CN105675788A - 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法；采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中孕酮和睾酮，利用高效液相色谱将孕酮和睾酮与杂质分离，内标法定量，以孕酮的同位素作为内标，以标准品与内标的浓度比为X轴，标准品与内标的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算孕酮和睾酮的含量。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确性好，前处理过程简单；分析时间短，6.5min内即可完成孕酮和睾酮的分析，精密度及加标回收率满足检测要求。
Description
技术领域
本发明涉及唾液检测的技术领域，特别涉及一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法。
背景技术
目前常用的检测唾液中孕酮和睾酮的方法有酶联免疫法、电化学发光免疫法等，这些方法受到多种客观条件的影响，如温度、pH值、离子强度、试剂免疫活性等。免疫法不可避免唾液基质中结构相似物质的干扰，灵敏度低。不同厂家生产的试剂盒检测结果偏差较大，缺乏统一标准，导致检测结果偏差较大，参考价值较低。
发明内容
本发明的目的是解决现有唾液中孕酮和睾酮检测方法技术中存在的部分问题，提供一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法及试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中孕酮和睾酮，利用高效液相色谱将孕酮和睾酮与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算孕酮和睾酮的含量；
(1)具体色谱条件为：
流动相A：体积比为0.05％的甲酸水；
流动相B：甲醇，纯度为色谱纯；
色谱柱型号：PhenomenexKinetex-C18，50×2.1mm，2.6μm；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为20μl；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5000V；碰撞气为6；气帘气为10；离子源气流GS1为50，GS2为50；离子源温度为500℃；同时监测目标物孕酮m/z315.3→109.1、睾酮m/z289.3→109.1、同位素内标d9-孕酮m/z324.4→100.1；孕酮和睾酮及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2；
表2孕酮和睾酮及内标的质谱参数
优选地，所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入50ng/ml内标溶液10μl，混匀后，加1ml萃取液，涡旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800μl；氮气吹干，以10％甲醇水100μl进行复溶，涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测。
优选地，所述内标溶液配制：准确称取孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解后配制1mg/ml的储备液；孕酮标准溶液储备液10μl与睾酮标准溶液储备液10μl混合，再以纯甲醇稀释至400μl，得25μg/ml的工作液。
优选地，所述萃取液为乙酸乙酯。
优选地，所述氮气吹干温度为40～50℃。
本发明的另一方面通过以下方案实现：
高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.05％V/V的甲酸水；
洗脱液B：甲醇，色谱纯；
(2)标准品母液：孕酮的甲醇溶液，睾酮的甲醇溶液；
配制：分别精确称取10mg孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液；
(3)内标液：d9-孕酮的甲醇溶液；
配制：精确称取10mgd9-孕酮的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液；用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：乙酸乙酯；
(6)质控品：孕酮和睾酮的空白唾液基质溶液，分低中高浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度分别为：50pg/ml、100pg/ml、250pg/ml；
孕酮标准溶液储备液10μl与睾酮标准溶液储备液10μl混合，再以纯甲醇稀释至400μl，得25μg/ml的溶液A，取100μl溶液A甲醇稀释至100ml得25ng/ml的溶液B；
QC(H)：取100μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；
QC(M)：取40μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；
QC(L)：取20μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；
(7)复溶液：体积比为10％甲醇。
本发明的有益效果：通过对前处理方法的改良，前处理更加简单、快捷，可实现批量处理；同时ESI利用离子蒸发，液相离子化，适用于高分子量测定，大大提高了检测信号的灵敏度；方法学考察结果显示，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定量分析要求；本发明方法具有准确度高、重现性好，稳定、可靠的特点，可用于唾液中孕酮和睾酮的检测。与酶联免疫法相比，不仅提高灵敏度，操作简单，对操作环境要求不是很高，一般实验室均可完成，而且节约分析成本，所需分析时间较短，利于开展大批量样本检测，适于进行人群中相关疾病的筛查；检测孕酮的含量，对孕激素治疗监测、评价妊娠早期状态、诊断黄体功能状态方面具有重要指导作用。检测唾液中睾酮含量，可以评估男性激素周期波动；同时检测唾液中孕酮及睾酮的含量，可以进行女性更年期激素水平评估、女性激素周期波动评估。应用本发明试剂盒检测唾液中孕酮和睾酮，前处理过程操作简单，灵敏度高、特异性强、准确性好。
附图说明
图1为孕酮和睾酮及内标d9-孕酮标准品的总离子流色谱图；
图2为唾液中孕酮和睾酮及内标d9-孕酮的总离子流色谱图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经预处理的唾液中孕酮和睾酮，利用高效液相色谱将孕酮和睾酮与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算孕酮和睾酮的含量；
(1)具体色谱条件为：
流动相A：体积比为0.05％的甲酸水；
流动相B：甲醇，纯度为色谱纯；
色谱柱型号：PhenomenexKinetex-C18，50×2.1mm，2.6μm；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为20μl；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5000V；碰撞气为6；气帘气为10；离子源气流GS1为50，GS2为50；离子源温度为500℃；同时监测目标物孕酮m/z315.3→109.1、睾酮m/z289.3→109.1、同位素内标d9-孕酮m/z324.4→100.1；孕酮和睾酮及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2；
表2孕酮和睾酮及内标的质谱参数
所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入50ng/ml内标溶液10μl，混匀后，加1ml萃取液，涡旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800μl；氮气吹干，以10％甲醇水100μl进行复溶，涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测。
所述内标溶液配制：称取孕酮同位素内标，甲醇溶解，配制1mg/ml的储备液；以甲醇稀释至50ng/ml即得实验所需内标溶液。所述萃取液为乙酸乙酯。所述氮气吹干温度为40～50℃。
高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.05％的甲酸水；
洗脱液B：甲醇，色谱纯；
(2)标准品母液：孕酮的甲醇溶液，睾酮的甲醇溶液；
配制：分别精确称取10mg孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液；
(3)内标液：d9-孕酮的甲醇溶液；
配制：精确称取10mgd9-孕酮的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液；用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：乙酸乙酯；
(6)质控品：孕酮和睾酮的空白唾液基质溶液，分低中高浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度分别为：50pg/ml、100pg/ml、250pg/ml；
孕酮标准溶液储备液10μl与睾酮标准溶液储备液10μl混合，再以纯甲醇稀释至400μl，得25μg/ml的溶液A，取100μl溶液A甲醇稀释至100ml得25ng/ml的溶液B；
QC(H)：取100μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；
QC(M)：取40μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；
QC(L)：取20μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；
(7)复溶液：体积比为10％甲醇。
所述试剂盒的组分如下表所示：
具体实施例
1、仪器及参数设置：
高效液相色谱仪(Agilent1100)，色谱柱(50×2.1mm，2.6μm；Kinetex菲罗门)，流动相为0.05％甲酸水和甲醇，柱温为40℃，流速为200μl·min-1，分析时间为6.5min，液相条件为梯度洗脱(0～1min，20％甲醇；1～3.4min，20％～80％甲醇；3.4～5.9min，80％甲醇；5.9～6.1min，80％～20％甲醇；6.1～6.5min，20％甲醇)。
质谱仪(4000Qtrap，AB公司)，使用ESI源，在正离子条件下，检测模式为MRM。
检测离子对(m/z)：孕酮：315.3→109.1；睾酮：289.3→109.1；内标(d9-孕酮)：324.4→100.1。气帘气(CUR)为10、碰撞气(CAD)为6、离子喷雾电压(IS)为5000V，温度为500℃，GS1为50，GS2为50。
孕酮和睾酮及内标的质谱参数
2、唾液样本处理
取唾液样本500μl，加内标溶液10μl，混合60s，加1ml萃取液(乙酸乙酯)，涡旋混合5min，以13000转/分离心10min，取上清800μl；氮气吹干(40～50℃)，100μl10％甲醇水复溶，涡旋3min；以13000转/分离心3min，进样。
内标配制：称取孕酮同位素内标，甲醇溶解，配制1mg/ml的储备液。以甲醇稀释至50ng/ml即得实验所需内标溶液。
标准品配制：准确称取孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解后配制1mg/ml的储备液。孕酮标准溶液储备液10μl与睾酮标准溶液储备液10μl混合，再以纯甲醇稀释至400μl，得25μg/ml的工作液，依次稀释至所需浓度。
方法验证
1.总离子流色谱图：孕酮和睾酮及内标d9-孕酮的标准品及唾液样品中的峰形对称，基本没有杂质干扰，表明该条件能够用于孕酮和睾酮的定量分析。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准品与内标的浓度比为X轴，标准品与内标峰面积比为Y轴，建立曲线，计算唾液中孕酮和睾酮的浓度。孕酮和睾酮在31.25～500pg/ml范围内线性较好，相关系数在0.99以上，满足定量要求。
3.精密度试验：取500μl混合唾液基质，分别加入低、中、高浓度的标准品溶液，使其理论浓度为50、100、250pg/ml，每个浓度平行做6个样本，经前处理后检测，计算得精密度结果。通过实验发现低、中、高浓度RSD％在4.0％～11.7％范围内，精密度符合检测要求。结果如表3所示。
表3唾液孕酮与睾酮的精密度(n＝6)
4.回收率试验：取500μl混合唾液基质，分别加入0、低、中、高浓度的标准品溶液，使其理论浓度0、50、100、250pg/ml，每个浓度平行做6个样本，重复操作3次。结果显示，唾液孕酮和睾酮的加标回收率均在87.8％～119％之间，3次重复试验的RSD在7.9％～12.2％范围内。
表4孕酮在唾液基质中加标回收率(n＝6)
现存检测方法(酶联免疫法、电化学发光免疫法)受到多种客观条件的影响，如温度、pH值、离子强度、试剂免疫活性等，不同厂家生产的试剂盒检测结果偏差较大。免疫法不可避免唾液基质中结构相似物质的干扰，灵敏度低，且一次只能检测一种激素，耗时费力。单独的高效液相色谱法在分析时，使用紫外检测器，能够检测的浓度范围有限，检出限较高，无法实现低浓度准确定量，对唾液中低浓度的褪黑素无法完成检测。高效液相串联质谱技术将液相的分离功能与质谱的检测功能高效结合。唾液样本在分析之前，采用液液萃取的方式进行净化处理，该样本处理方法简单，使用有机试剂少，提取效率高。建立高效液相色谱条件时，使用梯度洗脱的方式，被分析物在较短时间内出峰，节约分析时间；建立质谱条件时，选择适宜的离子对，采用MRM(多反应监测)采集模式，提高检测灵敏度。样本在检测时，首先经过色谱柱使被测物与杂质分离，之后进入质谱经过分析后被检测器识别，以色谱图的形式呈现在工作站中。数据分析时，采用内标法，减少误差的产生。通过分析色谱图，对峰面积进行积分，代入标准曲线准确计算被测样本的浓度。
总之，该法能够同时检测唾液中孕酮和睾酮的含量，为进一步研究两者在人体内的变化情况提供灵敏、可靠的检测方法，对长期内分泌研究也有重要意义。检测孕酮的含量，对孕激素治疗监测、评价妊娠早期状态、诊断黄体功能状态方面具有重要指导作用。检测唾液中睾酮含量，可以评估男性激素周期波动；同时检测唾液中孕酮及睾酮的含量，可以进行女性更年期激素水平评估、女性激素周期波动评估。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (6)
1.高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经预处理的唾液中孕酮和睾酮，利用高效液相色谱将孕酮和睾酮与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算孕酮和睾酮的含量；
(1)具体色谱条件为：
流动相A：体积比为0.05％的甲酸水；
流动相B：甲醇，纯度为色谱纯；
色谱柱型号：PhenomenexKinetex-C18，50×2.1mm，2.6μm；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为20μl；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5000V；碰撞气为6；气帘气为10；离子源气流GS1为50，GS2为50；离子源温度为500℃；同时监测目标物孕酮m/z315.3→109.1、睾酮m/z289.3→109.1、同位素内标d9-孕酮m/z324.4→100.1；孕酮和睾酮及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2；
表2孕酮和睾酮及内标的质谱参数
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入50ng/ml内标溶液10μl，混匀后，加1ml萃取液，涡旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800μl；氮气吹干，以100μl10％甲醇水复溶，涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述内标溶液配制：称取孕酮同位素内标，甲醇溶解；配制1mg/ml的储备液；以甲醇稀释至50ng/ml即得实验所需内标溶液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述萃取液为乙酸乙酯。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮气吹干温度为40～50℃。
6.高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.05％V/V甲酸水；
洗脱液B：甲醇，色谱纯；
(2)标准品母液：孕酮的甲醇溶液，睾酮的甲醇溶液；
配制：分别精确称取10mg孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液；
(3)内标液：d9-孕酮的甲醇溶液；
配制：精确称取10mgd9-孕酮的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液；用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：乙酸乙酯；
(6)质控品：孕酮和睾酮的空白唾液基质溶液，分低中高浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度分别为：50pg/ml、100pg/ml、250pg/ml；
孕酮标准溶液储备液10μl与睾酮标准溶液储备液10μl混合，再以纯甲醇稀释至400μl，得25μg/ml的溶液A，取100μl溶液A甲醇稀释至100ml得25ng/ml的溶液B；
QC(H)：取100μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；
QC(M)：取40μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；
QC(L)：取20μl溶液B，用稀释液1定容至10ml；
(7)复溶液：体积比为10％甲醇。
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