30min后取上清于另一离心管中，下层液体用5～50μL氨水调PH至7.0～12.0，再用1～15mL乙酸乙酯萃取一次，合并上清液，于20～60℃水浴氮气吹至近干，用1～20mmol/L乙酸铵:乙腈甲醇溶液(1:1～15:1)复溶并定容至0.2～5.0mL，得到待净化萃取液。

3、反相SPE净化

HLB固相萃取柱使用前用1～20mL甲醇、1～20mL水活化，将上述复溶液转移至小柱中，样品过柱后，分别用1～20mL水、1～20mL 5％甲醇淋洗小柱，然后抽干小柱，用1～20mL甲醇洗脱，收集洗脱液20～60℃水浴氮气吹干，用甲醇定容至1～5.0mL，混匀10000～18000r/min离心，制得待测样本。

(五)液质联用检测

将制得的待测标准液和待测样本进样至液相色谱-质联用仪中进行检测。其中，液相色谱的条件为：

流动相：A相为含有10mmol/L的乙酸铵水溶液，B相为乙腈甲醇(6:4)的混合溶液，流速为0.3mL/min。

梯度(以体积百分比计)：

0～3min，A：30～100％、B：70～0％；

3.1～5min，A：10～60％、B：90～60％；

5.1～7min，A：0～50％、B：100～50％；

7.1～9min，A：50～100％、B：50～0％；

9.1min，A：30～100％、B：70～0％。

色谱柱：Agilent C18柱(2.1×50mm，1.8μm)；进样量：5μL。

其中，质谱的条件为：

采用ESI离子源，负离子MRM扫描，

雾化气流速：5～10L/min，

气帘气流速：5～10L/min，

碰撞气流速：5～10L/min，

离子源电压：～4500V，

离子源温度：400℃。

(六)检测结果

将待测标准液中检测到的各环境激素的峰面积与内标峰面积之比(Y)对标准工作中中各环境激素的浓度(X)进行线性回归，得到各环境激素的线性方程。其结果如表1所示。

表1：检测得到的15种环境激素的线性方程

其检测结果如图1所示，图1中各数字表示的组分为：1、邻苯二甲酸单甲基酯(MMP)；2、邻苯二甲酸单乙基酯(MEP)；3、邻苯二甲酸单丁基酯(MBP)；4、邻苯二甲酸单苄基酯(MBzP)；5、对羟基苯甲酸甲酯(MP)；6、对羟基苯甲酸乙酯(EP)；7、双酚A(BPA)；8、对羟基苯甲酸丙酯(PP)；9、邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)；10、17α-乙炔基雌二醇(EE2)；11、双酚B(BPB)；12、己烯雌酚(DES)；13、对羟基苯甲酸丁酯(BP)；14、4-辛基酚(4-OP)；15、壬基苯酚(NP)

实施例2

本发明提供的检测方法的重现性分析，即回收率测试。

取一定体积的待测标准液并加入20μL内标液，并用甲醇溶液补足到1ml，供液质联用分析。检测过程中的液质联用的液相色谱、质谱条件均与上述实施例1的检测待测标准液和检测液的条件相同。

将通过新鲜尿液中添加标准液按实验预处理步骤处理后的检测结果中环境激素的峰面积与环境激素同位素内标的峰面积之比进行比较，计算得加标回收率，计算出的加标回收率为80.3～105.1％，平行测定六次，结果相对标准偏差2.0％～9.8％，表明本发明检测方法的重现性较好。

本发明检测方法精密度准确度分析(日内差日间差分析)

在同实施例1相同的液相色谱质谱条件下，取不同体积的混合标准品储备液进行检测，1天内连续进样6次，连续进样5天，结果日内CV在1.52％～4.85％波动，日间CV在3.68％～9.89％波动，符合要求。

由上述结果可以，本发明提供的尿液中环境激素的检测方法，环境激素的回收率稳定性满足定量要求，检测的结果可以真实反应尿液中的环境激素含量和种类。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种人体尿液中环境激素的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

(2)将所述待测样本通过液质联用检测，得到环境激素的种类和含量；

所述步骤(1)中内标液是通过将环境激素同位素内标溶于低碳醇溶液并定容制得；

所述步骤(2)具体包括如下步骤：

步骤(b)：称取甲醇定容后的内标液，随后将内标液分别加入步骤(a)得到的标准液中，超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；

步骤(c)：将步骤(b)得到的待测标准液和步骤(1)得到的待测样本通过液质联用检测，得到环境激素的种类和含量；

所述步骤(c)液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为乙酸铵水溶液，B为乙腈甲醇混合溶液，流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度，以体积百分比计：

0～3min，A：30～100％、B：70～0％；

3.1～5min，A：10～60％、B：90～40％；

5.1～7min，A：0～50％、B：100～50％；

7.1～9min，A：50～100％、B：50～0％；

9.1min，A：30％、B：70％；

所述键合相色谱柱为C18或C8键合相色谱柱，规格为(50～100)mm×(1.8～3)mm，(1.8～3)μm；

所述液相色谱条件中，流动相A为5～10mmol/L的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇两者的质量比为9～1：1～9；

所述步骤(c)中液质联用检测的质谱条件为：采用ESI离子源，负离子MRM扫描，雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～20L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2000～4500V，离子源温度：200～400℃；

所述环境激素包括邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、双酚A、对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、17α-乙炔基雌二醇、双酚B、己烯雌酚、对羟基苯甲酸丁酯、4-辛基酚和壬基苯酚。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述低碳醇溶液为甲醇溶液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中有机溶剂萃取的溶剂为乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基甲醚中的一种。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述有机溶剂萃取的溶剂为乙酸乙酯。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中反相SPE的洗脱溶剂为甲醇。