CN106680393B - 液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法，采用高效液相色谱串联质谱法定量检测尿液样品中14种环境荷尔蒙，具体程序是先用高效液相色谱将经过预净化处理的尿液样本进行初步分离，串联质谱法负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式对目标组分的母离子·子离子对进行扫描，氘代同位素内标法进行准确定量，以标准品浓度与内标品浓度比值为X轴，以标准品响应峰面积与内标品响应峰面积比值为Y轴，建立校正曲线，计算上述14种环境荷尔蒙的含量。
Description
技术领域
本发明属于检测分析技术领域，具体涉及液相色谱串联质谱测定尿液中荷尔蒙含量的方法。
背景技术
随着现代科技的发展，工业化程序的提高，越来越多的工业品，化学品及添加剂的使用导致环境中数百中环境干扰物质的暴露，对人体造成不同程度的损伤及影响。在日常生活中，塑料制品中的邻苯二甲酸酯类如邻苯二甲酸单甲基酯(MMP)、邻苯二甲酸单乙基酯(MEP)、邻苯二甲酸单丁基酯(MnBP)、邻苯二甲酸单苄基酯(MBzP)、邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)，在实际应用中因其低毒，廉价，广谱抗菌性，稳定被广泛使用；对羟基苯甲酸酯类如对羟基苯甲酸甲酯(MP)、对羟基苯甲酸乙酯(EP)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)、对羟基苯甲酸丁酯(BP)因其低毒，稳定，广谱抗菌能力及稳定性被广泛用作食品，药品，化妆品，卫生用品行业防腐抑菌剂；酚类如壬基苯酚(NP)、辛基苯酚(4-t-OP)、丁基苯酚(2，4-di-t-BP)、双酚A(BPA)、三氯沙(Triclosan)在清洁用品中大量使用，可在生物体内积累，严重影响人体生殖能力。由于这类物质的大量使用，目前在许多环境介质如水体，空气，土壤，化妆品，药品中均能够检到，可通过皮肤接触、饮食、呼吸等多种渠道进入人体，进而会干扰内分泌功能，与生殖发育、不孕症、性早熟、前列腺癌、精子数量降低等都密切相关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检出限低、重现性好、准确度高的液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法，
所述14种环境荷尔蒙分别为：邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、壬基苯酚、辛基苯酚、丁 基苯酚、双酚A、三氯沙；
采用高效液相色谱串联质谱法定量检测尿液样品中14种环境荷尔蒙，具体程序是先用高效液相色谱将经过预净化处理的尿液样本进行初步分离，串联质谱法负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式对目标组分的母离子-子离子对进行扫描，氘代同位素内标法进行准确定量，以标准品浓度与内标品浓度比值为X轴，以标准品响应峰面积与内标品响应峰面积比值为Y轴，建立校正曲线，计算上述14种环境荷尔蒙的含量；
其中，色谱柱1和色谱柱2并联设置，通过流动相A1、B1与色谱柱1实现邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯这9种组分的定量分析，分析结束后切换至流动相A2、B2与色谱柱2实现壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A和三氯沙这5种组分定量分析；
具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
色谱柱1：Kinetex XB-C18 100mm*2.1mm*2.6uM；
流动相：A1，含0.1％v/v甲酸的水溶液；
流动相：B1，乙腈；
洗脱梯度见表1；
柱温：35℃；
流速：0.4mL/min；
进样量：20μL；
色谱柱2：BEH C18 50mm*2.1mm*1.7uM；
流动相A2，含0.1％v/v氨水的水溶液；
流动相B2，甲醇；
洗脱梯度见表2；
柱温：50℃；
流速：0.2mL/min；
进样量：20μL；
表1 色谱柱1的梯度洗脱参数
表2 色谱柱2的梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
离子源：电喷雾Turbo Spray，负离子扫描；离子源温度550.00℃；扫描方式：多反应监测；碰撞气5.00Psi；气帘气40.00Psi；雾化气55.00Psi；辅助气55.00Psi；电喷雾电压-4500.00V；采集离子对见表3；
表3 十四个环境荷尔蒙组分及内标对应采集离子对及质谱参数
其中，所述的经过预净化处理的尿液样本按如下方法制备得到：准备200uL尿液样本，向其中加入10μL β-葡萄糖甘酸酶，加入20μL混合氘代内标液，在37℃水浴锅中充分酶解2h，待酶解结束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液，充分涡旋均匀，待SPE上样净化即得。
其中，所述标准品按如下方法制备得到：分别称取14种标准品用甲醇定容，分别得到14种2mg/mL标准品溶液，然后用甲醇分级稀释得到1μg/mL(每一种标准品的浓度都是1μg/mL)混合标准品工作液待用，从工作液中分别移取适量标液，用尿液基质稀释液定容得到不同浓度标准点1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL各1mL，待用。
其中，所述的尿液基质稀释液按如下方法配制得到：准确称取二水合氯化钙0.0559g、六水合氯化镁0.0610g、氯化钠0.4208g、硫酸钠0.2060g、柠檬酸钠二水合物0.0647g、草酸钠0.0020g、磷酸二氢钾0.2545g、氯化钾0.1439g、氯化铵0.0920g、尿素0.2498g和肌酐0.1052g定容至100mL，充分混匀，放置4℃待用。
其中，所述的内标品按如下方法制备得到：分别移取内标品用甲醇定容至2mg/mL，然后分级稀释得到0.5μg/mL混合氘代内标工作液待用；分别准备200μL不同浓度标准点，向其中加入10μL β-葡萄糖甘酸酶，加入20μL混合氘代内标工作液，在37℃水浴中充分酶解2h，待酶解结束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液进行稀释，充分涡旋均匀，待SPE上样净化。
其中，甲酸和甲醇的混合水溶液中，甲酸、甲醇和水的体积比为5：10：85。其中，β-葡萄糖甘酸酶，其酶活100000units/mL以上。
其中，所述的SPE上样净化，过程如下：依次用1ml甲醇、1ml水进行活化SPE小柱；上样，移取预处理过的尿液样本或内标品300uL进行上样，自然滴落，流出液弃去；淋洗，依次用1ml水、1ml 10％v/v甲醇水溶液淋洗小柱，淋洗液弃去，以真空泵抽干柱子约1min至近干；洗脱，1ml甲醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液氮吹至近干，用100μL含0.1％v/v甲酸的甲醇水溶液复溶。其中，所述的含0.1％v/v甲酸的甲醇水溶液，甲醇和水体积比是1∶1。
有益效果：目前文献仅针对此类其中一种或几种物质进行分析检测，但针对此类14种环境荷尔蒙类物质进行精确定量分析尚未见报道。本发明利用液质联用分析技术结合多年应用经验，综合固相萃取技术及柱切换功能实现尿液样本中14种环境荷尔蒙定量准确检测，10min可实现14个目标物质的定量分析。本发明方法检出限低，重现性好，准确度高，可以实现真实监测人体内这些有毒，有害物质的暴露情况，进而采取适当预防与防护措施。本研究的实现应用于临床，可有效干预人体因环境荷尔蒙在人体内暴露引起的生殖发育、不孕症、性早熟、前列腺癌、精子数量降低等疾病，可有效提高人民生活质量，提升新生儿健康率，有效监控污染源排放等等。
附图说明
图1为9个组分(邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)的标准谱图；
图2为5个组分(壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A和三氯沙)标准品谱图；
图3为尿液样本中9个组分(邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)的图谱；
图4为尿液样本中5个组分(壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A和三氯沙)的谱图。
图5为试剂盒模拟包装图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、材料
1.仪器 AB SCIEX API 4000+TM LC-MS/MS系统、医用高速离心机(北京白洋医疗器械有限公司)、多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)、快速混匀器(姜堰市康泰医疗器材厂)、可调移液器(Thermo Scientific公司)、优普超纯水仪(成都超纯科技有限公司)等。
2.试剂 甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级)均购自美国Tedia High Purity Solvent公司，乙酸乙酸(色谱级)购自Adamas Reagent，Ltd，甲酸购自天津致远化学制剂有限公司，氨水，二水合氯化钙、六水合氯化镁、氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠二水合物、草酸钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化铵、尿素、肌酐、重铬酸钾、浓硫酸等均购自国药集团化学试剂有限公司，超纯水为自制。
3.标准品 邻苯二甲酸单甲基酯(MMP)、邻苯二甲酸单乙基酯(MEP)、邻苯二甲酸单丁基酯(MnBP)、邻苯二甲酸单苄基酯(MBzP)、邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)、对羟基苯甲酸甲酯(MP)、对羟基苯甲酸乙酯(EP)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)、对羟基苯甲酸丁酯(BP)、壬基苯酚(NP)、辛基苯酚(4-t-OP)、丁基苯酚(2，4-di-t-BP)、双酚A(BPA)、三氯沙(Triclosan)均购自加拿大Toronto Research Chemical公司及德国Dr.Ehrenstorfer公司；
4.内标品 对羟基苯甲酸丙酯-d4(PP-D4)邻苯二甲酸单正丁基酯-同位素-d4(MnBP-D4)、4-壬基苯酚-d8(NP-D8)(CDN ISOTOPES INC，德国Dr.Ehrenstorfer公司)
二、方法
先用高效液相色谱将经过预净化处理的尿液样本进行初步分离，串联质谱法负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式对目标组分的母离子-子离子对进行扫描，氘代同位素内标法进行准确定量，以标准品浓度与内标品浓度比值为X轴，以标准品响应峰面积与内标品响应峰面积比值为Y轴，建立校正曲线，计算上述14种环境荷尔蒙的含量；
其中，色谱柱1和色谱柱2并联设置，通过流动相A1、B1与色谱柱1实现邻苯二 甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯这9种组分的定量分析，分析结束后切换至流动相A2、B2与色谱柱2实现壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A和三氯沙这5种组分定量分析；
具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
色谱柱1：Kinetex XB-C18 100mm*2.1mm*2.6uM；
流动相：A1，含0.1％v/v甲酸的水溶液；
流动相：B1，乙腈；
洗脱梯度见表1；
柱温：35℃；
流速：0.4mL/min；
进样量：20μL；
色谱柱2：BEH C18 50mm*2.1mm*1.7uM；
流动相A2，含0.1％v/v氨水的水溶液；
流动相B2，甲醇；
洗脱梯度见表2；
柱温：50℃；
流速：0.2mL/min；
进样量：20μL；
(2)质谱条件：
离子源：电喷雾Turbo Spray(ESI)，负离子扫描；离子源温度(TEM)：550.00℃；扫描方式：多反应监测(MRM)；碰撞气：5.00Psi；气帘气(CUR)：40.00Psi；雾化气(GS1)：55.00Psi；辅助气(GS2)：55.00Psi；电喷雾电压(IS)：-4500.00V。
电喷雾离子源(Negative Electro-spray ionization-，ESI-)，多反应监测模式(Multiple reaction monitor，MRM)；采集离子对见表3。
3.尿液基质稀释液准备 准确称取二水合氯化钙0.0559g、六水合氯化镁0.0610g、氯化钠0.4208g、硫酸钠0.2060g、柠檬酸钠二水合物0.0647g、草酸钠0.0020g、磷酸二氢钾0.2545g、氯化钾0.1439g、氯化铵0.0920g、尿素0.2498g和肌酐0.1052g定容 至100mL，充分混匀，放置4℃待用。
4.玻璃器皿处理 在实验之前将所用玻璃离心管及移液管分别用重铬酸钾-浓硫酸洗液浸泡过液，然后用超纯水充分清洗，自然晾干。
5.标准品准备与处理 分别称取14种标准品用甲醇定容，分别得到14种2mg/mL标准品溶液，然后用甲醇分级稀释得到1μg/mL混合标准品工作液(其中单一标准品的浓度都是1μg/mL)待用，从工作液中分别移取适量标液，用尿液基质稀释液定容得到不同浓度标准点1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL各1mL，待用。分别移取内标品用甲醇定容至2mg/mL，然后分级稀释得到0.5μg/mL混合氘代内标工作液待用(其中单一内标品的浓度都是0.5μg/mL)；分别准备200μL不同浓度标准点，向其中加入10μLβ-葡萄糖甘酸酶，加入20μL混合氘代内标工作液，在37℃水浴中充分酶解2h，待酶解结束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液进行稀释，充分涡旋均匀，待SPE上样净化。其中，甲酸和甲醇的混合水溶液中，甲酸、甲醇和水的体积比为5∶10∶85。
6.SPE上样净化 活化 依次用1ml甲醇、1ml水进行活化SPE小柱；上样，移取预处理过的尿液样本或标准品300uL进行上样，自然滴落，流出液弃去；淋洗，依次用1ml水、1ml10％v/v甲醇水溶液淋洗小柱，淋洗液弃去，以真空泵抽干柱子约1min至近干；洗脱，1ml甲醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液氮吹至近干，用100μL含0.1％v/v甲酸的甲醇水溶液复溶，其中，所述的含0.1％v/v甲酸的甲醇水溶液，甲醇和水体积比是1∶1。
7.尿液样本的处理 准备200uL 尿液样本，向其中加入10μLβ-葡萄糖甘酸酶，加入20μL混合氘代内标液，在37℃水浴锅中充分酶解2h，待酶解结束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液，充分涡旋均匀，待SPE上样净化即得。净化程序同标准品6。
三、方法学评价
1.线性 分别将准备好的混合标准品浓度为1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL的标准点按照正常样本处理程序进行处理然后进样分析，计算含量，考察各目标物质的线性关系。
2.精密度 分别准备低、中、高三个具有代表性尿液样本进行六次重复处理，检测各个组分含量，考察批内重复性；准备低、中、高三个具有代表性尿液样本分三批进行六 次重复处理，检测各目标组分含量，考察批间重复性。
3.添加回收考察 按照尿液样品同样处理方法处理分别处理同一尿液样本，并在些尿液样本基础上分别添加两个浓度L1和L2，分别进行处理并测试结果，验证其添加回收效果。
四、结果
1、线性及保留时间考察
14种环境荷尔蒙在1～200ng/mL范围内线性关系良好(线性相关系数分别为0.9906～0.9999)，保留时间参表4，10min可完成十四个目标组分分析，各组分及对应内标总离子流色谱图参附图1～2。
表4 线性回归方程及相关系数，保留时间
2、精密度验证
采用本方法对低、中、高三个浓度代表性样本进行重复处理测试，各对应目标物质批内精密度(CV％)范围为2.43％～12.85％，批间精密度(CV％)范围为3.34％～14.30％，参表5。
表5 14个目标组分批内批间精密度
备注：L，M，H分别表示低，中，高三个浓度
3、正确度验证
按照正常尿液样品进行提取处理，多次测试求得L0，L1，L2平均值，求得对应回收率，在低、高两个浓度添加范围内，回收率81.1％～116.3％，满足100±20％要求，参表6。
表6 14个目标组分添加回收数据
备注：L1、L2分别表示两个浓度级别，单位：ng/mL
五、讨论
环境荷尔蒙做为一种潜在的对人体有害的物质，随着检测技术的发展及相关研究的关注越来越多被人重视，也相继有多种研究报告指出其在人体内的存在会严重影响身体健康，造成男性不育、新生儿畸形、内分泌紊乱等.目前检测此类环境干扰物质的常见方法有气相色谱法、气相色谱串联质谱法、液相色谱法、液相色谱串联质谱法等，本研究采用目前国内外公认精准度最高的液相色谱串联质谱法进行检测。
本研究通过一次SPE固相萃取小柱净化处理尿液样本，可有效消除尿液中复基质的干扰，保留时间稳定，回收率高；两次进样分析，在10min内实现三类14种环境荷尔蒙的定量分析，提高分析效率。为保证检测结果的准确性，分别考察了14种目标组分不同浓度标准点线性范围，在2～200ng/mL范围内线性良好，线性相关系数0.9906～0.9999；三个不同浓度代表性样品批内精密度(CV)为2.43％～12.85％，批间精密度：3.34％～14.30％，添加回收率81.1％～116.3％。综上所述，本研究应用LC-MS/MS检测人体尿液中14种环境荷尔蒙含量灵敏度高，结果准确、重复性好，可以保证尿液样本内环境荷尔蒙含量测试的准确性，可应用于人体内环境荷尔蒙暴露监测分析。
五、分析试剂盒
分析试剂盒各组分见表7。
表7 分析试剂盒中各组分配制
上述试剂盒的制备方法：
，包括
(1)洗脱液
流动相：A1，含0.1％v/v甲酸的水溶液；
流动相：B1，乙腈；
流动相：A2，含0.1％v/v氨水的水溶液；
流动相：B2，甲醇。
(2)混合标准品工作液
分别称取邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A、三氯沙各10mg用甲醇定容至5mL，得到14种2mg/mL标准品溶液，然后用甲醇分级稀释得到1μg/mL混合标准品工作液。
(3)混合氘代内标工作液
分别移取对羟基苯甲酸丙酯-d4邻苯二甲酸单正丁基酯-同位素-d4、4-壬基苯酚-d8各10mg用甲醇定容至5mL，得到3种2mg/mL内标品溶液，然后用甲醇分级稀释得到0.5μg/mL混合氘代内标工作液。
(4)稀释液
尿液基质稀释液a：准确称取二水合氯化钙0.0559g、六水合氯化镁0.0610g、氯化钠0.4208g、硫酸钠0.2060g、柠檬酸钠二水合物0.0647g、草酸钠0.0020g、磷酸二氢钾0.2545g、氯化钾0.1439g、氯化铵0.0920g、尿素0.2498g和肌酐0.1052g用水定容 至100mL。
尿液前处理稀释液b：分别移取甲酸5mL，甲醇10mL，用水定容至100mL。
(5)淋洗液/活化液：超纯水200mL；10％甲醇水溶液：移取10mL甲醇用水定容至100mL。
(6)洗脱液/活化液：甲醇：色谱纯。
(7)复溶液：0.1％甲酸甲醇水：分别移取甲醇水各499.5mL，然后加入1mL甲酸，定容至1L，得到0.1％v/v甲酸的甲醇水溶液，甲醇和水体积比是1∶1。
(8)质控品：
QC(L)：准确移取1μg/mL含有14个目标组分的混合标准品工作液5μL用尿液基质稀释液稀释至1mL，得到浓度为5ng/mL QC(L)。
QC(M)：准确移取1μg/mL含有14个目标组分的混合标准品工作液20μL用尿液基质稀释液稀释至1mL，得到浓度为20ng/mL QC(M)。
QC(H)：准确移取1μg/mL含有14个目标组分的混合标准品工作液100μL用尿液基质稀释液稀释至1mL，得到浓度为100ng/mL QC(H)。
试剂盒内部的模拟包装参考图5。试剂盒上下四周加膜，防震保温，从左至右分为A，B，C，D四个部分，A部分放置4瓶洗脱液，B部分放置150mL及250mL4瓶溶液C部分放置另外7瓶小包装溶液，D部分放置SPE小柱。
Claims (4)
1.液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法，其特征在于，
所述14种环境荷尔蒙分别为：邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A、三氯沙；
采用高效液相色谱串联质谱法定量检测尿液样品中14种环境荷尔蒙，具体程序是先用高效液相色谱将经过预净化处理的尿液样本进行初步分离，串联质谱法负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式对目标组分的母离子-子离子对进行扫描，氘代同位素内标法进行准确定量，以标准品浓度与内标品浓度比值为X轴，以标准品响应峰面积与内标品响应峰面积比值为Y轴，建立校正曲线，计算上述14种环境荷尔蒙的含量；
其中，色谱柱1和色谱柱2并联设置，通过流动相A1、B1与色谱柱1实现邻苯二甲酸单甲基酯、邻苯二甲酸单乙基酯、邻苯二甲酸单丁基酯、邻苯二甲酸单苄基酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯这9种组分的定量分析，分析结束后切换至流动相A2、B2与色谱柱2实现壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、双酚A和三氯沙这5种组分定量分析；
具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
色谱柱1：Kinetex XB-C18 100mm*2.1mm*2.6uM；
流动相：A1，含0.1％v/v甲酸的水溶液；
流动相：B1，乙腈；
洗脱梯度如下：
柱温：35℃；
流速：0.4mL/min；
进样量：20μL；
色谱柱2：BEH C18 50mm*2.1mm*1.7uM；
流动相：A2，含0.1％v/v氨水的水溶液；
流动相：B2，甲醇；
洗脱梯度如下：
柱温：50℃；
流速：0.2mL/min；
进样量：20μL；
(2)质谱条件：
离子源：电喷雾Turbo Spray，负离子扫描；离子源温度550.00℃；扫描方式：多反应监测；碰撞气5.00Psi；气帘气40.00Psi；雾化气55.00Psi；辅助气55.00Psi；电喷雾电压-4500.00V；采集离子对如下：
其中，所述的经过预净化处理的尿液样本按如下方法制备得到：准备200uL尿液样本，向其中加入10μL β-葡萄糖甘酸酶，加入20μL混合氘代内标液，在37℃水浴锅中充分酶解2h，待酶解结束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液，充分涡旋均匀，待SPE上样净化即得；甲酸和甲醇的混合水溶液中，甲酸、甲醇和水的体积比为5∶10∶85；β-葡萄糖甘酸酶，其酶活100000units/mL以上；
所述的SPE上样净化，过程如下：依次用1ml甲醇、1ml水进行活化SPE小柱；上样，移取预处理过的尿液样本或内标品300uL进行上样，自然滴落，流出液弃去；淋洗，依次用1ml水、1ml 10％v/v甲醇水溶液淋洗小柱，淋洗液弃去，以真空泵抽干柱子约1min至近干；洗脱，1ml甲醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液氮吹至近干，用100μL含0.1％v/v甲酸的甲醇水溶液复溶；所述的含0.1％v/v甲酸的甲醇水溶液，甲醇和水体积比是1∶1。
2.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法，其特征在于，所述标准品按如下方法制备得到：分别称取14种标准品用甲醇定容，分别得到14种2mg/mL标准品溶液，然后用甲醇分级稀释得到1μg/mL混合标准品工作液待用，从工作液中分别移取适量标液，用尿液基质稀释液定容得到不同浓度标准点1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL各1mL，待用。
3.根据权利要求2所述的液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法，其特征在于，所述的尿液基质稀释液按如下方法配制得到：准确称取二水合氯化钙0.0559g、六水合氯化镁0.0610g、氯化钠0.4208g、硫酸钠0.2060g、柠檬酸钠二水合物0.0647g、草酸钠0.0020g、磷酸二氢钾0.2545g、氯化钾0.1439g、氯化铵0.0920g、尿素0.2498g和肌酐0.1052g定容至100mL，充分混匀，放置4℃待用。
4.根据权利要求2所述的液相色谱串联质谱测定尿液中14种环境荷尔蒙含量的方法，其特征在于，所述的内标品按如下方法制备得到：分别移取内标品用甲醇定容至2mg/mL，然后分级稀释得到0.5μg/mL混合氘代内标工作液待用；分别准备200μL不同浓度标准点，向其中加入10μL β-葡萄糖甘酸酶，加入20μL混合氘代内标工作液，在37℃水浴中充分酶解2h，待酶解结束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液进行稀释，充分涡旋均匀，待SPE上样净化。
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