JP2003075422A - 生体試料中の内分泌撹乱物質類の分析方法及び分析装置 - Google Patents
生体試料中の内分泌撹乱物質類の分析方法及び分析装置Info
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- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
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- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
- B01J20/261—Synthetic macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon to carbon unsaturated bonds
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- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/282—Porous sorbents
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- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
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- G01N30/72—Mass spectrometers
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血液あるいは母乳等の生体内試料について、
多様な内分泌撹乱物質類を迅速かつ自動的に分析するた
めの分析システムの提供。 【解決手段】 ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
カラムとガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／Ｍ
Ｓ）とをライン切替え手段を介してオンラインで接続
し、内分泌撹乱物質類を含む生体試料液をＧＰＣにかけ
て高分子量成分と水分とを除去した低分子量画分をライ
ン中に蓄積した後、一時にＧＣ／ＭＳに導入して自動分
析することを特徴とする生体試料中の内分泌撹乱物質類
の分析方法及び装置。
多様な内分泌撹乱物質類を迅速かつ自動的に分析するた
めの分析システムの提供。 【解決手段】 ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
カラムとガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／Ｍ
Ｓ）とをライン切替え手段を介してオンラインで接続
し、内分泌撹乱物質類を含む生体試料液をＧＰＣにかけ
て高分子量成分と水分とを除去した低分子量画分をライ
ン中に蓄積した後、一時にＧＣ／ＭＳに導入して自動分
析することを特徴とする生体試料中の内分泌撹乱物質類
の分析方法及び装置。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体試料中の外因
性内分泌撹乱物質（いわゆる環境ホルモン）及びその他
の内分泌撹乱作用が疑わしい物質（以下、これらをまと
めて「内分泌撹乱物質類」と言う。）の分析方法及び分
析装置に関する。さらに詳しく言えば、１種以上の内分
泌撹乱物質類を含有する生体試料について、迅速かつ自
動的に各物質の同定と定量を行う分析方法及び分析装置
に関する。
性内分泌撹乱物質（いわゆる環境ホルモン）及びその他
の内分泌撹乱作用が疑わしい物質（以下、これらをまと
めて「内分泌撹乱物質類」と言う。）の分析方法及び分
析装置に関する。さらに詳しく言えば、１種以上の内分
泌撹乱物質類を含有する生体試料について、迅速かつ自
動的に各物質の同定と定量を行う分析方法及び分析装置
に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、内分泌撹乱物質類の健康への影響
が強い社会的関心を集めている。内分泌撹乱物質類は、
外因性の内分泌撹乱物質及び内分泌撹乱作用が疑わしい
物質の総称であり、ダイオキシン、ＰＣＢ（ポリ塩化ビ
フェニル）、フタル酸エステル類、ビスフェノールＡ、
一部の有機塩素系農薬、界面活性剤、女性ホルモン様物
質、ＰＡＨ（Polycyclic Aromatic Hydrocarbon 多環芳
香族炭化水素類）、有機スズ化合物等が含まれる。
が強い社会的関心を集めている。内分泌撹乱物質類は、
外因性の内分泌撹乱物質及び内分泌撹乱作用が疑わしい
物質の総称であり、ダイオキシン、ＰＣＢ（ポリ塩化ビ
フェニル）、フタル酸エステル類、ビスフェノールＡ、
一部の有機塩素系農薬、界面活性剤、女性ホルモン様物
質、ＰＡＨ（Polycyclic Aromatic Hydrocarbon 多環芳
香族炭化水素類）、有機スズ化合物等が含まれる。
【０００３】一般にこれらの物質は、体内での蓄積性が
高く継続的な曝露により生殖機能や成長過程に影響を及
ぼす。特に、胎児期から成長期におけるこれら化学物質
の曝露が問題となる。そこで、これらの化学物質の胎児
期から成長期における毒性評価をするため、生体試料に
おける内分泌撹乱物質類の分析、殊に、母体から血液あ
るいは母乳を通しての胎児及び乳児への暴露量を把握す
ることが重要な課題となる。また、微少量でも影響を及
ぼす可能性があること、及び、影響を及ぼす機構が十分
に解明されていないということもあり、可能な限り高感
度の分析が望まれている。
高く継続的な曝露により生殖機能や成長過程に影響を及
ぼす。特に、胎児期から成長期におけるこれら化学物質
の曝露が問題となる。そこで、これらの化学物質の胎児
期から成長期における毒性評価をするため、生体試料に
おける内分泌撹乱物質類の分析、殊に、母体から血液あ
るいは母乳を通しての胎児及び乳児への暴露量を把握す
ることが重要な課題となる。また、微少量でも影響を及
ぼす可能性があること、及び、影響を及ぼす機構が十分
に解明されていないということもあり、可能な限り高感
度の分析が望まれている。
【０００４】しかし、内分泌撹乱物質類は特定の構造的
特徴を有する物質ではなく、その由来も、焼却灰、産業
廃棄物、工業原料、廃ガス、天然物質や医薬品、船舶用
塗料など様々である。このため、従来知られている内分
泌撹乱物質類の分析法は、各化学物質ごとの個別分析法
がほとんどであり、しかも、多大な作業、時間、有機溶
媒等を必要とする非常に煩雑な作業である。また、内分
泌撹乱物質類は一般に脂溶性で生体試料では脂肪中に溶
解して存在しているが、分析に際しては、この脂肪分の
分離除去が大きな問題となる。
特徴を有する物質ではなく、その由来も、焼却灰、産業
廃棄物、工業原料、廃ガス、天然物質や医薬品、船舶用
塗料など様々である。このため、従来知られている内分
泌撹乱物質類の分析法は、各化学物質ごとの個別分析法
がほとんどであり、しかも、多大な作業、時間、有機溶
媒等を必要とする非常に煩雑な作業である。また、内分
泌撹乱物質類は一般に脂溶性で生体試料では脂肪中に溶
解して存在しているが、分析に際しては、この脂肪分の
分離除去が大きな問題となる。
【０００５】多数の内分泌撹乱物質類を効率的に分析す
るため、１種類以上の内分泌撹乱物質類を同時に自動分
析する分析システムの検討も進められている。例えば、
特開2001-83128には、硫酸含浸シリカゲルを通して脂肪
等を分解し、さらにシリカゲルを充填したトラップカラ
ムを通してこれらの分解物を除去し、高速液体クロマト
グラフィーで分画し分析手段に送るコプラナＰＣＢ類の
簡易測定装置が記載されている。また、特開2001-83129
には、含浸薬剤を複数組み合わせた多層シリカゲルを通
して脂肪等を分解し、トラップカラムでこれらの分解物
を除去し、高速液体クロマトグラフィーで分画し分析手
段に送るダイオキシン類の簡易測定装置が記載されてい
る。しかし、これらの方法では、硫酸やアルカリ等で分
解されない化学的に安定な化合物の分析しかできない
上、分解生成物を吸着したトラップカラムの再生処理が
必要である。
るため、１種類以上の内分泌撹乱物質類を同時に自動分
析する分析システムの検討も進められている。例えば、
特開2001-83128には、硫酸含浸シリカゲルを通して脂肪
等を分解し、さらにシリカゲルを充填したトラップカラ
ムを通してこれらの分解物を除去し、高速液体クロマト
グラフィーで分画し分析手段に送るコプラナＰＣＢ類の
簡易測定装置が記載されている。また、特開2001-83129
には、含浸薬剤を複数組み合わせた多層シリカゲルを通
して脂肪等を分解し、トラップカラムでこれらの分解物
を除去し、高速液体クロマトグラフィーで分画し分析手
段に送るダイオキシン類の簡易測定装置が記載されてい
る。しかし、これらの方法では、硫酸やアルカリ等で分
解されない化学的に安定な化合物の分析しかできない
上、分解生成物を吸着したトラップカラムの再生処理が
必要である。
【０００６】ガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／
ＭＳ）を用いた内分泌撹乱物質類の分析方法も種々提案
されている（例えば、特開2000-65814、特開2000-88825
等）。しかし、上述の通り、内分泌撹乱物質類は脂溶性
であり、内分泌撹乱物質類を含む生体試料には、脂肪や
脂溶性の高分子量成分（例えば、色素等）が高濃度で含
まれている。このため、上記各例で挙げたような硫酸や
アルカリ等による化学分解工程が必要であるなど前処理
工程が複雑であり、迅速な自動分析化は困難であった。
ＭＳ）を用いた内分泌撹乱物質類の分析方法も種々提案
されている（例えば、特開2000-65814、特開2000-88825
等）。しかし、上述の通り、内分泌撹乱物質類は脂溶性
であり、内分泌撹乱物質類を含む生体試料には、脂肪や
脂溶性の高分子量成分（例えば、色素等）が高濃度で含
まれている。このため、上記各例で挙げたような硫酸や
アルカリ等による化学分解工程が必要であるなど前処理
工程が複雑であり、迅速な自動分析化は困難であった。
【０００７】一方、本発明者らはＧＰＣ（Gel Permeati
on Chromatography：ゲル浸透クロマトグラフィー）カ
ラムを利用し、血液中の有機リン系農薬をＧＣ／ＭＳで
分析する方法を発表している（北川幹也ほか「オンライ
ンＧＰＣ−ＧＣ／ＭＳによる血中農薬の迅速分析」日本
鑑識科学技術学会第５回学術集会（平成１１年１１月１
１〜１２日））。しかし、多様な構造を有する内分泌撹
乱物質類を同時に、迅速に、自動的に分析できる分析シ
ステムは、従来、知られていない。
on Chromatography：ゲル浸透クロマトグラフィー）カ
ラムを利用し、血液中の有機リン系農薬をＧＣ／ＭＳで
分析する方法を発表している（北川幹也ほか「オンライ
ンＧＰＣ−ＧＣ／ＭＳによる血中農薬の迅速分析」日本
鑑識科学技術学会第５回学術集会（平成１１年１１月１
１〜１２日））。しかし、多様な構造を有する内分泌撹
乱物質類を同時に、迅速に、自動的に分析できる分析シ
ステムは、従来、知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、血液あるい
は母乳等の生体試料について、多様な内分泌撹乱物質類
を迅速かつ自動的に分析するための分析システムを提供
することを目的とする。
は母乳等の生体試料について、多様な内分泌撹乱物質類
を迅速かつ自動的に分析するための分析システムを提供
することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成すべく鋭意研究した結果、ＧＰＣカラムとＧＣ／
ＭＳとの組み合わせにより多様な内分泌撹乱物質類の分
析が簡便に高精度に行い得ること、特に、特定種類のＧ
ＰＣカラムとＧＣ／ＭＳとをオンラインで接続すること
により、多様な内分泌撹乱物質類を同時に、迅速かつ自
動的に分析できる分析システムが実現されることを見出
し、本発明を完成するに至った。
を達成すべく鋭意研究した結果、ＧＰＣカラムとＧＣ／
ＭＳとの組み合わせにより多様な内分泌撹乱物質類の分
析が簡便に高精度に行い得ること、特に、特定種類のＧ
ＰＣカラムとＧＣ／ＭＳとをオンラインで接続すること
により、多様な内分泌撹乱物質類を同時に、迅速かつ自
動的に分析できる分析システムが実現されることを見出
し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、本発明は以下の分析方法及び分
析装置を提供する。 １． ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラムと
ガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／ＭＳ）とライ
ン切替え手段を介してオンラインで接続し、内分泌撹乱
物質類を含む生体試料液をＧＰＣカラムにかけて高分子
量成分と水分とを除去した低分子量画分をライン中に蓄
積した後、一時にＧＣ／ＭＳに導入して自動分析するこ
とを特徴とする生体試料中の内分泌撹乱物質類の分析方
法。 ２． ＧＰＣカラムにより生体試料液中の脂肪分、色素
及び水分を除去する前項１に記載の内分泌撹乱物質類の
分析方法。 ３． ＧＰＣカラムがポリビニルアルコール系ハードゲ
ル充填カラムまたはポリスチレン系ハードゲル充填カラ
ムである前項１または２に記載の内分泌撹乱物質類の分
析方法。
析装置を提供する。 １． ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラムと
ガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／ＭＳ）とライ
ン切替え手段を介してオンラインで接続し、内分泌撹乱
物質類を含む生体試料液をＧＰＣカラムにかけて高分子
量成分と水分とを除去した低分子量画分をライン中に蓄
積した後、一時にＧＣ／ＭＳに導入して自動分析するこ
とを特徴とする生体試料中の内分泌撹乱物質類の分析方
法。 ２． ＧＰＣカラムにより生体試料液中の脂肪分、色素
及び水分を除去する前項１に記載の内分泌撹乱物質類の
分析方法。 ３． ＧＰＣカラムがポリビニルアルコール系ハードゲ
ル充填カラムまたはポリスチレン系ハードゲル充填カラ
ムである前項１または２に記載の内分泌撹乱物質類の分
析方法。
【００１１】４． ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰ
Ｃ）カラム（１）、キャリア（溶離液）をＧＰＣカラム
に注入する手段（Ｐ1）、キャリア注入手段（Ｐ1）とＧ
ＰＣカラム（１）とをつなぐ流路上に設けられた試料導
入部（２）、ＧＰＣカラム（１）の排出部に接続され必
要とするＧＰＣ画分を試料蓄積部（４）に導くための流
路切替え手段（３）、試料蓄積部（４）に蓄積されたＧ
ＰＣ画分をガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／Ｍ
Ｓ）に導入する手段（Ｐ2）及びＧＣ／ＭＳ（５）を有
するオンラインＧＰＣ−ＧＣ／ＭＳ装置において、ＧＰ
Ｃカラムがポリビニルアルコール系ハードゲル充填カラ
ムまたはポリスチレン系ハードゲル充填カラムであり、
内分泌撹乱物質類を含む生体試料液からＧＰＣカラム
（１）によって高分子量成分と水分とを除去した低分子
量画分を試料蓄積部（４）に蓄積し、これをＧＣ／ＭＳ
（５）に一時に注入することにより試料中の内分泌撹乱
物質類の同定と定量を行う内分泌撹乱物質類分析装置。
Ｃ）カラム（１）、キャリア（溶離液）をＧＰＣカラム
に注入する手段（Ｐ1）、キャリア注入手段（Ｐ1）とＧ
ＰＣカラム（１）とをつなぐ流路上に設けられた試料導
入部（２）、ＧＰＣカラム（１）の排出部に接続され必
要とするＧＰＣ画分を試料蓄積部（４）に導くための流
路切替え手段（３）、試料蓄積部（４）に蓄積されたＧ
ＰＣ画分をガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／Ｍ
Ｓ）に導入する手段（Ｐ2）及びＧＣ／ＭＳ（５）を有
するオンラインＧＰＣ−ＧＣ／ＭＳ装置において、ＧＰ
Ｃカラムがポリビニルアルコール系ハードゲル充填カラ
ムまたはポリスチレン系ハードゲル充填カラムであり、
内分泌撹乱物質類を含む生体試料液からＧＰＣカラム
（１）によって高分子量成分と水分とを除去した低分子
量画分を試料蓄積部（４）に蓄積し、これをＧＣ／ＭＳ
（５）に一時に注入することにより試料中の内分泌撹乱
物質類の同定と定量を行う内分泌撹乱物質類分析装置。
【００１２】
【発明の実施の形態】分析方法
図１に本発明の分析方法の概略を示す。図に示すよう
に、本発明の方法では、内分泌撹乱物質類を含む生体試
料液をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラムに
かけて内分泌撹乱物質類を含有する低分子量画分を分画
採取する。ここで、生体試料液は、液状で採取される生
体試料及び固形ないし半固形状の生体試料を液状とした
もののいずれでもよい。次いで、ＧＰＣカラムで得られ
た内分泌撹乱物質類含有画分をガスクロマトグラフ質量
分析装置（ＧＣ／ＭＳ）に導入して分析する。
に、本発明の方法では、内分泌撹乱物質類を含む生体試
料液をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラムに
かけて内分泌撹乱物質類を含有する低分子量画分を分画
採取する。ここで、生体試料液は、液状で採取される生
体試料及び固形ないし半固形状の生体試料を液状とした
もののいずれでもよい。次いで、ＧＰＣカラムで得られ
た内分泌撹乱物質類含有画分をガスクロマトグラフ質量
分析装置（ＧＣ／ＭＳ）に導入して分析する。
【００１３】ＧＰＣカラムによる分画処理は基本的に分
子サイズによる選別であり、本発明によるＧＰＣ分画処
理では、生体試料に多量に含有され後段のＧＣ／ＭＳで
分析の妨害となる脂肪類など比較的分子量の大きな物質
は、試料注入後、早い時期にカラムを通過し、水分がほ
ぼ最後に流出する。内分泌撹乱物質類は分子量で高々１
０００以下、ほとんどは５００以下であり、図２に模式
的に示すように、脂肪よりは遅く水分よりは早くカラム
を通過する。従って、脂肪等の溶出完了から水分の溶出
開始までの分画を採取する。
子サイズによる選別であり、本発明によるＧＰＣ分画処
理では、生体試料に多量に含有され後段のＧＣ／ＭＳで
分析の妨害となる脂肪類など比較的分子量の大きな物質
は、試料注入後、早い時期にカラムを通過し、水分がほ
ぼ最後に流出する。内分泌撹乱物質類は分子量で高々１
０００以下、ほとんどは５００以下であり、図２に模式
的に示すように、脂肪よりは遅く水分よりは早くカラム
を通過する。従って、脂肪等の溶出完了から水分の溶出
開始までの分画を採取する。
【００１４】本発明においては、事前に試料の主成分で
ある脂肪と水分の流出時間を測定して、試料の注入開始
後３〜１０分程度の範囲の画分を採取することにより、
内分泌撹乱物質類が分画採取できるようにカラムの構
成、溶離液の成分及び流量等の溶出条件を決める。ＧＰ
Ｃカラムからの溶出液を示差屈折率検出器等の検出手段
で確認しながら脂肪の溶出後水分の溶出前の画分を採取
してもよい。なお、生体試料は、脂肪のほか色素等の脂
溶性高分子量成分も含むが、後述のカラムを用いた場
合、いずれも脂肪画分に含めることができる。
ある脂肪と水分の流出時間を測定して、試料の注入開始
後３〜１０分程度の範囲の画分を採取することにより、
内分泌撹乱物質類が分画採取できるようにカラムの構
成、溶離液の成分及び流量等の溶出条件を決める。ＧＰ
Ｃカラムからの溶出液を示差屈折率検出器等の検出手段
で確認しながら脂肪の溶出後水分の溶出前の画分を採取
してもよい。なお、生体試料は、脂肪のほか色素等の脂
溶性高分子量成分も含むが、後述のカラムを用いた場
合、いずれも脂肪画分に含めることができる。
【００１５】本発明では、ＧＰＣのカラム充填剤として
ポリビニルアルコール系ハードゲルまたはポリスチレン
系ハードゲルを用いることが好ましい。ハードゲルは溶
媒による膨潤収縮が少ないゲルであり、ポリビニルアル
コール系ハードゲルまたはポリスチレン系ハードゲルは
それぞれ高度に架橋されたポリビニルアルコール系共重
合体またはポリスチレン系共重合体である。
ポリビニルアルコール系ハードゲルまたはポリスチレン
系ハードゲルを用いることが好ましい。ハードゲルは溶
媒による膨潤収縮が少ないゲルであり、ポリビニルアル
コール系ハードゲルまたはポリスチレン系ハードゲルは
それぞれ高度に架橋されたポリビニルアルコール系共重
合体またはポリスチレン系共重合体である。
【００１６】本発明で好適に用いられるポリビニルアル
コール系ハードゲルまたはポリスチレン系ハードゲル充
填剤は、溶媒置換性に優れ、かつ膨潤時の強度に優れた
ゲルである。具体的には、ジクロロメタン（１００％）
に浸漬した際の膨潤度を１００とした場合に、アセトン
（１００％）中での膨潤度が７０〜１００、より好まし
くは８０〜９５であり、アセトン／シクロヘキサン＝５
０／５０（ｖ／ｖ％）ならびに酢酸エチル／シクロヘキ
サン＝５０／５０（ｖ／ｖ％）での膨潤度が８５〜１０
０である充填剤が好ましい。この条件を満たすことによ
り、カラムを繰返し使用した際に分画性能がそれ以前の
分画処理の影響を受けるという問題（メモリー効果）を
解消できる。充填剤の平均粒子径は好ましくは４μｍ〜
２０μｍ程度である。好ましい排除限界分子量はポリス
チレン換算で５００以上４万以下、さらに好ましくは５
００以上９００以下である（いずれもＴＨＦもしくはク
ロロホルムを溶離液とした場合の値）。このような充填
剤は、例えば、昭和電工株式会社製Shodex（登録商標）
CLNpak EVシリーズまたはShodex（登録商標）CLNpak PA
Eシリーズとして販売されている。
コール系ハードゲルまたはポリスチレン系ハードゲル充
填剤は、溶媒置換性に優れ、かつ膨潤時の強度に優れた
ゲルである。具体的には、ジクロロメタン（１００％）
に浸漬した際の膨潤度を１００とした場合に、アセトン
（１００％）中での膨潤度が７０〜１００、より好まし
くは８０〜９５であり、アセトン／シクロヘキサン＝５
０／５０（ｖ／ｖ％）ならびに酢酸エチル／シクロヘキ
サン＝５０／５０（ｖ／ｖ％）での膨潤度が８５〜１０
０である充填剤が好ましい。この条件を満たすことによ
り、カラムを繰返し使用した際に分画性能がそれ以前の
分画処理の影響を受けるという問題（メモリー効果）を
解消できる。充填剤の平均粒子径は好ましくは４μｍ〜
２０μｍ程度である。好ましい排除限界分子量はポリス
チレン換算で５００以上４万以下、さらに好ましくは５
００以上９００以下である（いずれもＴＨＦもしくはク
ロロホルムを溶離液とした場合の値）。このような充填
剤は、例えば、昭和電工株式会社製Shodex（登録商標）
CLNpak EVシリーズまたはShodex（登録商標）CLNpak PA
Eシリーズとして販売されている。
【００１７】カラム寸法は特に限定されないが、通常は
内径は１〜２０ｍｍ、好ましくは１〜4.6ｍｍ、より好
ましくは２〜３ｍｍであり、カラム長は、５〜４０ｃ
ｍ、好ましくは１０〜２５ｃｍである。
内径は１〜２０ｍｍ、好ましくは１〜4.6ｍｍ、より好
ましくは２〜３ｍｍであり、カラム長は、５〜４０ｃ
ｍ、好ましくは１０〜２５ｃｍである。
【００１８】本発明によるＧＰＣ分画処理は、上記のカ
ラムに溶離液を流し、その流れの中に試料を注入するこ
とにより行われる。溶離液の例としては、純水、塩を含
む水溶液（0.5Ｍ以下）、ＤＭＳＯ、メタノール、エタ
ノール、アセトニトリル、プロパノール、ＤＭＦ、アセ
トン、ジオキサン、ＴＨＦ、酢酸エチル、クロロホル
ム、トルエン、ジクロロメタン、ヘキサン、シクロヘキ
サン、シクロペンタン、およびこれらの混合溶媒が挙げ
られる。アセトン、酢酸エチル、トルエン、ジクロロメ
タン、シクロヘキサン、シクロペンタン、およびこれら
の混合溶媒が好ましい。
ラムに溶離液を流し、その流れの中に試料を注入するこ
とにより行われる。溶離液の例としては、純水、塩を含
む水溶液（0.5Ｍ以下）、ＤＭＳＯ、メタノール、エタ
ノール、アセトニトリル、プロパノール、ＤＭＦ、アセ
トン、ジオキサン、ＴＨＦ、酢酸エチル、クロロホル
ム、トルエン、ジクロロメタン、ヘキサン、シクロヘキ
サン、シクロペンタン、およびこれらの混合溶媒が挙げ
られる。アセトン、酢酸エチル、トルエン、ジクロロメ
タン、シクロヘキサン、シクロペンタン、およびこれら
の混合溶媒が好ましい。
【００１９】特にアセトンとシクロヘキサンの混合溶
媒、もしくは酢酸エチルとシクロヘキサン、ジクロロメ
タンとシクロヘキサンの混合溶媒が好ましい。シクロヘ
キサンの添加により溶離液の極性が低下し、分析対象と
する内分泌撹乱物質類と脂肪等の分析妨害成分との分離
を最適化することができる。好ましい混合比（ｖ／ｖ
％）はアセトンとシクロヘキサンの混合溶媒で５０／５
０〜１０／９０、より好ましくは３０／７０〜２０／８
０、酢酸エチルとシクロヘキサンの混合溶媒で５０／５
０〜１０／９０、ジクロロメタンとシクロヘキサンの混
合溶媒で１００／０〜１０／９０の範囲である。
媒、もしくは酢酸エチルとシクロヘキサン、ジクロロメ
タンとシクロヘキサンの混合溶媒が好ましい。シクロヘ
キサンの添加により溶離液の極性が低下し、分析対象と
する内分泌撹乱物質類と脂肪等の分析妨害成分との分離
を最適化することができる。好ましい混合比（ｖ／ｖ
％）はアセトンとシクロヘキサンの混合溶媒で５０／５
０〜１０／９０、より好ましくは３０／７０〜２０／８
０、酢酸エチルとシクロヘキサンの混合溶媒で５０／５
０〜１０／９０、ジクロロメタンとシクロヘキサンの混
合溶媒で１００／０〜１０／９０の範囲である。
【００２０】これらの溶離液の流量は、通常、0.05〜１
ｍＬ／分、好ましくは0.05〜0.2ｍＬ／分の範囲であ
る。流量が大きすぎると分画採取の際の希釈率が大きく
なる。流量が少なすぎると分画に時間がかかる。本発明
においては、ＧＰＣカラムとＧＣ／ＭＳとを流路切替え
手段を介してオンラインで接続する。オンライン接続し
溶離液をキャリアとして用いることにより、自動分析が
容易になる。また、閉鎖系で操作を行うため分析器具や
環境からの汚染を最小限に抑えることができる。
ｍＬ／分、好ましくは0.05〜0.2ｍＬ／分の範囲であ
る。流量が大きすぎると分画採取の際の希釈率が大きく
なる。流量が少なすぎると分画に時間がかかる。本発明
においては、ＧＰＣカラムとＧＣ／ＭＳとを流路切替え
手段を介してオンラインで接続する。オンライン接続し
溶離液をキャリアとして用いることにより、自動分析が
容易になる。また、閉鎖系で操作を行うため分析器具や
環境からの汚染を最小限に抑えることができる。
【００２１】また、内分泌撹乱物質類を含むＧＰＣ画分
をライン中に蓄積してから、当該ＧＰＣ画分を一時にＧ
Ｃ／ＭＳに導入して分析することが好ましい。蓄積され
たＧＰＣ画分を一体としてＧＣ／ＭＳに導入することに
より、検出感度を高めることができる。ＧＣ／ＭＳは慣
用の装置でよいが、例えば、ＰＣＢ等の異性体を個別に
定量する必要がある場合はキャピラリーカラム等を用い
てＧＣでの分離性を高める必要がある。
をライン中に蓄積してから、当該ＧＰＣ画分を一時にＧ
Ｃ／ＭＳに導入して分析することが好ましい。蓄積され
たＧＰＣ画分を一体としてＧＣ／ＭＳに導入することに
より、検出感度を高めることができる。ＧＣ／ＭＳは慣
用の装置でよいが、例えば、ＰＣＢ等の異性体を個別に
定量する必要がある場合はキャピラリーカラム等を用い
てＧＣでの分離性を高める必要がある。
【００２２】本発明の方法は種々の生体内試料について
用いることができるが、臍帯血を含む血液や尿、母乳、
生体組織などの生体試料について特に有効である。生体
試料は、必要により除タンパク等の前処理を施す。通常
は、生体から採取した試料に対し脂肪抽出を行い、得ら
れた脂肪分を溶離液と同一組成の溶媒に溶解して分析に
用いる。脂肪抽出方法としてはPatterson（D.G.Patters
on et al.，Anal.Chem, 59，2000-2005（1987））の方
法を用いることができる。
用いることができるが、臍帯血を含む血液や尿、母乳、
生体組織などの生体試料について特に有効である。生体
試料は、必要により除タンパク等の前処理を施す。通常
は、生体から採取した試料に対し脂肪抽出を行い、得ら
れた脂肪分を溶離液と同一組成の溶媒に溶解して分析に
用いる。脂肪抽出方法としてはPatterson（D.G.Patters
on et al.，Anal.Chem, 59，2000-2005（1987））の方
法を用いることができる。
【００２３】前述のＧＰＣカラム充填剤のうち、ポリビ
ニルアルコール系ハードゲルは水分含有量が１０％まで
の試料に対して、ポリスチレン系ハードゲルは水分含有
量が２％までの試料に対して用いることができる。水分
含有量がこの水準以上であると、安定した分画処理が困
難になる。従って、測定しようとする試料がこれ以上の
水分を有する場合は適当な前処理により水分量を低減す
る。例えば、無水硫酸ナトリウム等を加えて脱水し、必
要に応じ、さらに減圧や窒素吹付け等により濃縮する。
ニルアルコール系ハードゲルは水分含有量が１０％まで
の試料に対して、ポリスチレン系ハードゲルは水分含有
量が２％までの試料に対して用いることができる。水分
含有量がこの水準以上であると、安定した分画処理が困
難になる。従って、測定しようとする試料がこれ以上の
水分を有する場合は適当な前処理により水分量を低減す
る。例えば、無水硫酸ナトリウム等を加えて脱水し、必
要に応じ、さらに減圧や窒素吹付け等により濃縮する。
【００２４】本発明の分析方法によれば、内分泌攪乱作
用を有すると疑われる各種化学物質の分析が可能であ
る。このような化学物質の例としては、ダイオキシン
類、ベンゾ[a]ピレン、ベノミル、ビンクロゾリン、ヘ
キサクロロベンゼン、ヘキサクロロシクロヘキサン、エ
チルパラチオン、カルバリル、クロルデン、trans-ノナ
クロル、オキシクロルデン、1,2-ジブロモ-3-クロロプ
ロパン、ＤＤＴ（ジクロロジフェニルトリクロロエタ
ン）、ＤＤＥ（ジクロロジフェニルジクロロエチレン。
ＤＤＴの代謝物）、ＤＤＤ（ジクロロジフェニルジクロ
ロエタン。ＤＤＴの代謝物）、ケルセン、アルドリン、
エンドリン、ディルドリン、エンドスルファン、ヘプタ
クロル、ヘプタクロルエポキサイド、マラチオン、メソ
ミル、メトキシクロル、マイレックス、トキサフェン、
アルディカーブ、キーポン、シペルメトリン、エスフェ
ンバレレート、フェンバレレート、ペルメトリン、2,4,
5-トリクロロフェノキシ酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ
酢酸、アトラジン、アラクロール、シマジン、ニトロフ
ェン、トリフルラリン、メトリブジン、アミトロール、
ペンタクロロフェノール、トリブチルスズ、トリフェニ
ルスズ、2,4-ジクロロフェノール、ビスフェノールＡ、
ポリ臭化ビフェニル類、ポリ塩化ビフェニル類、オクタ
クロロスチレン、4-ニトロトルエン、スチレンの２及び
３量体、ベンゾフェノン、アルキルフェノール（Ｃ５、
Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９）、ノニルフェノール、4-オ
クチルフェノール、ｎ−ブチルベンゼン、フタル酸ジ-2
-エチルヘキシル、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸
ジ-n-ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジ
エチル、アジピン酸ジ-2-エチルヘキシル、フタル酸ジ
ペンチル、フタル酸ジヘキシル、フタル酸ジプロピ
ル）、ポリ塩化ナフタレン類、ＰＡＨ（多環芳香族炭化
水素）、ＮＰＡＨ（ニトロ多環芳香族炭化水素：ニトロ
アレーン）、エストラジオール類等分子量が１０００以
下の化学物質が含まれる。特に、ダイオキシン類、ポリ
臭化ビフェニル類、ポリ塩化ビフェニル類、フタル酸エ
ステル類について有効である。
用を有すると疑われる各種化学物質の分析が可能であ
る。このような化学物質の例としては、ダイオキシン
類、ベンゾ[a]ピレン、ベノミル、ビンクロゾリン、ヘ
キサクロロベンゼン、ヘキサクロロシクロヘキサン、エ
チルパラチオン、カルバリル、クロルデン、trans-ノナ
クロル、オキシクロルデン、1,2-ジブロモ-3-クロロプ
ロパン、ＤＤＴ（ジクロロジフェニルトリクロロエタ
ン）、ＤＤＥ（ジクロロジフェニルジクロロエチレン。
ＤＤＴの代謝物）、ＤＤＤ（ジクロロジフェニルジクロ
ロエタン。ＤＤＴの代謝物）、ケルセン、アルドリン、
エンドリン、ディルドリン、エンドスルファン、ヘプタ
クロル、ヘプタクロルエポキサイド、マラチオン、メソ
ミル、メトキシクロル、マイレックス、トキサフェン、
アルディカーブ、キーポン、シペルメトリン、エスフェ
ンバレレート、フェンバレレート、ペルメトリン、2,4,
5-トリクロロフェノキシ酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ
酢酸、アトラジン、アラクロール、シマジン、ニトロフ
ェン、トリフルラリン、メトリブジン、アミトロール、
ペンタクロロフェノール、トリブチルスズ、トリフェニ
ルスズ、2,4-ジクロロフェノール、ビスフェノールＡ、
ポリ臭化ビフェニル類、ポリ塩化ビフェニル類、オクタ
クロロスチレン、4-ニトロトルエン、スチレンの２及び
３量体、ベンゾフェノン、アルキルフェノール（Ｃ５、
Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９）、ノニルフェノール、4-オ
クチルフェノール、ｎ−ブチルベンゼン、フタル酸ジ-2
-エチルヘキシル、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸
ジ-n-ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジ
エチル、アジピン酸ジ-2-エチルヘキシル、フタル酸ジ
ペンチル、フタル酸ジヘキシル、フタル酸ジプロピ
ル）、ポリ塩化ナフタレン類、ＰＡＨ（多環芳香族炭化
水素）、ＮＰＡＨ（ニトロ多環芳香族炭化水素：ニトロ
アレーン）、エストラジオール類等分子量が１０００以
下の化学物質が含まれる。特に、ダイオキシン類、ポリ
臭化ビフェニル類、ポリ塩化ビフェニル類、フタル酸エ
ステル類について有効である。
【００２５】分析装置
図３に本発明の内分泌撹乱物質類分析装置の模式図を示
す。図に示すように、本発明の内分泌撹乱物質類分析装
置は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム
（１）、キャリア（溶離液）をＧＰＣカラムに注入する
ためのポンプ手段（Ｐ1）、ポンプ手段（Ｐ1）とＧＰＣ
カラム（１）とをつなぐ流路上に設けられた試料導入部
（２）、流路切替え手段（３）、ガスクロマトグラフ質
量分析装置（ＧＣ／ＭＳ）（５）及びポンプ手段
（Ｐ2）を有するオンラインＧＰＣ−ＧＣ／ＭＳ装置で
ある。
す。図に示すように、本発明の内分泌撹乱物質類分析装
置は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム
（１）、キャリア（溶離液）をＧＰＣカラムに注入する
ためのポンプ手段（Ｐ1）、ポンプ手段（Ｐ1）とＧＰＣ
カラム（１）とをつなぐ流路上に設けられた試料導入部
（２）、流路切替え手段（３）、ガスクロマトグラフ質
量分析装置（ＧＣ／ＭＳ）（５）及びポンプ手段
（Ｐ2）を有するオンラインＧＰＣ−ＧＣ／ＭＳ装置で
ある。
【００２６】流路切替え手段（３）は、ＧＰＣカラム
（１）の排出部、試料蓄積部（４）、ポンプ手段
（Ｐ2）及びＧＣ／ＭＳと接続しており、例えば、図に
示すような６ポートバルブである。試料注入時点では、
バルブの各ポートは図４(a)に示すように結合されてお
り、ＧＰＣカラム（１）から流出した液はそのまま廃棄
溜めに導かれる（図中の「排出」）。高分子量成分の流
出が完了すると、バルブの各ポートは図４(b)に示すよ
うに切り替えられ、内分泌撹乱物質類含有分画は試料蓄
積部（４）に導かれて蓄積される。試料蓄積部（４）は
例えばループ状チューブ（サンプルループ）である。内
分泌撹乱物質類の採取が終わると、バルブの各ポートは
図４(c)に示すように切り替えられ、さらに試料蓄積部
（４）の送出先が、適当なバルブ（図示していない。）
により「排出」からＧＣ／ＭＳへと切り替えられる。ポ
ンプ手段（Ｐ2）の駆動により試料蓄積部（４）の試料
はＧＣ／ＭＳに導入される。試料蓄積部（４）の容量
は、試料の注入量、溶離液の流速等に依存する。通常
は、試料注入量の１〜５０倍、好ましくは５〜２０倍程
度である。
（１）の排出部、試料蓄積部（４）、ポンプ手段
（Ｐ2）及びＧＣ／ＭＳと接続しており、例えば、図に
示すような６ポートバルブである。試料注入時点では、
バルブの各ポートは図４(a)に示すように結合されてお
り、ＧＰＣカラム（１）から流出した液はそのまま廃棄
溜めに導かれる（図中の「排出」）。高分子量成分の流
出が完了すると、バルブの各ポートは図４(b)に示すよ
うに切り替えられ、内分泌撹乱物質類含有分画は試料蓄
積部（４）に導かれて蓄積される。試料蓄積部（４）は
例えばループ状チューブ（サンプルループ）である。内
分泌撹乱物質類の採取が終わると、バルブの各ポートは
図４(c)に示すように切り替えられ、さらに試料蓄積部
（４）の送出先が、適当なバルブ（図示していない。）
により「排出」からＧＣ／ＭＳへと切り替えられる。ポ
ンプ手段（Ｐ2）の駆動により試料蓄積部（４）の試料
はＧＣ／ＭＳに導入される。試料蓄積部（４）の容量
は、試料の注入量、溶離液の流速等に依存する。通常
は、試料注入量の１〜５０倍、好ましくは５〜２０倍程
度である。
【００２７】好適なＧＰＣカラムはポリビニルアルコー
ル系ハードゲル充填カラムまたはポリスチレン系ハード
ゲル充填カラムであるが、その詳細については上述した
とおりである。また、図４に示していないが、ＧＣＰカ
ラム（１）と流路切替え手段（３）との間に、分析妨害
成分と水分の検出を行う手段を設けても良い。検出手段
の例としては示差屈折率検出器等が挙げられる。
ル系ハードゲル充填カラムまたはポリスチレン系ハード
ゲル充填カラムであるが、その詳細については上述した
とおりである。また、図４に示していないが、ＧＣＰカ
ラム（１）と流路切替え手段（３）との間に、分析妨害
成分と水分の検出を行う手段を設けても良い。検出手段
の例としては示差屈折率検出器等が挙げられる。
【００２８】さらに、複数の内分泌撹乱物質類に関する
ＧＣ／ＭＳの定性・定量データを記憶した記録手段、試
料中の内部標準に対応するＧＣ／ＭＳ実測値から前記デ
ータを補正する計算手段を有し、試料中のＧＣ／ＭＳ実
測値から前記補正されたＧＣ／ＭＳデータを参照して内
分泌撹乱物質類の同定と定量を自動化することもでき
る。内分泌撹乱物質類には多数の化合物が含まれ、ＰＣ
Ｂについてだけでも２０９種類の異性体が存在するが、
これらのＧＣ／ＭＳ測定値をデータベースとして記憶
し、実際の分析では内部標準により較正すれば、多種多
様な内分泌撹乱物質類の同定と定性を同時に行うことが
可能となる。
ＧＣ／ＭＳの定性・定量データを記憶した記録手段、試
料中の内部標準に対応するＧＣ／ＭＳ実測値から前記デ
ータを補正する計算手段を有し、試料中のＧＣ／ＭＳ実
測値から前記補正されたＧＣ／ＭＳデータを参照して内
分泌撹乱物質類の同定と定量を自動化することもでき
る。内分泌撹乱物質類には多数の化合物が含まれ、ＰＣ
Ｂについてだけでも２０９種類の異性体が存在するが、
これらのＧＣ／ＭＳ測定値をデータベースとして記憶
し、実際の分析では内部標準により較正すれば、多種多
様な内分泌撹乱物質類の同定と定性を同時に行うことが
可能となる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例により本発明の方法をより具体
的に説明する。実施例１ 以下の方法により、臍帯血清、母体血清及び母乳中のＰ
ＣＢ量及び有機塩素系農薬の分析を行った。
的に説明する。実施例１ 以下の方法により、臍帯血清、母体血清及び母乳中のＰ
ＣＢ量及び有機塩素系農薬の分析を行った。
【００３０】（１）試料
１０名の母親から採取した母体血清、臍帯血清及び母乳
試料（合計３０試料）を用いた。なお、これらの試料は
被験者から了解を取った上で分析試験に用いた。
試料（合計３０試料）を用いた。なお、これらの試料は
被験者から了解を取った上で分析試験に用いた。
【００３１】（２）装置
図３に示す構成のオンラインＧＰＣ−ＧＣ／ＭＳ装置を
使用した。ＧＰＣ：ＧＰＣカラムには、昭和電工製Shod
ex（登録商標）EV-200ACカラム（内径２ｍｍ、長さ１５
０ｍｍのポリビニルスチレン系ハードゲルカラム）を用
いた。ＧＣ／ＭＳ：温度制御気化装置ＰＴＶ（Programm
ed Temperature Vaporizer）を備え、ＧＣ部にJ&W Scie
ntific社製不活性化シリカチューブ（長さ２ｍ×内径0.
53ｍｍ）及び同社製キャピラリーカラムDB-5（長さ0.5
ｍ×内径0.25ｍｍ、膜厚0.25μｍ及び長さ６０ｍ×内径
0.25ｍｍ、膜厚0.1μｍ）を用いた。溶液注入後、８３
℃（５分）、１℃／分で１７２℃、次いで５０℃／分で
２７０℃まで昇温し２８０℃で測定を行った。
使用した。ＧＰＣ：ＧＰＣカラムには、昭和電工製Shod
ex（登録商標）EV-200ACカラム（内径２ｍｍ、長さ１５
０ｍｍのポリビニルスチレン系ハードゲルカラム）を用
いた。ＧＣ／ＭＳ：温度制御気化装置ＰＴＶ（Programm
ed Temperature Vaporizer）を備え、ＧＣ部にJ&W Scie
ntific社製不活性化シリカチューブ（長さ２ｍ×内径0.
53ｍｍ）及び同社製キャピラリーカラムDB-5（長さ0.5
ｍ×内径0.25ｍｍ、膜厚0.25μｍ及び長さ６０ｍ×内径
0.25ｍｍ、膜厚0.1μｍ）を用いた。溶液注入後、８３
℃（５分）、１℃／分で１７２℃、次いで５０℃／分で
２７０℃まで昇温し２８０℃で測定を行った。
【００３２】（３）予備実験
本実験で用いるＧＰＣカラムに流速0.1ｍＬ／分でアセ
トン／シクロヘキサン（３：７）（ｖ／ｖ）を流し、こ
れに生体内脂肪、ＰＣＢ試料及び水を含む試料を加え、
ＧＰＣカラムからの溶出時間を測定した。その結果、脂
肪及び色素成分は注入後０〜3.2分で溶出が完了し、Ｐ
ＣＢ試料は3.2〜5.2分で、水分は5.2分以後に流出する
ことが確認された。
トン／シクロヘキサン（３：７）（ｖ／ｖ）を流し、こ
れに生体内脂肪、ＰＣＢ試料及び水を含む試料を加え、
ＧＰＣカラムからの溶出時間を測定した。その結果、脂
肪及び色素成分は注入後０〜3.2分で溶出が完了し、Ｐ
ＣＢ試料は3.2〜5.2分で、水分は5.2分以後に流出する
ことが確認された。
【００３３】また、２０９種類のＰＣＢ異性体について
検量線を作成した。本装置の検出限界は、４〜６塩化Ｐ
ＣＢ：５ｐｇ（ＥＩ（電子衝撃イオン化））、７〜８塩
化ＰＣＢ：１ｐｇ（ＮＣＩ（負化学イオン化））、９〜
１０塩化ＰＣＢ：0.2ｐｇ（ＮＣＩ）、ヘキサクロロベ
ンゼン：２ｐｇ（ＮＣＩ）、ＨＣＨ類・ヘプタクロール
類・ディルドリン類・ＤＤＴ類：２０ｐｇ（ＥＩ）であ
った。
検量線を作成した。本装置の検出限界は、４〜６塩化Ｐ
ＣＢ：５ｐｇ（ＥＩ（電子衝撃イオン化））、７〜８塩
化ＰＣＢ：１ｐｇ（ＮＣＩ（負化学イオン化））、９〜
１０塩化ＰＣＢ：0.2ｐｇ（ＮＣＩ）、ヘキサクロロベ
ンゼン：２ｐｇ（ＮＣＩ）、ＨＣＨ類・ヘプタクロール
類・ディルドリン類・ＤＤＴ類：２０ｐｇ（ＥＩ）であ
った。
【００３４】なお、以下に示す本試験では、内部標準物
質は、13Ｃで標識した３種類のＰＣＢ（３,３',４,４'
−テトラクロロビフェニル、３,３',４,４',５−ペンタ
クロロビフェニル、３,３',４,４',５,５'−ヘキサクロ
ロビフェニル）、ヘキサクロロベンゼン（ＨＣＢ）、
ｐ,ｐ'−ジクロロジフェニルジクロロエチレン（ＤＤ
Ｅ）を用いた。
質は、13Ｃで標識した３種類のＰＣＢ（３,３',４,４'
−テトラクロロビフェニル、３,３',４,４',５−ペンタ
クロロビフェニル、３,３',４,４',５,５'−ヘキサクロ
ロビフェニル）、ヘキサクロロベンゼン（ＨＣＢ）、
ｐ,ｐ'−ジクロロジフェニルジクロロエチレン（ＤＤ
Ｅ）を用いた。
【００３５】（４）本実験
臍帯血清（８ｍｌ）、母体血清（４ｍｌ）、母乳(２ｍ
ｌ)をそれぞれPattersonらの方法に基づいて脂肪抽出を
行った。すなわち、試料を分液ロートに入れ、内部標準
物質を添加した後、飽和硫酸アンモニウム、エタノール
及びヘキサンを約１：１：３の割合で加えて振とうし、
２層が分離後、水層を別の分液ロートに移してヘキサン
を加えて振とうした。２層分離後、ヘキサン層を最初の
分液時の有機層と合わせ、水で洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥後、ろ過、濃縮、乾燥して脂肪の総重量を測
定した。平均脂肪量は、臍帯血清0.197％、母体血清0.8
95％、母乳3.04％であった。
ｌ)をそれぞれPattersonらの方法に基づいて脂肪抽出を
行った。すなわち、試料を分液ロートに入れ、内部標準
物質を添加した後、飽和硫酸アンモニウム、エタノール
及びヘキサンを約１：１：３の割合で加えて振とうし、
２層が分離後、水層を別の分液ロートに移してヘキサン
を加えて振とうした。２層分離後、ヘキサン層を最初の
分液時の有機層と合わせ、水で洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥後、ろ過、濃縮、乾燥して脂肪の総重量を測
定した。平均脂肪量は、臍帯血清0.197％、母体血清0.8
95％、母乳3.04％であった。
【００３６】ＧＰＣカラムには流速0.1ｍＬ／分でアセ
トン／シクロヘキサン（３：７）（ｖ／ｖ）を流し、こ
れと同一組成の溶媒５０〜１００μＬに前記抽出脂肪を
溶解し、そのうちの２０μｌをＧＰＣに注入した。予備
測定結果に基づき、試料注入後０〜3.2分の溶出成分は
廃棄し、3.2〜5.2分の画分をサンプルループ（貯留量：
２００μＬ）に採取し、5.2〜7.5分の間にＧＣ／ＭＳに
導入した。
トン／シクロヘキサン（３：７）（ｖ／ｖ）を流し、こ
れと同一組成の溶媒５０〜１００μＬに前記抽出脂肪を
溶解し、そのうちの２０μｌをＧＰＣに注入した。予備
測定結果に基づき、試料注入後０〜3.2分の溶出成分は
廃棄し、3.2〜5.2分の画分をサンプルループ（貯留量：
２００μＬ）に採取し、5.2〜7.5分の間にＧＣ／ＭＳに
導入した。
【００３７】その結果、ＰＣＢについては２０９種類の
異性体を分離して各異性体濃度を測定可能であり、近似
した内部標準との相対検量線により定量を行うことがで
きた。その他の内分泌撹乱物質類の分析結果と合わせ表
１に示す。
異性体を分離して各異性体濃度を測定可能であり、近似
した内部標準との相対検量線により定量を行うことがで
きた。その他の内分泌撹乱物質類の分析結果と合わせ表
１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】表中、ＰＣＢは各異性体濃度の総和であ
る。ＰＣＢの各異性体組成は、母乳、母体血清、臍帯血
清のいずれでも、６及び７塩化ＰＣＢが高濃度で蓄積さ
れていた。また、各塩素数ごとの組成においては母体血
清及び臍帯血清の間で顕著な差は認められなかった。し
かしながら、＃１１８（５塩化体。なお、＃番号はＩＵ
ＰＡＣによるリスト番号。以下同じ。）、＃１６８（６
塩化体）、＃１５３（６塩化体）、＃１７０（７塩化
体）等は母体血清に比べ臍帯血清で有意に低い（信頼係
数９５％以上）値を示した。
る。ＰＣＢの各異性体組成は、母乳、母体血清、臍帯血
清のいずれでも、６及び７塩化ＰＣＢが高濃度で蓄積さ
れていた。また、各塩素数ごとの組成においては母体血
清及び臍帯血清の間で顕著な差は認められなかった。し
かしながら、＃１１８（５塩化体。なお、＃番号はＩＵ
ＰＡＣによるリスト番号。以下同じ。）、＃１６８（６
塩化体）、＃１５３（６塩化体）、＃１７０（７塩化
体）等は母体血清に比べ臍帯血清で有意に低い（信頼係
数９５％以上）値を示した。
【００４０】なお、ダイオキシン類、及び、ＰＣＢ異性
体中ダイオキシン類と同様に毒性の強いコプラナＰＣＢ
についての母乳中の分析結果を表２に示す。
体中ダイオキシン類と同様に毒性の強いコプラナＰＣＢ
についての母乳中の分析結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】表中、non-orthoコプラナＰＣＢは、オル
ト位に置換塩素を有しない３,４,４',５−テトラクロロ
ビフェニル、３,３',４,４'−テトラクロロビフェニ
ル、３,３',４,４',５−ペンタクロロビフェニル、及び
３,３',４,４',５,５'−ヘキサクロロビフェニルの総和
であり、mono-orthoコプラナＰＣＢはオルト位に置換塩
素を１個だけ有する２',３,４,４',５−ペンタクロロビ
フェニル、２,３',４,４',５−ペンタクロロビフェニ
ル、２,３,３',４,４'−ペンタクロロビフェニル、２,
３,４,４',５−ペンタクロロビフェニル、２,３',４,
４',５,５'−ヘキサクロロビフェニル、２,３,３',４,
４',５−ヘキサクロロビフェニル、２,３,３',４,４',
５'−ヘキサクロロビフェニル、及び２,３,３',４,４',
５,５'−ヘプタクロロビフェニルの総和である。
ト位に置換塩素を有しない３,４,４',５−テトラクロロ
ビフェニル、３,３',４,４'−テトラクロロビフェニ
ル、３,３',４,４',５−ペンタクロロビフェニル、及び
３,３',４,４',５,５'−ヘキサクロロビフェニルの総和
であり、mono-orthoコプラナＰＣＢはオルト位に置換塩
素を１個だけ有する２',３,４,４',５−ペンタクロロビ
フェニル、２,３',４,４',５−ペンタクロロビフェニ
ル、２,３,３',４,４'−ペンタクロロビフェニル、２,
３,４,４',５−ペンタクロロビフェニル、２,３',４,
４',５,５'−ヘキサクロロビフェニル、２,３,３',４,
４',５−ヘキサクロロビフェニル、２,３,３',４,４',
５'−ヘキサクロロビフェニル、及び２,３,３',４,４',
５,５'−ヘプタクロロビフェニルの総和である。
【００４３】クロルデン類はγ-クロルデン、cis-クロ
ルデン、オキシクロルデン、trans-ノナクロル、cis-ノ
ナクロルの総和であり、本発明の方法では、臍帯血清中
のcis-クロルデン以外は定量可能であった。結果を表３
に示す。
ルデン、オキシクロルデン、trans-ノナクロル、cis-ノ
ナクロルの総和であり、本発明の方法では、臍帯血清中
のcis-クロルデン以外は定量可能であった。結果を表３
に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】実施例２
以下の方法により、臍帯中のフタル酸エステル類含有量
を分析した。なお、フタル酸エステル類の分析に供する
器具類はすべて環境分析用アセトン・ヘキサンで十分に
洗浄し、アルミホイルで包んで乾燥した後、速やかに使
用した。
を分析した。なお、フタル酸エステル類の分析に供する
器具類はすべて環境分析用アセトン・ヘキサンで十分に
洗浄し、アルミホイルで包んで乾燥した後、速やかに使
用した。
【００４６】(a)試料の調製
臍帯１ｇを鋏で細く切断し、0.5ｇを精確に秤量して遠
心分離用沈降管（遠沈管）に入れ、サロゲート（放射性
同位体標識化合物）をアセトンに溶解した溶液２ｍＬを
添加し、ポリトロンで１分半ホモジナイズした。８００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を試験管に分取し
た。
心分離用沈降管（遠沈管）に入れ、サロゲート（放射性
同位体標識化合物）をアセトンに溶解した溶液２ｍＬを
添加し、ポリトロンで１分半ホモジナイズした。８００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を試験管に分取し
た。
【００４７】(b)分析装置
ＧＰＣカラムをShodex（登録商標）Mspak GF-310 2D
（昭和電工製ポリビニルアルコール系ハードゲルを充填
した内径２ｍｍ×長さ１５０ｍｍのカラム）とし、ＧＰ
Ｃカラムの流出部に示差屈折率検出器（Shodex RI-71）
を接続した。
（昭和電工製ポリビニルアルコール系ハードゲルを充填
した内径２ｍｍ×長さ１５０ｍｍのカラム）とし、ＧＰ
Ｃカラムの流出部に示差屈折率検出器（Shodex RI-71）
を接続した。
【００４８】(c)実験手順
移動相としてアセトン（和光純薬工業製環境分析用）を
用い、示差屈折率検出器により成分の検出を行ってＧＣ
／ＭＳへの経路切り替えを行ったほかは実施例１と同様
にして分析を行った。示差屈折率検出器による測定で
は、脂肪分は3.8分から流出し始め、4.4分でピークアウ
トした。一方、フタル酸エステル類は4.8〜6.1分の間に
流出した。従って、4.8〜6.1分を分取した。水分は6.1
分以後に検出された。５回実験を繰り返し、１回の計測
が終了するごとに１３５秒間溶離液を流してラインの洗
浄を行った。
用い、示差屈折率検出器により成分の検出を行ってＧＣ
／ＭＳへの経路切り替えを行ったほかは実施例１と同様
にして分析を行った。示差屈折率検出器による測定で
は、脂肪分は3.8分から流出し始め、4.4分でピークアウ
トした。一方、フタル酸エステル類は4.8〜6.1分の間に
流出した。従って、4.8〜6.1分を分取した。水分は6.1
分以後に検出された。５回実験を繰り返し、１回の計測
が終了するごとに１３５秒間溶離液を流してラインの洗
浄を行った。
【００４９】フタル酸ジ-ｎ-ブチル及びフタル酸ジ-２-
エチルヘキシルについて５回の分析値（保持時間(reten
tion time)）の相対的変動係数（Coefficient of varia
tion；標準偏差を平均値で除した値）を求めたところ、
フタル酸ジ-ｎ-ブチルで0.1％、フタル酸ジ-２-エチル
ヘキシルで0.0％であり、本発明の方法では、信頼性の
高い分析結果が得られることが確認された。
エチルヘキシルについて５回の分析値（保持時間(reten
tion time)）の相対的変動係数（Coefficient of varia
tion；標準偏差を平均値で除した値）を求めたところ、
フタル酸ジ-ｎ-ブチルで0.1％、フタル酸ジ-２-エチル
ヘキシルで0.0％であり、本発明の方法では、信頼性の
高い分析結果が得られることが確認された。
【００５０】実施例３
ポリスチレン系ハードゲルカラムを用いて実施例１と同
様に血清中のＰＣＢ自動分析を行った。ＰＣＢの全異性
体の分析値は約１時間で求めることができた。
様に血清中のＰＣＢ自動分析を行った。ＰＣＢの全異性
体の分析値は約１時間で求めることができた。
【発明の効果】以上に示したように、本発明の分析方法
によれば、少量の血清及び臍帯血清でＰＣＢその他の内
分泌撹乱物質類の自動分析が可能である。内分泌撹乱物
質類の作用を検討する上では母胎から胎児への動態が重
要な課題となっており、本発明により臍帯血を含む血液
及び母乳についての迅速分析が可能となったことは重要
な実用的意味を持つ。また、本発明の分析方法はオンラ
インで、精製、濃縮、測定を自動的に行うことができ
る。このことにより、測定の自動化と共に試料調整（抽
出、濃縮）時の汚染等が防止できる。多数の試料を分析
するモニタリング調査において、分析時の外部からの汚
染を排除できるので微量成分の分析に特に有用である。
によれば、少量の血清及び臍帯血清でＰＣＢその他の内
分泌撹乱物質類の自動分析が可能である。内分泌撹乱物
質類の作用を検討する上では母胎から胎児への動態が重
要な課題となっており、本発明により臍帯血を含む血液
及び母乳についての迅速分析が可能となったことは重要
な実用的意味を持つ。また、本発明の分析方法はオンラ
インで、精製、濃縮、測定を自動的に行うことができ
る。このことにより、測定の自動化と共に試料調整（抽
出、濃縮）時の汚染等が防止できる。多数の試料を分析
するモニタリング調査において、分析時の外部からの汚
染を排除できるので微量成分の分析に特に有用である。
【図１】 本発明の分析方法の概要を示すフローチャー
ト。
ト。
【図２】 本発明の分析方法におけるＧＰＣ通過成分の
時間変化を模式的に示すグラフ。
時間変化を模式的に示すグラフ。
【図３】 本発明の分析装置の基本構成を示すブロック
図。
図。
【図４】 本発明の分析装置における分画分取手段の動
作を示す模式図。
作を示す模式図。
１ ＧＰＣカラム
２ 試料注入部
３ 流路切替弁
４ 試料蓄積部
５ ＧＣ／ＭＳ
Ｐ1、Ｐ2 ポンプ手段
Claims (4)
- 【請求項１】 ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
カラムとガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／Ｍ
Ｓ）とをライン切替え手段を介してオンラインで接続
し、内分泌撹乱物質類を含む生体試料液をＧＰＣカラム
にかけて高分子量成分と水分とを除去した低分子量画分
をライン中に蓄積した後、一時にＧＣ／ＭＳに導入して
自動分析することを特徴とする生体試料中の内分泌撹乱
物質類の分析方法。 - 【請求項２】 ＧＰＣカラムにより生体試料液中の脂肪
分、色素及び水分を除去する請求項１に記載の内分泌撹
乱物質類の分析方法。 - 【請求項３】 ＧＰＣカラムがポリビニルアルコール系
ハードゲル充填カラムまたはポリスチレン系ハードゲル
充填カラムである請求項１または２に記載の内分泌撹乱
物質類の分析方法。 - 【請求項４】 ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
カラム（１）、キャリア（溶離液）をＧＰＣカラムに注
入する手段(Ｐ1)、キャリア注入手段(Ｐ1)とＧＰＣカラ
ム（１）とをつなぐ流路上に設けられた試料導入部
（２）、ＧＰＣカラム（１）の排出部に接続され必要と
するＧＰＣ画分を試料蓄積部（４）に導くための流路切
替え手段（３）、試料蓄積部（４）に蓄積されたＧＰＣ
画分をガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／ＭＳ）
に導入する手段（Ｐ2）及びＧＣ／ＭＳ（５）を有する
オンラインＧＰＣ−ＧＣ／ＭＳ装置において、ＧＰＣカ
ラムがポリビニルアルコール系ハードゲル充填カラムま
たはポリスチレン系ハードゲル充填カラムであり、内分
泌撹乱物質類を含む生体試料液からＧＰＣカラム（１）
によって高分子量成分と水分とを除去した低分子量画分
を試料蓄積部（４）に蓄積し、これをＧＣ／ＭＳ（５）
に一時に注入することにより試料中の内分泌撹乱物質類
の同定と定量を行う内分泌撹乱物質類分析装置。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001268949A JP2003075422A (ja) | 2001-09-05 | 2001-09-05 | 生体試料中の内分泌撹乱物質類の分析方法及び分析装置 |
| PCT/JP2002/008967 WO2003022391A1 (en) | 2001-09-05 | 2002-09-04 | Method and apparatus for analyzing endocrine-disrupting substances in vital sample |
| EP02772835A EP1432489B1 (en) | 2001-09-05 | 2002-09-04 | Method and apparatus for analyzing endocrine-disrupting substances in vital sample |
| DE60237291T DE60237291D1 (de) | 2001-09-05 | 2002-09-04 | Verfahren und vorrichtung zur analyse von endokrin-unterbrechenden substanzen in vitalproben |
| AT02772835T ATE477035T1 (de) | 2001-09-05 | 2002-09-04 | Verfahren und vorrichtung zur analyse von endokrin-unterbrechenden substanzen in vitalproben |
| US10/488,545 US20040241871A1 (en) | 2001-09-05 | 2002-09-04 | Method and apparatus for analyzing endocrine-distrupting substances in vital sample |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001268949A JP2003075422A (ja) | 2001-09-05 | 2001-09-05 | 生体試料中の内分泌撹乱物質類の分析方法及び分析装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003075422A true JP2003075422A (ja) | 2003-03-12 |
Family
ID=19094855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001268949A Pending JP2003075422A (ja) | 2001-09-05 | 2001-09-05 | 生体試料中の内分泌撹乱物質類の分析方法及び分析装置 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040241871A1 (ja) |
| EP (1) | EP1432489B1 (ja) |
| JP (1) | JP2003075422A (ja) |
| AT (1) | ATE477035T1 (ja) |
| DE (1) | DE60237291D1 (ja) |
| WO (1) | WO2003022391A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008051762A (ja) * | 2006-08-28 | 2008-03-06 | Kao Corp | フラン樹脂中のホルムアルデヒドの分析方法 |
| KR101390818B1 (ko) * | 2012-08-27 | 2014-05-02 | 한국과학기술연구원 | 생체 시료 내 페놀 화합물 동시 분석 방법 |
| CN106093214A (zh) * | 2016-05-24 | 2016-11-09 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 检测听装包材样品中双酚a含量的方法 |
| CN115267017A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-11-01 | 南通市疾病预防控制中心 | 分散固相萃取材料与gc-ms联用检测有机锡的方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN101858897B (zh) * | 2010-07-05 | 2012-06-13 | 深圳出入境检验检疫局玩具检测技术中心 | 邻苯二甲酸酯类增塑剂的检测方法 |
| CN101968475B (zh) * | 2010-09-09 | 2012-04-25 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种烟用丙纤胶中丙烯酸含量的测定方法 |
| CN102279231B (zh) * | 2011-06-28 | 2013-11-06 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种多氯联苯类污染物的快速定性检测方法 |
| CN102914614B (zh) * | 2012-11-07 | 2015-04-01 | 云南烟草科学研究院 | 筛选影响纸杯口触材料酞酸酯迁移量的唾液模拟物的方法 |
| CN103630624B (zh) * | 2013-11-22 | 2016-01-06 | 中国烟草总公司湖北省公司 | 烟用纸质材料中18种邻苯二甲酸酯类化合物的测定方法 |
| CN106546687B (zh) * | 2016-12-08 | 2023-04-07 | 北京莱伯泰科仪器股份有限公司 | 用于凝胶色谱净化系统的小型化装置及其使用方法 |
| CN107045023B (zh) * | 2017-03-16 | 2019-04-02 | 贵州出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 | 一种同时测定烟草中常用除草剂残留量的方法 |
| CN108627579B (zh) * | 2017-03-24 | 2020-12-01 | 上海安谱实验科技股份有限公司 | Pbt制品中多环芳烃的提取方法 |
| CN107462650B (zh) * | 2017-08-23 | 2020-09-25 | 杭州汉库医学检验所有限公司 | 人体尿液中环境激素的检测方法 |
| CN111089922A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-01 | 江苏微谱检测技术有限公司 | 一种用于凝胶渗透色谱检测的样品的净化方法 |
| CN111781285B (zh) * | 2020-07-14 | 2022-09-23 | 上海烟草集团有限责任公司 | 一种同时分离测定烟草中多种有机锡和无机锡的方法 |
| CN112946155B (zh) * | 2021-02-07 | 2022-04-08 | 杭州华东医药集团新药研究院有限公司 | 奥利万星中间体杂质4-氯联苯和4,4-二氯联苯含量的测定方法 |
| CN113834893A (zh) * | 2021-11-26 | 2021-12-24 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 一种拆分氟氯苯氰菊酯对映异构体的hplc方法 |
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (6)
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| US4314032A (en) * | 1978-10-26 | 1982-02-02 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Crosslinked polyvinyl alcohol gel |
| ZW16289A1 (en) * | 1988-12-19 | 1990-03-21 | Mineral Tech Council | Gold selective ion exchange resins |
| WO1994016322A1 (en) * | 1993-01-12 | 1994-07-21 | Yoshikawa Oil & Fat Co., Ltd. | Method of measuring content of polycyclic aromatic compound in lanolin and removal thereof |
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| JP2001108663A (ja) * | 1999-10-05 | 2001-04-20 | Shimadzu Corp | 低分子化合物の分析法 |
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2001
- 2001-09-05 JP JP2001268949A patent/JP2003075422A/ja active Pending
-
2002
- 2002-09-04 DE DE60237291T patent/DE60237291D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-04 US US10/488,545 patent/US20040241871A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-04 AT AT02772835T patent/ATE477035T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-09-04 EP EP02772835A patent/EP1432489B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-04 WO PCT/JP2002/008967 patent/WO2003022391A1/en active Application Filing
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| EP1432489B1 (en) | 2010-08-11 |
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